本發(fā)明涉及細(xì)胞工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說，是一種永生化特絡(luò)細(xì)胞系的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
：目前研究特絡(luò)細(xì)胞的功能是使用不同種屬動物(如小鼠、大鼠、豬等)的不同器官(肺臟、腎臟、心臟等)原代提取的特絡(luò)細(xì)胞，提取過程耗時且每次提取都需要進(jìn)行分離純化和鑒定，需要投入大量的人力物力。由于多次分離和提取原代細(xì)胞是由于不同的人員進(jìn)行，因此難以保證提取細(xì)胞的純度和穩(wěn)定性。在正常情況下，100％純化的原代特絡(luò)細(xì)胞低密度培養(yǎng)時，一周內(nèi)全部死亡。中國《中華移植雜質(zhì)》2016年5月刊登的論文《大鼠腎臟皮質(zhì)中分離出新型間質(zhì)細(xì)胞-特絡(luò)細(xì)胞》，分離純化及原代培養(yǎng)tc：在無菌條件下獲取大鼠腎臟皮質(zhì)，使用無菌剪刀將組織剪成約1mm×1mm的塊狀，pbs清洗3次，消化液為使用不含鈣離子及鎂離子的pbs配置的10mg/ml二型膠原酶及2000u/mldna酶，將組織置于37℃振蕩器中消化4h，收集的細(xì)胞玄燁1500轉(zhuǎn)離心5min，移至40μm細(xì)胞過濾器中過濾，細(xì)胞接種于10％胎牛血清的dmem/f12培養(yǎng)基，置于37℃、5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，使用顯微切割的方法去除雜細(xì)胞，具體方法如下：tc成簇生長后，于相差顯微鏡下利用細(xì)胞刮刀刮除雜細(xì)胞，棄去上層雜細(xì)胞懸浮液pbs沖洗，重復(fù)直至效果滿意，而后行細(xì)胞傳代。中國專利2016101653339公開了一種永生化的犬脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞系及其構(gòu)建方法，以犬脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)染攜帶sv40大t抗原的慢病毒載體，將tag基因整合入犬脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞基因組中，經(jīng)過連續(xù)傳代篩選得到表達(dá)sv40大t抗原基因且具有多向分化潛能的細(xì)胞系。然而現(xiàn)有技術(shù)中，關(guān)于本發(fā)明永生化特絡(luò)細(xì)胞系的構(gòu)建方法，目前還未見報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種永生化特絡(luò)細(xì)胞系的構(gòu)建方法。本發(fā)明的第二個目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供由如上所述方法構(gòu)建獲得的永生化特絡(luò)細(xì)胞系。為實(shí)現(xiàn)上述第一個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種永生化特絡(luò)細(xì)胞系的構(gòu)建方法，包括如下步驟：(1)將剪碎的小鼠肺臟組織塊于二型膠原酶中消化，過濾，離心，收集細(xì)胞沉淀，在含有10％fbs的dmem/f12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待成纖維細(xì)胞貼壁后，將上清轉(zhuǎn)移至另一培養(yǎng)皿，培養(yǎng)12小時后換液，繼續(xù)培養(yǎng)3-5天；(2)用微量槍頭作為細(xì)胞刮，刮除成纖維細(xì)胞，反復(fù)多次刮除后，進(jìn)行特異性結(jié)構(gòu)telopode的觀察和免疫標(biāo)記鑒定特絡(luò)細(xì)胞；(3)以特絡(luò)細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，用含有sv-40-大t抗原的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染宿主細(xì)胞，經(jīng)過傳代、篩選、鑒定。進(jìn)一步，所述含有sv-40-大t抗原的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體為ef1a-sv40-ires-puro逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。