本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鈉鈣交換體1啟動子聯(lián)合丹參酚酸b誘導(dǎo)ipscs定向心肌分化的方法。

背景技術(shù)：

急性心肌梗死的干細(xì)胞治療仍存在諸多方面的困難，如種子細(xì)胞的選擇問題、心肌壞死范圍廣泛、細(xì)胞移植歸巢效率低下及局部心肌微環(huán)境缺血缺氧等，因此，其臨床應(yīng)用仍然未能得以廣泛的開展。誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(inducedpluripotentstemcells，ipscs)是通過重編程體細(xì)胞獲得的具有與胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcells，ecss)相似的高度增殖和多向分化潛能的一種多能干細(xì)胞，又因其缺少胚胎干細(xì)胞的免疫原性及道德倫理限制，誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞有望成為修復(fù)急性心肌梗死后心肌的具有巨大臨床應(yīng)用前景的種子細(xì)胞。

丹參為唇形科植物丹參salviamiltiorrhizabge.的干燥根及根莖，除了傳統(tǒng)的活血化瘀、養(yǎng)心安神的功效外，還有抗氧化，抑制血小板聚集、促進(jìn)血栓溶解，抗腫瘤，調(diào)節(jié)免疫功能的作用，其在心血管疾病方面的新藥理作用、作用機制和藥代動力學(xué)的研究日趨深入，使其擁有非常廣闊的臨床應(yīng)用前景。丹參酚酸b是其中一種單體成份。

作為心肌分化最早的標(biāo)志物鈉鈣交換體鈉鈣交換體啟動子廣泛分布于心肌細(xì)胞膜上，雙向轉(zhuǎn)運胞膜內(nèi)外na⁺和ca²⁺，參與心肌興奮-收縮耦聯(lián)及胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的維持，鈉鈣交換體1是一個糖基化的具有12個跨膜部分的跨膜蛋白，對維持心肌鈣平衡有重要作用。

目前利用ipscs定向心肌分化的方法很多，本研究旨在提供一種新型的誘導(dǎo)方法，進(jìn)一步推動ipscs的臨床應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種鈉鈣交換體1啟動子聯(lián)合丹參酚酸b誘導(dǎo)ipscs定向心肌分化的方法。

目前尚無有效誘導(dǎo)ipscs心肌定向分化的方法，本研究為了推進(jìn)ipscs的臨床應(yīng)用，旨在提供一種有效安全的誘導(dǎo)心肌分化方法。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種鈉鈣交換體1啟動子聯(lián)合丹參酚酸b誘導(dǎo)ipscs定向心肌分化的方法，包括如下步驟：

通過構(gòu)建ncx1慢病毒顆粒并轉(zhuǎn)染至ipscs，輔以丹參酚酸b聯(lián)合誘導(dǎo)，倒置顯微鏡、細(xì)胞免疫技術(shù)以及westernblots觀察其轉(zhuǎn)染情況、形態(tài)學(xué)以及心肌標(biāo)志物表達(dá)情況。實驗證實鈉鈣交換體1啟動子聯(lián)合丹參酚酸b可有效誘導(dǎo)ipscs定向心肌分化。

優(yōu)選的，所述的丹參酚酸b的濃度為1～100μm；更優(yōu)選為10～100μm。

優(yōu)選的，所述的培養(yǎng)的條件為5％co2、37℃培養(yǎng)15～20d。

本發(fā)明的機理是：擬通過鈉鈣交換體1啟動子(sodium-calciumexchangerpromoter，ncx1)聯(lián)合丹參酚酸b(salvianolicacidb，salb)誘導(dǎo)誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(inducedpluripotentstemcells，ipscs)定向心肌細(xì)胞分化，ipscs作為修復(fù)急性心肌梗死的種子細(xì)胞，具有廣闊的應(yīng)用前景。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點及效果：

本發(fā)明證實鈉鈣交換體1啟動子聯(lián)合丹參酚酸b可有效誘導(dǎo)ipscs心肌定向分化。丹參酚酸b可有效促進(jìn)ncx1表達(dá)，同時促進(jìn)心肌標(biāo)志物α肌動蛋白(α-actin)、心肌肌鈣蛋白t(ctnt)表達(dá)顯著提高。且ipscs形態(tài)可見心肌細(xì)胞樣梭形改變。

附圖說明

圖1是ncx1慢病毒轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞后ncx1表達(dá)情況；其中，a：egfp；b：oct4；c：ncx1；d：merged。

圖2是鈉鈣交換體1啟動子聯(lián)合丹參酚酸b誘導(dǎo)ipscs分化后形態(tài)改變；其中，a：對照組；b：丹參酚酸b(1μm)；c：丹參酚酸b(10μm)；d：丹參酚酸b(100μm)；e：ncx1組；f：ncx1+丹參酚酸b(1μm)；g：ncx1+丹參酚酸b(10μm)；h：ncx1+丹參酚酸b(100μm)。

