本發(fā)明為提取弓形蟲卵囊核酸的方法，可應(yīng)用于糞便、土壤、水體、蔬菜和水果中弓形蟲卵囊的檢測。技術(shù)背景剛地弓形蟲（toxoplasmagondii）是一種細胞內(nèi)寄生蟲，可感染人和多種動物，免疫功能受抑制的動物和人感染弓形蟲可引起死亡，是引起流產(chǎn)的重要原因之一。貓科動物是弓形蟲的終末宿主，可排泄具有抵抗能力的弓形蟲卵囊。多種恒溫動物均是中間宿主，包括草食動物、哺乳動物、鳥類、嚙齒類動物等。含有弓形蟲卵囊的貓科動物糞便排出后，可污染環(huán)境，包括土壤、水體、草坪、蔬菜和水果，鳥類、嚙齒類動物可作為機械性弓形蟲卵囊傳播者繼續(xù)傳播弓形蟲病。卵囊直徑10.0×12.0μm，在外界環(huán)境中通過孢子化形成兩個孢子囊，孢子化卵囊直徑11.0×13.0μm，每個孢子囊含有四個子孢子，直徑6.0×8.0μm。弓形蟲卵囊壁為多層，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，最外是一個疏松外膜（1-3層），該膜由大配子成熟時的壁樣形成小體（wallformingbodytype,wfb）融合而成；隨后成熟的大配子分泌壁樣形成小體1形成卵囊壁的外層即第4層，發(fā)生聚合作用形成了一個厚度約30-70nm的電子致密層；最后壁樣形成小體2形成了卵囊壁的電子致密度低的內(nèi)層即第5層。弓形蟲卵囊的內(nèi)層膜與外層膜具有結(jié)構(gòu)性和化學(xué)性的保護作用。外層膜富含蛋白質(zhì)和糖類，內(nèi)層膜含有較多的脂質(zhì)。臨床檢驗上，因弓形蟲卵囊壁的多層結(jié)構(gòu)，采用常規(guī)核酸提取方法不能有效提取核酸，影響到弓形蟲病的檢測。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了解決弓形蟲卵囊壁多層且堅韌、不易破壞，采用常規(guī)核酸提取方法不能有效提取弓形蟲卵囊核酸的問題，本發(fā)明的目的是提供一種簡便、有效地提取弓形蟲卵囊核酸，提高糞便、土壤、水體、蔬菜和水果等樣品弓形蟲檢測的準(zhǔn)確性的提取弓形蟲卵囊核酸的方法。本發(fā)明技術(shù)方案是以下述方式實現(xiàn)的：1、一種提取弓形蟲卵囊核酸的方法：經(jīng)過下述步聚：a、樣品的凍融；b、裂解樣品；c、提取核酸；d、核酸的檢測：其特征在于：所述a、樣品的凍融是指：將含有弓形蟲卵囊的原料經(jīng)反復(fù)冷凍、解凍至少三次；所述b、裂解樣品的裂解步驟如下：取經(jīng)過凍融的原料樣品剪碎，放入ep管內(nèi)，加入緩沖液a振蕩混勻進行裂解；緩沖液a:30mmtriscl，30mmedta,50%tween20,0.5%triton-x-100,800mmguhcl,ph8.0，向ep管內(nèi)加入proteinasek溶解弓形蟲卵囊壁，56℃水浴過夜，待卵囊完全溶解；proteinasek:1.25ug/ml；向步驟的溶解液內(nèi)加入3mol/l乙酸鈉緩沖液溶解蛋白質(zhì)和核酸，振蕩混勻，56℃水浴，溶液變清亮使卵囊裂解較徹底；所述c、提取核酸步驟如下：向盛卵囊裂解溶液ep管內(nèi)加入無水乙醇振蕩使dna析出；將上一步ep管內(nèi)全部液體倒入一個吸附柱中，吸附柱套入收集管內(nèi)，離心，倒掉收集管內(nèi)廢液，吸附柱放回收集管內(nèi)；向吸附