進(jìn)一步，所述步驟3包括：(1)設(shè)計(jì)合成引物，以含有sv40大t抗原基因的質(zhì)粒為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，通過兩端所含酶切位點(diǎn)將其連入酶切后的過表達(dá)慢病毒載體上；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入制備好的細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞，對長出的單克隆菌落先進(jìn)行pcr鑒定，pcr鑒定陽性菌落進(jìn)行測序鑒定，比對正確的克隆即為構(gòu)建成功的目的基因過表達(dá)慢病毒載體；oligo名稱寡聚單鏈dna序列5’to3’sv40-fccggaattcatggataaagttttaaacagagaggaatcsv40-rgctctagattacaagtcctcttcagaaatgag(2)用構(gòu)建的慢病毒表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染慢病毒包裝細(xì)胞，包被病毒，收集病毒原液，超濾濃縮，并測定滴度；(3)用含8μg/mlpolybrene的新鮮培養(yǎng)基稀釋病毒原液，加入到靶細(xì)胞中，6小時后換液，向細(xì)胞中加入2μg/mlpuromycin，37℃，5％co2，常規(guī)培養(yǎng)24h，篩選性能穩(wěn)定的永生化特絡(luò)細(xì)胞系。為實(shí)現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：由如上所述方法構(gòu)建的永生化特絡(luò)細(xì)胞系。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：1、本發(fā)明的永生化特絡(luò)細(xì)胞系培養(yǎng)至50代仍然保持較為穩(wěn)定的狀態(tài)，解決了現(xiàn)有技術(shù)多次分離和提取無法保證特絡(luò)細(xì)胞純度和穩(wěn)定性的問題；并避免了多次分離和提取原代、每次分離和提取都需要反復(fù)純化及多種方法鑒定所耗費(fèi)的大量人力和資源。2、cell-iq細(xì)胞實(shí)時成像系統(tǒng)觀察純化原代特絡(luò)細(xì)胞和本發(fā)明永生化特絡(luò)細(xì)胞系的生長情況，結(jié)果顯示：純化的原代特絡(luò)細(xì)胞貼壁后7天細(xì)胞全部死亡，本發(fā)明的永生化特絡(luò)細(xì)胞系第50代貼壁后24h，36h，48h，72h，96h生長良好。3、比較特絡(luò)細(xì)胞系和特絡(luò)細(xì)胞-sv40細(xì)胞系的細(xì)胞周期。特絡(luò)細(xì)胞-sv40細(xì)胞系sub-g1期明顯降低，表明其凋亡率降低，s期和g2期明顯升高，本發(fā)明的永生化特絡(luò)細(xì)胞系可能通過加速s期和g2期進(jìn)程導(dǎo)致細(xì)胞增殖增加。4、免疫熒光法在激光共聚焦顯微鏡下觀察特絡(luò)細(xì)胞系第50代細(xì)胞的相關(guān)免疫標(biāo)記物vimentin和cd34的表達(dá)，fitc(綠色)標(biāo)記顯示cd34-的表達(dá)，keyfluor594(紅色)標(biāo)記顯示了vimentin的表達(dá)。附圖說明附圖1為光鏡觀察特絡(luò)細(xì)胞特征性結(jié)構(gòu)telopode(↑)(200×)。附圖2為免疫熒光法在激光共聚焦顯微鏡下鑒定特絡(luò)細(xì)胞相關(guān)的免疫標(biāo)記物vimentin和cd34有表達(dá)。其中a.dapi(藍(lán)色)標(biāo)記細(xì)胞核；b.fitc(綠色)標(biāo)記顯示了cd34-的表達(dá)；c.keyfluor594(紅色)標(biāo)記顯示了vimentin的表達(dá)；d.dapi(藍(lán)色)標(biāo)記細(xì)胞核，fitc(綠色)標(biāo)記顯示cd34-的表達(dá)，keyfluor594(紅色)標(biāo)記顯示了vimentin的表達(dá)。附圖3為電鏡觀察特絡(luò)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)?？