本發(fā)明屬于一種再生絲素溶液的加工工藝，具體地說(shuō)，是一種絲素蛋白/羧甲基殼聚糖復(fù)合凝膠及其制備方法。

背景技術(shù)：

近來(lái)，凝膠材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域異軍突起，被用于組織工程支架、藥物輸送載體和創(chuàng)傷敷料等領(lǐng)域，得到科研人員的青睞，許多研究者將凝膠原料鎖定再生絲素蛋白這種廉價(jià)易得、生物相容好、安全性能高的天然高分子生物材料。再生絲素蛋白溶液是一種熱力學(xué)不穩(wěn)定的增液溶膠，在沒(méi)有任何外部作用的情況下，會(huì)由無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)向β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，自發(fā)地轉(zhuǎn)變?yōu)槟z狀態(tài)。一般情況下，這種轉(zhuǎn)變需要的時(shí)間達(dá)1～2個(gè)月，且得到的凝膠力學(xué)性能極差，大大限制了絲素蛋白凝膠作為一種優(yōu)良生物材料的應(yīng)用。絲素蛋白凝膠材料的改性成為研究熱點(diǎn)，主要是為了提高凝膠的力學(xué)性能和穩(wěn)定性。但目前還沒(méi)有一種方法制得的絲素凝膠能以較簡(jiǎn)單的工藝、較短的凝膠時(shí)間呈現(xiàn)出較高的力學(xué)性能。羧甲基殼聚糖是一種水溶性的殼聚糖衍生物，羧甲基殼聚糖類(lèi)復(fù)合材料具有引導(dǎo)神經(jīng)再生、防止組織黏連、促進(jìn)傷口愈合、減少瘢痕形成等優(yōu)點(diǎn)，但用其做成的凝膠材料吸水能力過(guò)強(qiáng)，質(zhì)脆易碎，很難在臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域大規(guī)模應(yīng)用。

1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)具有活化羧基的特性，因其具有反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)率高，選擇性好，對(duì)環(huán)境友好等特點(diǎn)，作為縮合劑和交聯(lián)劑在高分子改性中得到普遍應(yīng)用([j]desalination，2008，234：134-143)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決背景技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明旨在提供了一種絲素蛋白/羧甲基殼聚糖復(fù)合凝膠及其制備方法，工藝簡(jiǎn)單、耗時(shí)短，復(fù)合凝膠具有優(yōu)異的力學(xué)性能。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案包括如下步驟：

一、一種絲素蛋白/羧甲基殼聚糖復(fù)合凝膠：

所述復(fù)合凝膠主要由絲素蛋白和羧甲基殼聚糖的成分構(gòu)成。

所述復(fù)合凝膠中，絲素蛋白和羧甲基殼聚糖的質(zhì)量比為(0.05～2)：1，優(yōu)選的是(0.5～2)：1。

二、一種絲素蛋白/羧甲基殼聚糖復(fù)合凝膠的制備方法：

將脫膠得到的絲素纖維在libr溶液中進(jìn)行溶解處理，并通過(guò)透析制得再生絲素溶液，再將其與羧甲基殼聚糖溶液混合，然后加入交聯(lián)劑1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，最終在乙醇的作用下制備成絲素/羧甲基殼聚糖復(fù)合水凝膠。

所述方法具體過(guò)程如下：

(1)用繭層處理獲得絲素纖維，然后制備獲得絲素溶液；

(2)將羧甲基殼聚糖溶于水中，制得羧甲基殼聚糖溶液；

(3)將步驟(1)中得到的絲素溶液和步驟(2)中得到的羧甲基殼聚糖溶液混合均勻得到混合溶液；

(4)在步驟(3)中得到的混合溶液中加入一定量的交聯(lián)劑，再將溶液在磁力攪拌器上攪拌短時(shí)間后立即倒入模具中靜置；

(5)再浸入乙醇水溶液中，最終得到絲素/羧甲基殼聚糖復(fù)合凝膠。

所述步驟(1)具體為：

(1)將繭層置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5％的na2co3沸水溶液中脫膠兩次，每次30min，得到的絲素纖維用去離子水沖洗后擰干，并在烘箱中烘干；

(2)將步驟(1)中得到的絲素纖維置于9mlibr溶液中，在60℃條件下溶解處理4h，得到的液體經(jīng)過(guò)濾后裝入透析袋于去離子水中透析4d，期間不斷換水，最后得到的絲素溶液。