柱中加入緩沖液70％乙醇沉淀核酸，離心，倒掉收集管內(nèi)廢液，吸附柱回收集管內(nèi)；向吸附柱中加入100％乙醇緩沖液再次沉淀核酸，倒掉收集管內(nèi)廢液，吸附柱放回收集管內(nèi)；重復(fù)操作步驟沉淀核酸；將吸附柱放回收集管內(nèi)，離心倒掉收集管內(nèi)廢液，吸附柱放回收集管內(nèi)；將吸附柱室溫靜置；將吸附柱轉(zhuǎn)入干凈的ep管內(nèi)，向吸附膜的中間部位懸空滴加10mmtris-hcl、ph=7.8的緩沖液溶解核酸，室溫靜置、離心，將溶液收集到ep管內(nèi)，得弓形蟲卵囊核酸dna，將ep管內(nèi)液體標(biāo)號冷藏；d、核酸的檢測將所得到的核酸置于微量核酸蛋白檢測儀檢測，od=260nm，280nm；od260nm/od280nm=1.8~2.0。所述反復(fù)冷凍、解凍是：-20℃冰箱冷凍0.5-2小時，然后37℃水浴1分鐘；根據(jù)樣品的體積決定-20℃冰箱冷凍時間見下表，樣品體積（ul）冷凍時間(h)2000.51000120001.540002所述裂解樣品步驟取樣品的量為100mg，加入緩沖液a180μl，加入proteinasek20μl，加入3mol/l乙酸鈉緩沖液200μl，振蕩混勻，56℃水浴25min。所述提取核酸步驟中向ep管內(nèi)加入無水乙醇200μl，振蕩約15sec；將上一步ep管內(nèi)全部液體倒入一個吸附柱中，吸附柱套入收集管內(nèi)，12000rpm離心1min，向吸附柱中加入緩沖液70％乙醇，加入量為500μl/管、12000rpm離心1min，向吸附柱中加入100％乙醇緩沖液600μl/管再次沉淀核酸，12000rpm離心1min，將吸附柱放回收集管內(nèi)，12000rpm離心2min，倒掉收集管內(nèi)廢液，吸附柱放回收集管內(nèi)；將吸附柱室溫靜置5min，將吸附柱轉(zhuǎn)入干凈的ep管內(nèi)，向吸附膜的中間部位懸空滴加10mmtris-hcl、ph=7.8的緩沖液，20μl/管溶解核酸，室溫靜置5min，12000rpm離心2min，得弓形蟲卵囊核酸dna；將ep管內(nèi)液體標(biāo)號-20℃冷藏。所述反復(fù)冷凍、解凍是：-20℃冰箱冷凍0.5-2小時，然后37℃水浴1分鐘。所述提取核酸步驟中向ep管內(nèi)加入無水乙醇200μl，振蕩約15sec；將上一步ep管內(nèi)全部液體倒入一個吸附柱中，吸附柱套入收集管內(nèi)，12000rpm離心1min，向吸附柱中加入緩沖液70％乙醇，加入量為500μl/管、12000rpm離心1min，向吸附柱中加入100％乙醇緩沖液600μl/管再次沉淀核酸，12000rpm離心1min，將吸附柱放回收集管內(nèi)，12000rpm離心2min，倒掉收集管內(nèi)廢液，吸附柱放回收集管內(nèi)；將吸附柱室溫靜置5min，將吸附柱轉(zhuǎn)入干凈的ep管內(nèi)，向吸附膜的中間部位懸空滴加10mmtris-hcl、ph=7.8的緩沖液，20μl/管溶解核酸，室溫靜置5min，12000rpm離心2min，得弓形蟲卵囊核酸dna；將ep管內(nèi)液體標(biāo)號-20℃下冷藏。將所得到的核酸置于微量核酸蛋白檢測儀檢測，od=260nm，280nm。od260nm/od280nm=1.8~2.0；說明提取的核酸達到標(biāo)準(zhǔn)，可以進行進一步的病原擴增反應(yīng)。