梢娒黠@的線粒體(↑)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)(▲)。附圖4為免疫電鏡鑒定特絡(luò)細(xì)胞相關(guān)的免疫標(biāo)記物vimentin、cd34、pdgf和ckit的表達(dá)。a.免疫電鏡下，特絡(luò)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。b、c、d.免疫電鏡下特絡(luò)細(xì)胞相關(guān)的免疫標(biāo)記物vimentin、cd34-、pdgf和ckit的表達(dá)。免疫標(biāo)志物和對應(yīng)的免疫膠體金顆粒大小分別為vimentin-10nm；cd34-18nm；pdgf-25nm；ckit-40nm。附圖5為phy-801載體圖譜。附圖6為瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。提取原代特絡(luò)細(xì)胞組(細(xì)胞不轉(zhuǎn)染)、nc組(空載體lenti轉(zhuǎn)染對照組)和特絡(luò)細(xì)胞系組(重組慢病毒表達(dá)載體lenti-sv40轉(zhuǎn)染組)的mrna，逆轉(zhuǎn)錄后形成cdna，以含有sv40大t抗原基因的質(zhì)粒為模板，t1和t2為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增。擴(kuò)增后產(chǎn)物電泳觀察結(jié)果并拍照，2154bp處出現(xiàn)條帶，初步確定為sv40大t抗原基因的擴(kuò)增產(chǎn)物。附圖7為cell-iq細(xì)胞實(shí)時成像系統(tǒng)觀察和記錄純化原代特絡(luò)細(xì)胞貼壁后24h至96h的生長情況。附圖8為cell-iq細(xì)胞實(shí)時成像系統(tǒng)觀察和記錄本發(fā)明特絡(luò)細(xì)胞系貼壁后24h至96h的生長情況。附圖9為光鏡觀察本發(fā)明第3代、第10代、第30代和第50代特絡(luò)細(xì)胞系特征性結(jié)構(gòu)telopode(↑)(200×)。附圖10為免疫熒光法在激光共聚焦顯微鏡下鑒定本發(fā)明特絡(luò)細(xì)胞系第3代、第10代、第30代和第50代的相關(guān)免疫標(biāo)記物vimentin和cd34的表達(dá)。附圖11為免疫電鏡鑒定本發(fā)明特絡(luò)細(xì)胞系第5代、第10代、第30代和第50代細(xì)胞的相關(guān)免疫標(biāo)記物vimentin、cd34、pdgf和ckit的表達(dá)。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明記載的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實(shí)施例1本發(fā)明永生化特絡(luò)細(xì)胞系的構(gòu)建(1)提取原代特絡(luò)細(xì)胞時采取分階段貼壁法：將c57小鼠肺臟分離，無菌條件下在生理鹽水中剪成1m3的組織塊，置于2mg/ml二型膠原酶中37度消化30分鐘，70微米孔徑濾網(wǎng)過濾后，1500rm離心5分鐘，收集細(xì)胞沉淀，在含有10％fbs的dmem/f12培養(yǎng)基中培養(yǎng)30分鐘，待成纖維細(xì)胞貼壁后，將上清轉(zhuǎn)移至另一培養(yǎng)皿，培養(yǎng)12小時后換液，繼續(xù)培養(yǎng)3-5天后顯微鏡下觀察特絡(luò)細(xì)胞。(2)多次純化以保證純度：用微量槍頭作為細(xì)胞刮，以該細(xì)胞的特征性結(jié)構(gòu)為標(biāo)準(zhǔn)在顯微鏡下刮除其他細(xì)胞。多次純化后得到特絡(luò)細(xì)胞，既避免了流式分選過程對脆弱原代細(xì)胞的損傷，也避免了無限稀釋法挑取單克隆造成該原代細(xì)胞死亡。(3)根據(jù)形態(tài)和免疫標(biāo)記鑒定：反復(fù)多次刮除后，進(jìn)行特異性結(jié)構(gòu)telopode的觀察(圖1)和免疫標(biāo)記鑒定特絡(luò)細(xì)胞。共聚焦顯微鏡下觀察到vimentin和cd34表達(dá)陽性(圖2)。電鏡下觀察特絡(luò)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)(圖3)。免疫膠體金顆粒染色后，電鏡下觀察到特絡(luò)細(xì)胞vimentin、cd34、ckit以及pdgf表達(dá)陽性(圖4)。