所述步驟(1)的絲素溶液濃度為0.5～10％w/v，所述步驟(2)的羧甲基殼聚糖溶液濃度為1～5％w/v，所述步驟(3)中絲素溶液和羧甲基殼聚糖溶液的混合體積比為1:1。

最終能夠使得混合后溶質(zhì)絲素和羧甲基殼聚糖的質(zhì)量比例要在(0.05～2)：1范圍內(nèi)。優(yōu)選的所述絲素溶液和羧甲基殼聚糖溶液的濃度比為(0.1～2)：1。

所述羧甲基殼聚糖的脫乙酰度為55％～99％，取代度為60％～99％。

優(yōu)選地，所述步驟(1)中絲素溶液的濃度為0.5～8％w/v，步驟(2)中羧甲基殼聚糖溶液的濃度為1～4％w/v，羧甲基殼聚糖的脫乙酰度為90％，取代度為90％。

更優(yōu)選地，所述步驟(1)中絲素溶液的濃度分別為0.5～4％w/v以及步驟(2)中羧甲基殼聚糖溶液的濃度均為4％w/v。

作為最優(yōu)選的，本發(fā)明絲素溶液的濃度為4％w/v以及羧甲基殼聚糖溶液的濃度為4％w/v，混合體積比為1:1，由此使得本發(fā)明中絲素和羧甲基殼聚糖溶液制備更為簡(jiǎn)單，且容易控制，混合更加均勻，得到的復(fù)合凝膠成型更好，力學(xué)性能更強(qiáng)，復(fù)合凝膠吸水性穩(wěn)定性?xún)?yōu)異。

所述步驟(1)中透析袋的分子量8000～14000。

所述步驟(4)中，交聯(lián)劑采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)的固體粉末，交聯(lián)劑的加入量為體系的0.3～0.75％w/v。

體系是指步驟(4)獲得的混合溶液。

優(yōu)選地，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)的加入量為絲素蛋白/羧甲基殼聚糖溶液體系的0.45％～0.6％w/v。

更優(yōu)選地，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)的加入量為絲素蛋白/羧甲基殼聚糖溶液體系的0.6％w/v。由此使得到的復(fù)合凝膠的交聯(lián)效果優(yōu)異，也不至于造成交聯(lián)劑的過(guò)量。

所述交聯(lián)劑的加入方式分兩種：一種為固體粉末直接加入體系，一種為將固體粉末溶于水中再加入體系，只要保證交聯(lián)劑粉末能夠溶解且加入水的體積必須盡可能的小就可以。

作為優(yōu)選，本發(fā)明所述步驟(5)中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)的加入方式為先將固體粉末溶于少量水中再加入體系，由此使得交聯(lián)劑在混合溶液中的分布更均勻，反應(yīng)會(huì)更迅速高效，得到的復(fù)合凝膠結(jié)構(gòu)更加緊密，性能更優(yōu)。

所述步驟(4)中，攪拌時(shí)間為20s，靜置時(shí)間為6-12h；所述步驟(5)中，乙醇水溶液中的乙醇濃度是60～90％v/v，浸入乙醇水溶液的時(shí)間為12h。

優(yōu)選地，所述步驟(4)中溶液體系倒入模具的靜置時(shí)間為12h。

優(yōu)選地，乙醇水溶液的乙醇濃度為75％v/v。

本發(fā)明的產(chǎn)物通過(guò)實(shí)施例測(cè)試獲得了較高的力學(xué)性能和穩(wěn)定的保水性能，彈性模量達(dá)到(363.94±45.57)kpa，壓縮回復(fù)率達(dá)到100％，在ph＝7.4的磷酸鹽緩沖液中體積相對(duì)穩(wěn)定，溶脹率為(9.32±0.09)×100％。

本發(fā)明通過(guò)edc·hcl的交聯(lián)作用以及乙醇促使絲素蛋白發(fā)生β化轉(zhuǎn)變的特點(diǎn)，促使絲素/羧甲基殼聚糖形成復(fù)合凝膠。以較簡(jiǎn)單的工藝、較短的時(shí)間制備出具有較強(qiáng)力學(xué)性能和較好穩(wěn)定性的凝膠，為改善絲素蛋白復(fù)合凝膠的制備方法提供新的思路，也進(jìn)一步拓展了絲素蛋白的應(yīng)用途徑。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果：

1、工藝簡(jiǎn)單：現(xiàn)有技術(shù)制備絲素蛋白復(fù)合凝膠往往需要有機(jī)溶劑、超聲處理、光學(xué)交聯(lián)等方法，而本發(fā)明在室溫環(huán)境中即可完成；