圖3是鈉鈣交換體1啟動子聯(lián)合丹參酚酸b誘導(dǎo)ipscs分化后心肌特異性標(biāo)志物表達(dá)情況。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規(guī)實驗條件或按照制造廠商所建議的實驗條件。未注明具體來源的試劑及生物材料，均為市售產(chǎn)品。

實施例1制備ipscs

1)滋養(yǎng)層(mef)的制備：0.1％(體積分?jǐn)?shù))的明膠加入t25培養(yǎng)瓶，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱靜置20min后將其吸除，加入5～6ml預(yù)熱37℃的mef培養(yǎng)液，與此同時將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mef)(購自上海中科院細(xì)胞庫)從液氮中快速取出，置于37℃水浴中快速融解并立即用體積分?jǐn)?shù)為75％的酒精擦拭凍存管后拿到超凈臺內(nèi)，將凍存管內(nèi)的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含mef培養(yǎng)液的15ml離心管內(nèi)，以1000rpm離心5min，棄上清液重懸后加入到t25培養(yǎng)瓶中，放置到co2恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h后得到滋養(yǎng)層即可加入ipscs；

2)ipscs的培養(yǎng)以及傳代：步驟(1)中培養(yǎng)24h后得到的滋養(yǎng)層，4倍顯微鏡下可見已經(jīng)均勻鋪滿t25培養(yǎng)瓶，此時可迅速從液氮中取出ipscs(中科院上海生科院生化細(xì)胞所和中科院上海生科院生化細(xì)胞所干細(xì)胞平臺提供)凍存管，復(fù)蘇過程類似小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，將復(fù)蘇的ipscs直接傳入mef鋪板的t25培養(yǎng)瓶，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱，每日換液并且觀察細(xì)胞集落形態(tài)的變化。待細(xì)胞集落長到合適大小及時傳代，pbs(不含鈣鎂離子)輕輕沖洗一遍后加入0.25％(體積分?jǐn)?shù))胰酶(含edta)消化，小鼠ipscs培養(yǎng)液終止消化，以1000rpm離心5min，棄上清加培養(yǎng)液吹打制備成單細(xì)胞懸液。

實施例2鈉鈣交換體1啟動子制備

1)慢病毒neo-promoter_419bp>luciferase:ires:dsred_express2構(gòu)建和鑒定：

引物設(shè)計：根據(jù)genebank中鈉鈣交換體1啟動子基因的cdna序列，設(shè)計鈉鈣交換體1啟動子引物序列為：

上游引物：5′-gcaacagacatacaaactaaagaat-3′；

下游引物：5′-ggagcaacatagttaagaatacc-3′。

pcr擴增：在上述引物的作用下，以鈉鈣交換體1啟動子的cdna為模板進(jìn)行擴增，電泳檢測pcr產(chǎn)物，切膠回收純化目的條帶。將載體neo-promoter_419bp>luciferase:ires:dsred_express2與擴增鈉鈣交換體1啟動子在內(nèi)切酶作用下重組，取2μl重組反應(yīng)液轉(zhuǎn)化50μl感受態(tài)細(xì)胞，新霉素篩選重組陽性克隆并擴增，菌液行pcr擴增驗證，挑取構(gòu)建正確的菌落培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒dna，構(gòu)建正確標(biāo)記。

2)慢病毒的包裝和濃縮：

將慢病毒包裝質(zhì)粒virapowertmlentiviralpackagingmix和載體質(zhì)粒plv[exp]-neo-promoter_419bp>luciferase:ires:dsred_express2以1：1的摩爾比例混合，在lipofectamine2000的作用下共轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12h后換液，加入新鮮293t細(xì)胞培養(yǎng)液。72h后觀察有強紅色色熒光及細(xì)胞融合現(xiàn)象時收集培養(yǎng)上清，4℃、4500r/min離心15min，將病毒上清液用0.45μm濾膜過濾以去除細(xì)胞碎片，4℃、50000×g高速離心90min。用rnase-freel-dmem懸浮病毒顆粒沉淀，-80℃凍存?zhèn)溆?。同法?gòu)建只含紅色色熒光蛋白的空病毒，標(biāo)記plv[exp]-neo-luciferase:ires:dsred_express2。