(4)特絡(luò)細(xì)胞在顯微鏡下運(yùn)動活躍，除了特異性的telopode這一結(jié)構(gòu)，特絡(luò)細(xì)胞還顯示出多形態(tài)性。微絲特異性染色顯示出特絡(luò)細(xì)胞中豐富的微絲結(jié)構(gòu)，支持了其運(yùn)動活躍的特性。實(shí)施例2sv40穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建階段1：過表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建首先設(shè)計(jì)合成引物，擴(kuò)增目的片段，再通過其兩端所含酶切位點(diǎn)將其連入酶切后的過表達(dá)慢病毒載體上；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入制備好的細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞，對長出的單克隆菌落先進(jìn)行pcr鑒定，pcr鑒定陽性菌落進(jìn)行測序鑒定，比對正確的克隆即為構(gòu)建成功的目的基因過表達(dá)慢病毒載體。一、實(shí)驗(yàn)材料和方法(一)材料1.試劑試劑名稱試劑來源pcr用試劑primer(r&f)生工生物工程(上海)有限公司taqpolymerasenebqiagenplasmid大抽kitqiagenbsasigmalborsoborsocalphaaesercacl2sigmat4dnaligasefermentast4dnaligasebufferfermentasmgso4sigma瓊脂糖bio-raddnaladderfermentaspositiveclone測序invitrogen內(nèi)切酶1fermentas內(nèi)切酶2fermentas2.儀器(二)方法1.設(shè)計(jì)并合成引物1)根據(jù)基因名在ncbi中找到相應(yīng)的目的基因序列。2)確定所用載體為。載體名稱為phy-801，載體原件為ef1a-sv40-ires-puro。載體圖譜如圖5所示。3)用序列分析軟件找出目的序列中存在的限制性內(nèi)切酶，并對應(yīng)使用的載體確定引物兩端的酶切位點(diǎn)ecori和xbai。4)利用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，并在5’端加入確定好的酶切位點(diǎn)。oligo名稱寡聚單鏈dna序列5’to3’sv40-fccggaattcatggataaagttttaaacagagaggaatcsv40-rgctctagattacaagtcctcttcagaaatgag5)將設(shè)計(jì)好的引物序列送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行合成。2.載體的雙酶切1)將含載體質(zhì)粒的菌液過夜培養(yǎng)，并取新鮮菌液3-5ml提取質(zhì)粒。具體方法參考qiagen質(zhì)粒小抽說明書。2)取1μg新鮮質(zhì)粒，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切。酶切體系如下：于37℃酶切約3h。3)將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后，進(jìn)行膠回收，步驟如下：在紫外燈下，切下包含目的片段的膠條。用天平稱量總重量并減去空管的重量算出凝膠的重量，按100mg＝100μl來計(jì)算凝膠的體積，并加入3倍凝膠體積的qgbuffer置于50℃水浴鍋內(nèi)將凝膠徹底融化。期間適當(dāng)搖晃ep管，加快凝膠的溶解。4)等凝膠徹底融化后，加入與凝膠等體積的異丙醇并混合均勻。5)將上述液體全部轉(zhuǎn)移到濾柱內(nèi)，13000rpm離心30s。(可重復(fù)一次)然后棄掉管內(nèi)液體，向柱內(nèi)加入750μl的pebuffer。離心1min.。棄掉管內(nèi)液體，再次空離2min。換一個新的1.5ml的ep管，向柱子內(nèi)加入20μl的ddh2o，離心1min。為了提高回收率，可將溶解的dna再次加入柱子內(nèi)離心一分鐘。棄掉柱子，即為回收的載體片段，并測定濃度。3.目的片段的擴(kuò)增及酶切(1)將合成的引物稀釋成終濃度為10μmol/l的儲藏液。(2)利用稀釋的引物及模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增。