2、凝膠時(shí)間短：現(xiàn)有技術(shù)制備絲素蛋白復(fù)合凝膠一般所需時(shí)間較長(zhǎng)，而本發(fā)明只需1～2天左右，大大提高了效率；

3、本發(fā)明所需交聯(lián)劑作為活性劑，可通過(guò)水洗法輕松除去，生物安全性高；

4、本發(fā)明制備出的復(fù)合凝膠具有較強(qiáng)的力學(xué)性能和良好吸水穩(wěn)定性、保濕性，優(yōu)于其他方法制備出的絲素蛋白復(fù)合凝膠。本發(fā)明制備的復(fù)合凝膠可用于醫(yī)藥衛(wèi)生、組織工程、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域，拓展了絲素蛋白的應(yīng)用途徑，也為制備高強(qiáng)度的復(fù)合凝膠提供了新思路和新方法。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的解釋而本發(fā)明并不局限于以下實(shí)施例。

實(shí)施例1

本實(shí)施例中絲素/羧甲基殼聚糖復(fù)合凝膠的制備方法依次包括如下步驟。

(1)稱(chēng)取10g剪碎的繭層于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5％的na2co3沸水溶液中脫膠兩次，每次30min，得到的絲素纖維用去離子水沖洗后擰干，并在烘箱中烘干；

(2)將步驟(1)中得到的絲素纖維置于9mlibr溶液中，在60℃條件下溶解處理4h，得到的液體經(jīng)過(guò)濾后裝入透析袋(分子量8000～14000)于去離子水(3)將適量羧甲基殼聚糖(脫乙酰度90％，取代度90％)溶于水中，制得濃度為4％w/v的羧甲基殼聚糖溶液。

(4)將步驟(2)中得到的濃度為0.5％w/v的絲素溶液和步驟(3)中得到的濃度為4％w/v的羧甲基殼聚糖溶液按體積比1：1混合均勻，得到混合溶液。

(5)在步驟(4)中得到的混合溶液中加入一定量的交聯(lián)劑1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)，加入方式分兩種：一種為固體粉末直接加入體系，一種為先將固體粉末溶于少量水中再加入體系。交聯(lián)劑加入量為體系的0.3～0.75％w/v，優(yōu)選為0.45～0.6％w/v，最佳為0.6％w/v。交聯(lián)劑的最佳加入方式為第二種。

(6)在磁力攪拌器不斷攪拌下，將edc·hcl加入絲素/羧甲基殼聚糖復(fù)合溶液，20s后，將溶液倒入模具，靜置6～12h，最佳為12h。

(7)將其浸入60～90％v/v的乙醇水溶液中12h，乙醇最佳濃度為75％v/v，最終得到絲素/羧甲基殼聚糖復(fù)合凝膠。

(8)本實(shí)施例采用力學(xué)萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)(島津，ags-j系列)進(jìn)行單軸壓縮(壓縮速率：1mm/min)來(lái)測(cè)定凝膠的力學(xué)性能。采用質(zhì)量稱(chēng)重法測(cè)試凝膠的溶脹性能：首先將復(fù)合凝膠材料在去離子水或磷酸鹽緩沖液中浸泡24h使其達(dá)到溶脹平衡,然后用濾紙吸去表面水分，稱(chēng)其質(zhì)量為m1(g)，然后將復(fù)合凝膠置于60℃烘箱中烘干，測(cè)其質(zhì)量為m2(g)。計(jì)算公式如下：溶脹率＝(m1-m2)/m2×100％。

該復(fù)合凝膠的彈性模量達(dá)到(29.46±16.70)kpa，壓縮回復(fù)率達(dá)到100％。凝膠在去離子水中吸水溶脹率達(dá)到(103.63±4.91)×100％，在ph＝7.4的磷酸鹽緩沖液中體積相對(duì)穩(wěn)定，溶脹率為(20.79±2.64)×100％。

實(shí)施例2

本實(shí)施例中絲素/羧甲基殼聚糖復(fù)合凝膠的制備方法依次包括如下步驟。

(1)稱(chēng)取10g剪碎的繭層于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5％的na2co3沸水溶液中脫膠兩次，每次30min，得到的絲素纖維用去離子水沖洗后擰干，并在烘箱中烘干；