3)慢病毒的滴度測定：接種293t細(xì)胞于6孔板，每孔接種2×10⁵個細(xì)胞，37℃培養(yǎng)過夜；第2天將慢病毒溶液用無血清dmem(不含抗生素)按1×10^-2，1×10^-3，1×10^-4，1×10^-5，1×10^-6，1×10^-7進(jìn)行系列稀釋，將其分別加入到相應(yīng)的孔中，加入聚酰胺(polybrene)終濃度至8mg/l，置37℃、體積分?jǐn)?shù)5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。12h后全量換液，加入新鮮的293t細(xì)胞培養(yǎng)液。第4天觀察熒光表達(dá)情況，熒光細(xì)胞數(shù)隨稀釋倍數(shù)增加而減少，計數(shù)出表達(dá)熒光的細(xì)胞個數(shù)，將得到的數(shù)值乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)就得到病毒原液的滴度數(shù)。

4)plv[exp]-neo-promoter_419bp>luciferase:ires:dsred_express2包裝ipscs：將對數(shù)生長期誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(ipscs)消化離心后，以分化培養(yǎng)基重懸成2×10⁷l^-1細(xì)胞懸液，分化培養(yǎng)基為含體積分?jǐn)?shù)1％非必需氨基酸、1％谷氨酰胺、0.25％β-巰基乙醇，體積為15％胎牛血清的dmem。細(xì)胞懸液以20μl/滴接種到直徑10cm的培養(yǎng)皿上，培養(yǎng)皿內(nèi)加少許pbs。懸滴48h后將形成的擬胚體懸浮到含新鮮分化培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，將病毒plv[exp]-neo-promoter_419bp>luciferase:ires:dsred_express2和對照病毒轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的擬胚體。

處理分組如下：a：對照組；b：丹參酚酸b(1μm)；c：丹參酚酸b(10μm)d：丹參酚酸b(100μm)；e：ncx1組；f：ncx1+丹參酚酸b(1μm)；g：ncx1+丹參酚酸b(10μm)；h：ncx1+丹參酚酸b(100μm)。比較各組之間心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)效率，每天更換一次培養(yǎng)基。病毒感染24～48h后，使用新霉素進(jìn)行篩選。第10天后將懸浮的擬胚體接種到0.1％明膠鋪板的培養(yǎng)瓶中，用上述分化培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下每日觀察其生長情況，且收集經(jīng)誘導(dǎo)分化處理的細(xì)胞后續(xù)實驗使用。

實施例3細(xì)胞免疫熒光以及形態(tài)學(xué)鑒定

誘導(dǎo)培養(yǎng)20d后，pbs洗滌3次，以4％多聚甲醛固定，pbs沖洗，dapi復(fù)染細(xì)胞核10min，樹脂膠封片固定。熒光顯微鏡以及倒置顯微鏡下下觀察，每孔觀察10個視野共30個視野。

ncx1慢病毒轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞后ncx1表達(dá)情況，如圖1所示。結(jié)果表明：熒光顯微鏡定性分析可見ncx1有效表達(dá)于ipscs。

鈉鈣交換體1啟動子聯(lián)合丹參酚酸b誘導(dǎo)ipscs分化后形態(tài)改變，如圖2所示；其中，a：對照組；b：丹參酚酸b(1μm)；c：丹參酚酸b(10μm)；d：丹參酚酸b(100μm)；e：ncx1組；f：ncx1+丹參酚酸b(1μm)；g：ncx1+丹參酚酸b(10μm)；h：ncx1+丹參酚酸b(100μm)。結(jié)果表明：相比對照組而言，b～h各組擬胚體均可見邊緣不規(guī)則，ipscs如心肌細(xì)胞樣呈梭形生長。

實施例4心肌特異性標(biāo)志物(α肌動蛋白(α-actin)、心肌肌鈣蛋白t(ctnt))表達(dá)情況分析

western-blot技術(shù)：將細(xì)胞接種至6孔板，37℃，5％co2常規(guī)條件下培養(yǎng)24h。待細(xì)胞穩(wěn)定后按實施例2中的各分組處理方法處理。提取各組蛋白并進(jìn)行sds-page電泳，電泳后轉(zhuǎn)膜用含5％脫脂奶粉的tbst37攝氏度封閉60min，用相應(yīng)抗體4℃孵育過夜。tbst漂洗3次后加入相應(yīng)二抗后37℃孵育60min。然后用tbst漂洗5次后檢測。采用圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析，計算條帶與β-actin的相對積分光密度值。

鈉鈣交換體1啟動子聯(lián)合丹參酚酸b誘導(dǎo)ipscs分化后，心肌特異性標(biāo)志物表達(dá)情況，如圖3所示。結(jié)果表明：相比對照組而言，其他各組α肌動蛋白(α-actin)和心肌肌鈣蛋白t(ctnt)的表達(dá)量均有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)；相比ncx1組而言，不同濃度的丹參酚酸b可有效提高ncx1的心肌分化誘導(dǎo)效率，特別是10～100μm的丹參酚酸b。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>暨南大學(xué)

<120>鈉鈣交換體1啟動子聯(lián)合丹參酚酸b誘導(dǎo)ipscs定向心肌分化的方法

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