體系如下：將上述材料加入薄壁管內(nèi)混勻并點(diǎn)離后放入pcr儀內(nèi)，選擇好合適的退火溫度和延伸溫度，即可開始pcr擴(kuò)增。(3)pcr結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并回收目的基因。方法同上。(4)將回收后的目的基因進(jìn)行雙酶切，酶切體系如下：于37℃酶切約5h或者過夜。(5)將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳并回收目的片段，方法同上。4.過表達(dá)載體與目的片段的連接(1)測定回收載體和目的片段的濃度，并按載體：目的片段＝1:7的摩爾比例計(jì)算載體和目的片段所需的體積比。(2)過表達(dá)載體與目的片段的連接，連接體系如下：于37℃連接30min后，立即置于5℃冰水浴冷卻。5.轉(zhuǎn)化(1)將感受態(tài)細(xì)胞置于冰上(4℃)待其自然解凍后，取10μl連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細(xì)胞中于冰上(4℃)放置30min。(2)之后于42℃水浴中熱擊90s。然后迅速置于冰上(4℃)放置2-3min。(3)加入500μl不含抗生素的soc培養(yǎng)基于37℃，225rpm振蕩培養(yǎng)45min。(4)3000rpm離心2min，棄掉900μl的上清液，將管底的菌液吹打散開，加入到含有載體上對應(yīng)抗性(氨芐或卡那等)的培養(yǎng)平板中，用滅菌的涂布器涂勻(涂布器的溫度不能太高，以免燙死菌體)，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng)。6.pcr鑒定(1)挑取若干個單菌落，進(jìn)行小量搖菌培養(yǎng)。(2)進(jìn)行菌液pcr初步鑒定，方法同上步驟3，只將模板替換成新鮮菌液2-3μl。(3)將初步鑒定為陽性的樣品，每個克隆挑選兩個送測序公司進(jìn)行測序鑒定。二、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)階段2：慢病毒的包裝及測定用構(gòu)建的慢病毒表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒(packagingmix)共轉(zhuǎn)染慢病毒包裝細(xì)胞，包被病毒，收集病毒原液，超濾濃縮，并測定滴度。實(shí)驗(yàn)流程：抽提高純度、無內(nèi)毒素的過表達(dá)慢病毒載體及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒，使用transgenereagent將構(gòu)建好的過表達(dá)慢病毒載體及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)慢病毒包裝細(xì)胞，轉(zhuǎn)染12h后加enhancingbuffer，接著4h后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，對其濃縮后得到高滴度的慢病毒濃縮液。一、實(shí)驗(yàn)材料和方法1.細(xì)胞株慢病毒的包裝細(xì)胞：貼壁依賴型成上皮樣細(xì)胞，生長培養(yǎng)基為dmem(含10％fbs)。貼壁細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)生長增殖形成單層細(xì)胞。2.菌株大腸桿菌菌株dh5α。用于擴(kuò)增慢病毒載體和輔助包裝載體質(zhì)粒。3.慢病毒包裝系統(tǒng)將構(gòu)建成功的慢病毒重組質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒采用qiagen公司的質(zhì)粒抽提試劑盒提取。所得的質(zhì)粒dna溶于無菌的te中，以紫外光吸收法測定其濃度及純度，保證所提質(zhì)粒dna的a260/a280在1.8～2.0之間。4.試劑試劑名稱試劑來源臺盼蘭上海生工生物工程有限公司胎牛血清gibcodmsosigmadmemgibco胰酶gibcopolyethylenimine,liner,mw-25000cat#239665.儀器儀器名稱儀器來源熒光顯微鏡奧林巴斯co2培養(yǎng)箱thermo生物安全柜thermo離心超濾裝置millipore(二)方法1.