(2)將步驟(1)中得到的絲素纖維置于9mlibr溶液中，在60℃條件下溶解處理4h，得到的液體經(jīng)過(guò)濾后裝入透析袋(分子量8000～14000)于去離子水中透析4d，期間不斷換水，最后得到的絲素溶液濃度為1.0％w/v。

(3)將適量羧甲基殼聚糖(脫乙酰度90％，取代度90％)溶于水中，制得濃度為4％w/v的羧甲基殼聚糖溶液。

(4)將步驟(2)中得到的濃度為1.0％w/v的絲素溶液和步驟(3)中得到的濃度為4％w/v的羧甲基殼聚糖溶液按體積比1：1混合均勻，得到混合溶液。

(5)在步驟(4)中得到的混合溶液中加入一定量的交聯(lián)劑1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)，加入方式為先將固體粉末溶于少量水中再加入體系。交聯(lián)劑加入量為體系的0.6％w/v。

(6)在磁力攪拌器不斷攪拌下，將edc·hcl加入絲素/羧甲基殼聚糖復(fù)合溶液，20s后，將溶液倒入模具，靜置12h。

(7)將其浸入75％v/v的乙醇水溶液中12h，最終得到絲素/羧甲基殼聚糖復(fù)合凝膠。

(8)通過(guò)與實(shí)施例1相同方式進(jìn)行測(cè)試，獲得該復(fù)合凝膠的彈性模量達(dá)到(78.89±5.67)kpa，壓縮回復(fù)率達(dá)到100％，凝膠在去離子水中吸水溶脹率達(dá)到(56.95±6.34)×100％，在ph＝7.4的磷酸鹽緩沖液中體積相對(duì)穩(wěn)定，溶脹率為(19.17±4.30)×100％。

實(shí)施例3

本實(shí)施例中絲素/羧甲基殼聚糖復(fù)合凝膠的制備方法依次包括如下步驟。

(1)稱(chēng)取10g剪碎的繭層于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5％的na2co3沸水溶液中脫膠兩次，每次30min，得到的絲素纖維用去離子水沖洗后擰干，并在烘箱中烘干；

(2)將步驟(1)中得到的絲素纖維置于9mlibr溶液中，在60℃條件下溶解處理4h，得到的液體經(jīng)過(guò)濾后裝入透析袋(分子量8000～14000)于去離子水中透析4d，期間不斷換水，最后得到的絲素溶液濃度為1.5％w/v。

(3)將適量羧甲基殼聚糖(脫乙酰度90％，取代度90％)溶于水中，制得濃度為4％w/v的羧甲基殼聚糖溶液。

(4)將步驟(2)中得到的濃度為1.5％w/v的絲素溶液和步驟(3)中得到的濃度為4％w/v的羧甲基殼聚糖溶液按體積比1：1混合均勻，得到混合溶液。

(5)在步驟(4)中得到的混合溶液中加入一定量的交聯(lián)劑1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)，加入方式為先將固體粉末溶于少量水中再加入體系。交聯(lián)劑加入量為體系的0.6％w/v。

(6)在磁力攪拌器不斷攪拌下，將edc·hcl加入絲素/羧甲基殼聚糖復(fù)合溶液，20s后，將溶液倒入模具，靜置12h。

(7)將其浸入75％v/v的乙醇水溶液中12h，最終得到絲素/羧甲基殼聚糖復(fù)合凝膠。

(8)通過(guò)與實(shí)施例1相同方式進(jìn)行測(cè)試，獲得該復(fù)合凝膠的彈性模量達(dá)到(99.03±9.72)kpa，壓縮回復(fù)率達(dá)到100％，凝膠在去離子水中吸水溶脹率達(dá)到(51.74±10.03)×100％，在ph＝7.4的磷酸鹽緩沖液中體積相對(duì)穩(wěn)定，溶脹率為(16.60±2.11)×100％。

實(shí)施例4

本實(shí)施例中絲素/羧甲基殼聚糖復(fù)合凝膠的制備方法依次包括如下步驟。

(1)稱(chēng)取10g剪碎的繭層于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5％的na2co3沸水溶液中脫膠兩次，每次30min，得到的絲素纖維用去離子水沖洗后擰干，并在烘箱中烘干；

(2)將步驟(1)中得到的絲素纖維置于9mlibr溶液中，在60℃條件下溶解處理4h，得到的液體經(jīng)過(guò)濾后裝入透析袋(分子量8000～14000)于去離子水中透析4d，期間不斷換水，最后得到的絲素溶液濃度為2.0％w/v。