本發(fā)明的積極效果是：本發(fā)明主要是依據(jù)弓形蟲卵囊的生物學(xué)特性，考慮到了檢測樣品的可操作性，其方法簡便易行、有效地提取弓形蟲卵囊核酸，提高糞便、土壤、水體、蔬菜和水果等樣品弓形蟲檢測的準(zhǔn)確性。具體實施方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明：實施例一本發(fā)明的實施需要以下試劑和器材：冰箱、離心機、微量移液槍、ep管、標(biāo)簽紙、記號筆、消毒藥：5%來蘇兒、工作服、瓷盆、肥皂、擦手紙、垃圾袋；具作操作步驟如下：a、樣品的凍融：含有弓形蟲卵囊的糞便、土壤、水體、蔬菜和水果樣品200ul，首先-20℃冰箱冷凍0.5-2小時，然后37℃水浴1分鐘；這個凍融程序反復(fù)3次。根據(jù)樣品的體積決定-20℃冰箱冷凍時間見下表樣品體積（ul）冷凍時間(h)2000.51000120001.540002b、裂解樣品：取取凍融過的樣品約100mg，剪碎，放入ep管內(nèi)，加入緩沖液a180μl，振蕩混勻。緩沖液a:30mmtriscl，30mmedta,50%tween20,0.5%triton-x-100,800mmguhcl,ph8.0。加入proteinasek20μl，56℃水浴過夜，一般不少于12h，中間需振蕩，待弓形蟲卵囊完全溶解即消化完畢。proteinasek:1.25ug/ml。加入緩沖液b200μl，振蕩混勻，56℃水浴25min，再次振蕩混勻。一般溶液變清亮及說明細胞裂解較徹底。緩沖液b為:3mol/l乙酸鈉。c、提取核酸：加入無水乙醇200μl，振蕩約15sec使dna析出。將上一步ep管內(nèi)全部液體倒入一個吸附柱中，吸附柱套入收集管內(nèi)，12000rpm離心1min，倒掉收集管內(nèi)廢液，吸附柱放回收集管內(nèi)。向吸附柱中加入緩沖液d，加入量：500μl/管沉淀核酸。12000rpm離心1min，倒掉收集管內(nèi)廢液，吸附柱回收集管內(nèi)。緩沖液d:70％乙醇。向吸附柱中加入緩沖液w600μl/管再次沉淀核酸，12000rpm離心1min，倒掉收集管內(nèi)廢液，吸附柱放回收集管內(nèi)。緩沖液w:100％乙醇。重復(fù)操作步驟。將吸附柱放回收集管內(nèi)。12000rpm離心2min，倒掉收集管內(nèi)廢液，吸附柱放回收集管內(nèi)。將吸附柱室溫靜置5min。將吸附柱轉(zhuǎn)入干凈的ep管內(nèi)。向吸附膜的中間部位懸空滴加緩沖液e20μl/管溶解核酸，室溫靜置5min。12000rpm離心2min，將溶液收集到ep管內(nèi)。緩沖液e:10mmtris-hcl(ph7.8);1mmedta,ph8.0。將步驟ep管內(nèi)液體所得dna標(biāo)號至少-20℃冷藏。d、核酸的檢測將所得到的核酸置于微量核酸蛋白檢測儀檢測，od=260nm，280nm。od260nm/od280nm=1.8~2.0；說明提取的卵囊核酸達到擴病原的要求，可以進行進一步的病原擴增反應(yīng)。本發(fā)明技術(shù)順利實施的注意事項：弓形蟲卵囊感染性較強，操作人員需要佩戴防護面罩，試驗操作結(jié)束后，所有的工作服、臺面、實驗用具要清洗干凈，消毒干燥后保存。操作人員用肥皂洗手、洗臉，再用消毒液沖洗，最后用清水洗凈。當(dāng)前第1頁12