慢病毒包裝1)細(xì)胞分盤轉(zhuǎn)染前一天，將已經(jīng)長好的細(xì)胞以合適的比例傳代到10cm培養(yǎng)皿中，當(dāng)細(xì)胞長到80％～90％時準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。2)轉(zhuǎn)染前換液轉(zhuǎn)染前1～2h將需要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞換新鮮的培養(yǎng)基，10ml/10cm皿。3)轉(zhuǎn)染取無菌的1.5mlep管，轉(zhuǎn)染體系按下表：混勻后，室溫放置15min-20min后，均勻滴加到提前換過液的培養(yǎng)皿中，后置于co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4)加enhancingbuffer轉(zhuǎn)染12h后，均勻滴加100×enhancingbuffer促進(jìn)轉(zhuǎn)染。5)換液轉(zhuǎn)染18～20h后，小心吸掉細(xì)胞培養(yǎng)液棄于盛有消毒液的廢液杯中，然后加15ml新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)基(含2％血清的dmem)繼續(xù)培養(yǎng)。6)病毒收集換液48h后，吸取細(xì)胞上清液于50ml離心管，4℃，4500g離心5min，上清液用0.45μm濾器過濾后轉(zhuǎn)移到新的離心管中，最后將濾液分批轉(zhuǎn)移到centrifugalfilterdevices中，4℃，4500g，離心10min，棄下層的液體于盛有消毒液的廢液杯中，最后一次4℃，4500g，離心20min，此時可見濾器上層中的液體即為病毒濃縮液。7)病毒分裝與保存將病毒以50μl分裝，保存于-80℃。2.滴度測定1)rt-pcr分析整合的拷貝數(shù)病毒檢測分別取0.1μl質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品基因組dna，另留1個孔加入無菌水做為無模板對照(no-templatecontrol)。每個樣品重復(fù)1次。基因組檢測分別取0.1μl基因組標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品基因組dna，另留1個孔加入無菌水做為無模板對照(no-templatecontrol)。每個樣品重復(fù)1次。rt-pcr循環(huán)條件設(shè)定為：95℃5min，然后是95℃15s，60℃1min的40個循環(huán)。2)數(shù)據(jù)分析測得的dna樣品中整合的慢病毒載體拷貝數(shù)用基因組數(shù)加以標(biāo)定，得到每基因組整合的病毒拷貝數(shù)。滴度(integrationunitsperml，iuml-1)的計(jì)算公式如下：iuml-1＝(c×n×d×1000)/v。其中：c＝平均每基因組整合的病毒拷貝數(shù)；n＝感染時細(xì)胞的數(shù)目；d＝病毒載體的稀釋倍數(shù)＝10；v＝加入的稀釋病毒的體積數(shù)(0.5μl，5μl，50μl和100μl)。滴度跨度為:107-109。二、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)sv40基因過表達(dá)慢病毒滴度測定結(jié)果為：tuml-1＝(8.83×1.9*105×10×1000)/50＝3.3554*108階段3：穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建rt-pcr驗(yàn)證其表達(dá)效果1.過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建將經(jīng)鑒定的純化的原代特絡(luò)細(xì)胞分為3組：原代特絡(luò)細(xì)胞組(細(xì)胞不轉(zhuǎn)染)、nc組(空載體lenti轉(zhuǎn)染對照組)和特絡(luò)細(xì)胞系組(重組慢病毒表達(dá)載體lenti-sv40轉(zhuǎn)染組)。以合適的比例(聚合度約為30％左右)接種靶細(xì)胞于6孔板中。24小時后，感染前，病毒原液從-80℃冰箱取出后冰浴融化，用含感染增強(qiáng)劑8μg/mlpolybrene的新鮮培養(yǎng)基稀釋病毒原液，吸除6孔板里舊培養(yǎng)基，加含有慢病毒稀釋液到靶細(xì)胞中，6小時后換液。