(3)將適量羧甲基殼聚糖(脫乙酰度90％，取代度90％)溶于水中，制得濃度為4％w/v的羧甲基殼聚糖溶液。

(4)將步驟(2)中得到的濃度為2.0％w/v的絲素溶液和步驟(3)中得到的濃度為4％w/v的羧甲基殼聚糖溶液按體積比1：1混合均勻，得到混合溶液。

(5)在步驟(4)中得到的混合溶液中加入一定量的交聯(lián)劑1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)，加入方式先將固體粉末溶于少量水中再加入體系。交聯(lián)劑加入量為體系的0.6％w/v。

(6)在磁力攪拌器不斷攪拌下，將edc·hcl加入絲素/羧甲基殼聚糖復(fù)合溶液，20s后，將溶液倒入模具，靜置12h。

(7)將其浸入75％v/v的乙醇水溶液中12h，最終得到絲素/羧甲基殼聚糖復(fù)合凝膠。

(8)通過(guò)與實(shí)施例1相同方式進(jìn)行測(cè)試，獲得該復(fù)合凝膠的彈性模量達(dá)到(248.60±34.47)kpa，壓縮回復(fù)率達(dá)到100％，凝膠在去離子水中吸水溶脹率達(dá)到(35.78±10.75)×100％，在ph＝7.4的磷酸鹽緩沖液中體積相對(duì)穩(wěn)定，溶脹率為(13.18±0.53)×100％。

實(shí)施例5

本實(shí)施例中絲素/羧甲基殼聚糖復(fù)合凝膠的制備方法依次包括如下步驟。

(1)稱(chēng)取10g剪碎的繭層于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.0％的na2co3沸水溶液中脫膠兩次，每次30min，得到的絲素纖維用去離子水沖洗后擰干，并在烘箱中烘干；

(2)將步驟(1)中得到的絲素纖維置于9mlibr溶液中，在60℃條件下溶解處理4h，得到的液體經(jīng)過(guò)濾后裝入透析袋(分子量8000～14000)于去離子水中透析4d，期間不斷換水，最后得到的絲素溶液濃度為0.5％w/v。

(3)將適量羧甲基殼聚糖(脫乙酰度90％，取代度90％)溶于水中，制得濃度為4％w/v的羧甲基殼聚糖溶液。

(4)將步驟(2)中得到的濃度為4.0％w/v的絲素溶液和步驟(3)中得到的濃度為4％w/v的羧甲基殼聚糖溶液按體積比1：1混合均勻，得到混合溶液。

(5)在步驟(4)中得到的混合溶液中加入一定量的交聯(lián)劑1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)，加入方式為先將固體粉末溶于少量水中再加入體系。交聯(lián)劑加入量為體系的0.6％w/v。

(6)在磁力攪拌器不斷攪拌下，將edc·hcl加入絲素/羧甲基殼聚糖復(fù)合溶液，20s后，將溶液倒入模具，靜置12h。

(7)將其浸入75％v/v的乙醇水溶液中12h，最終得到絲素/羧甲基殼聚糖復(fù)合凝膠。

(8)通過(guò)與實(shí)施例1相同方式進(jìn)行測(cè)試，獲得該復(fù)合凝膠的彈性模量達(dá)到(363.99±45.57)kpa，壓縮回復(fù)率達(dá)到100％，凝膠在去離子水中吸水溶脹率達(dá)到(20.79±3.14)×100％，在ph＝7.4的磷酸鹽緩沖液中體積相對(duì)穩(wěn)定，溶脹率為(9.32±0.09)×100％。

由此可見(jiàn)，本發(fā)明提供的新的一種制備絲素復(fù)合凝膠的方法，制備工藝簡(jiǎn)單、條件溫和、凝膠時(shí)間短，且得到的復(fù)合凝膠具有較好的力學(xué)性能和吸水穩(wěn)定性：彈性模量達(dá)到(363.94±45.57)kpa，壓縮回復(fù)率達(dá)到100％，即當(dāng)在其上施加一定壓力時(shí)，復(fù)合凝膠的承受能力很強(qiáng)，并未被壓碎，且當(dāng)壓力消去時(shí)，凝膠又恢復(fù)原狀；在ph＝7.4的磷酸鹽緩沖液中體積相對(duì)穩(wěn)定，溶脹率為(9.32±0.09)×100％，且烘干的樣品置于水中可快速吸收大量水而膨脹，但仍然保持較好形態(tài)，并未松散破碎。

以上列舉的僅是本發(fā)明的部分具體實(shí)施例，顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。