此慢病毒載體帶有puromycin抗性，向細(xì)胞中加入2μg/mlpuromycin，37℃，5％co2，常規(guī)培養(yǎng)24h，用以篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株。第四天，細(xì)胞聚合度約為80％-90％時，傳到培養(yǎng)瓶中。第五天，感染效率檢測：收穩(wěn)轉(zhuǎn)株后，通過rt-qpcr驗(yàn)證感染效率。2.目的片段的擴(kuò)增及驗(yàn)證(1)使用qiagen公司的rna提取試劑盒并參照試劑盒操作規(guī)程提取各組細(xì)胞中的rna。首先以oligo六聚體為逆轉(zhuǎn)錄引物，提取各組細(xì)胞中的總rna為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶催化下反轉(zhuǎn)錄出cdna。體系為：rna模板500ng,5×緩沖液2μl,primerscriptrtenzymemixi0.5μl,10μmol/l50μmoligo六聚體0.5μl,100μmrandom6mers0.5μl,depc水補(bǔ)足10μl。37℃15min。(2)以合成的cdna為模版，sv40大t抗原基因上下游引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，引物序列為sv40-f:aacctatggaactgatgaatg；sv40-r:ggaggagtagaatgttgaga。擴(kuò)增后產(chǎn)物電泳觀察結(jié)果，重組慢病毒表達(dá)載體lenti-sv40轉(zhuǎn)染組2154bp處出現(xiàn)條帶(圖6)，初步確定為sv40大t抗原基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，其他兩組未出現(xiàn)條帶。實(shí)施例3本發(fā)明的使用方法1、無菌操作。操作時用的培養(yǎng)液可加適量的青鏈霉素。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，無菌室及無菌操作臺以紫外燈照射30-60分鐘滅菌，以70％ethanol擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘后，才開始實(shí)驗(yàn)操作。每次操作只處理一株細(xì)胞株，且即使培養(yǎng)基相同也不可使用同一瓶培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。實(shí)驗(yàn)完畢后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺，以70％ethanol擦拭無菌操作抬面。工作人員應(yīng)注意自身安全，實(shí)驗(yàn)時須穿戴實(shí)驗(yàn)衣及手套。2、本細(xì)胞系使用含有10％fbs的dmem+f12培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞長至85％-90％密度時傳代，傳代時細(xì)胞用含有edta的胰酶進(jìn)行消化，1：2傳代。實(shí)施例41、永生化：①用cell-iq細(xì)胞實(shí)時成像系統(tǒng)觀察和記錄了純化后的原代特絡(luò)細(xì)胞貼壁后24h至一周的生長情況。如圖7所示，cell-iq細(xì)胞實(shí)時成像系統(tǒng)觀察和記錄了純化原代特絡(luò)細(xì)胞貼壁后24h至96h的生長情況。a.純化原代特絡(luò)細(xì)胞貼壁后24h；b.純化原代特絡(luò)細(xì)胞貼壁后36h，部分細(xì)胞發(fā)生分裂，并運(yùn)動(↑)；c、d.純化原代特絡(luò)細(xì)胞貼壁后48h和72h，部分細(xì)胞死亡e.純化原代特絡(luò)細(xì)胞貼壁后7天，細(xì)胞全部死亡。②對第2代、第10代、第20代、第30代以及第50代永生化特絡(luò)細(xì)胞貼壁后24h至96h的生長情況也進(jìn)行了觀察和記錄。如圖8所示，cell-iq細(xì)胞實(shí)時成像系統(tǒng)觀察和記錄了特絡(luò)細(xì)胞系貼壁后24h至96h的生長情況。a-e.特絡(luò)細(xì)胞系第2代貼壁后24h，36h，48h，72h，96h；f-j.特絡(luò)細(xì)胞系第5代貼壁后24h，36h，48h，72h，96h；k-o.特絡(luò)細(xì)胞系第10代貼壁后24h，36h，48h，72h，96h；p-t.特絡(luò)細(xì)胞系第30代貼壁后24h，36h，48h，72h，96h；u-y.特絡(luò)細(xì)胞系第50代貼壁后24h，36h，48h，72h，96h。2、穩(wěn)定性①光鏡觀察第3代、第10代、第30代和第50代特絡(luò)細(xì)胞系特征性結(jié)構(gòu)telopode,并進(jìn)行拍照記錄。如圖9所示，光鏡觀察特絡(luò)細(xì)胞特征性結(jié)構(gòu)telopode，a-d分別為第3代、第10代、第30代和第50代特絡(luò)細(xì)胞系光鏡下的形態(tài)和特征性結(jié)構(gòu)telopode(↑)。②用免疫熒光法在激光共聚焦顯微鏡下觀察特絡(luò)細(xì)胞系第5代、第10代、第30代和第50代細(xì)胞的相關(guān)免疫標(biāo)記物vimentin和cd34的表達(dá)并進(jìn)行拍照。如圖10所示，免疫熒光法在激光共聚焦顯微鏡下鑒定第3代、第10代、第30代和第50代特絡(luò)細(xì)胞系的相關(guān)免疫標(biāo)記物vimentin和cd34的表達(dá)。a-d.特絡(luò)細(xì)胞系第5代細(xì)胞vimentin和cd34的表達(dá)；e-h.特絡(luò)細(xì)胞系第10代細(xì)胞vimentin和cd34的表達(dá)；i-l.特絡(luò)細(xì)胞系第30代細(xì)胞vimentin和cd34的表達(dá)；m-p.特絡(luò)細(xì)胞系第50代細(xì)胞vimentin和cd34的表達(dá)。a、e、i、m.dapi(藍(lán)色)標(biāo)記細(xì)胞核；b、f、j、n.fitc(綠色)標(biāo)記顯示了cd34-的表達(dá)；c、g、k、o.keyfluor594(紅色)標(biāo)記顯示了vimentin的表達(dá)；d、h、l、p.dapi(藍(lán)色)標(biāo)記細(xì)胞核，fitc(綠色)標(biāo)記顯示cd34-的表達(dá)，keyfluor594(紅色)標(biāo)記顯示了vimentin的表達(dá)。③用免疫電鏡鑒定特絡(luò)細(xì)胞系第5代、第10代、第30代和第50代細(xì)胞的相關(guān)免疫標(biāo)記物vimentin、cd34、pdgf和ckit的表達(dá)。如圖11所示，免疫標(biāo)志物和對應(yīng)的免疫膠體金顆粒大小分別為vimentin-10nm；cd34-18nm；pdgf-25nm；ckit-40nm。a、b.特絡(luò)細(xì)胞系第5代細(xì)胞vimentin、cd34-、pdgf和ckit的表達(dá)；c、d.特絡(luò)細(xì)胞系第10代細(xì)胞vimentin、cd34-、pdgf和ckit的表達(dá)；e、f.特絡(luò)細(xì)胞系第30代細(xì)胞vimentin、cd34-、pdgf和ckit的表達(dá)；g、h.特絡(luò)細(xì)胞系第50代細(xì)胞vimentin、cd34-、pdgf和ckit的表達(dá)。3、比較特絡(luò)細(xì)胞系和特絡(luò)細(xì)胞-sv40細(xì)胞系的細(xì)胞周期。特絡(luò)細(xì)胞-sv40細(xì)胞系sub-g1期明顯降低，表明其凋亡率降低，s期和g2期明顯升高，說明其可能通過加速s期和g2期進(jìn)程導(dǎo)致細(xì)胞增殖增加。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。sequencelisting<110>復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院<120>一種永生化特絡(luò)細(xì)胞系及其構(gòu)建方法<130>/<160>4<170>patentinversion3.3<210>1<211>38<212>dna<213>人工序列<400>1ccggaattcatggataaagttttaaacagagaggaatc38<210>2<211>32<212>dna<213>人工序列<400>2gctctagattacaagtcctcttcagaaatgag32<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列<400>3aacctatggaactgatgaatg21<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4ggaggagtagaatgttgaga20當(dāng)前第1頁12