本發(fā)明涉及一種五味子多糖提取物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
傳染性造血器官壞死病(infectioushematopoieticnecrosis，ihn)是目前影響我國(guó)鮭鱒魚(yú)產(chǎn)業(yè)發(fā)展最為致命的病毒性疾病，其病原為傳染性造血器官壞死病病毒(infectioushematopoieticnecrosisvirus，ihnv)。ihnv屬于彈狀病毒科(rhabdoviridae)諾拉彈狀病毒屬(novirhabdovirus)，主要感染鮭鱒魚(yú)，包括虹鱒、大馬哈魚(yú)、大西洋鮭以及硬頭鮭等。該病毒一旦侵入魚(yú)體，首先在魚(yú)體腎臟和脾臟造血組織增殖，進(jìn)入血液循環(huán)后便會(huì)繁殖于魚(yú)體的各個(gè)器官，引發(fā)鮭鱒魚(yú)突發(fā)性死亡。根據(jù)魚(yú)的種類、年齡、病毒株系以及環(huán)境條件的不同，ihn的暴發(fā)可導(dǎo)致鮭鱒魚(yú)魚(yú)苗死亡率接近100％、成魚(yú)死亡率達(dá)到25-30％。中國(guó)已經(jīng)將ihn列為二類疫病，同時(shí)是口岸魚(yú)類必須檢疫的第一類對(duì)象。上世紀(jì)九十年代，我國(guó)鮭鱒魚(yú)主產(chǎn)區(qū)發(fā)生了多次大規(guī)模的ihnv暴發(fā)事件，對(duì)一些主產(chǎn)區(qū)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，水生動(dòng)物及其產(chǎn)品進(jìn)出口貿(mào)易急劇增加，ihnv逐漸蔓延開(kāi)，嚴(yán)重威脅我國(guó)鮭鱒魚(yú)主產(chǎn)區(qū)漁業(yè)的健康發(fā)展。由于缺乏有效的防治方法，ihn已成為制約中國(guó)冷水魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的瓶頸問(wèn)題。
多糖(polysaccharide)是一種天然的生物活性成分，能夠參與生命現(xiàn)象中如細(xì)胞分裂、細(xì)胞識(shí)別、細(xì)胞間物質(zhì)運(yùn)輸?shù)戎匾^(guò)程，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗感染等生物功能。多糖類化合物通常具有極小甚至無(wú)細(xì)胞毒性，不影響正常細(xì)胞的功能。研究表明，多糖可以激活t淋巴細(xì)胞、b淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等免疫細(xì)胞參與機(jī)體免疫，尤其是可以誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生，活化補(bǔ)體進(jìn)而抵抗病毒的侵襲。而多糖糖鏈中含有的模擬配體，其結(jié)構(gòu)與病毒具有一定的相似性，能夠阻斷病毒與宿主細(xì)胞表面結(jié)合，并具有加強(qiáng)細(xì)胞修復(fù)及細(xì)胞膜穩(wěn)定的能力，從而抑制病原體的侵入。此外，多糖還能夠通過(guò)抑制反轉(zhuǎn)錄酶活性等方式阻止病毒在機(jī)體內(nèi)的復(fù)制從而起到抗病毒的作用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種五味子多糖提取物及其制備方法和應(yīng)用。
本發(fā)明提供了一種五味子提取物的制備方法，依次包括如下步驟：
(a1)取五味子，進(jìn)行水提，收集液相；所述水提前進(jìn)行超聲預(yù)處理；
(a2)去除蛋白質(zhì)和小分子雜質(zhì)，進(jìn)行醇沉，得到五味子提取物。
所述步驟(a1)具體包括如下步驟：將五味子浸泡于水中，進(jìn)行超聲預(yù)處理，然后75℃浸提3h，收集液相。步驟(a1)中，所述五味子的存在形式為五味子干粉。所述五味子干粉的制備方法包括如下步驟：將五味子60℃恒溫烘干至恒重，然后粉碎，過(guò)20目篩，得到五味子干粉。所述浸泡具體為室溫浸泡2h。所述五味子干粉和水的配比關(guān)系具體為1g五味子：25ml水。所述超聲預(yù)處理的超聲功率為340-380w，具體可為360w。所述超聲預(yù)處理的超聲時(shí)間為25-35min，具體可為30min。
步驟(a1)中，所述“收集液相”具體通過(guò)離心實(shí)現(xiàn)。所述離心的參數(shù)具體可為4000rpm、10min。為了提取充分，可將收集液相后的殘留物(五味子殘?jiān)?進(jìn)行第二次提取。具體步驟如下：五味子殘?jiān)尤胨校?5℃浸提3h，然后收集液相。五味子殘?jiān)退呐浔染唧w可為1g五味子殘?jiān)?0ml水。所述收集液相具體通過(guò)離心實(shí)現(xiàn)。所述離心的參數(shù)具體可為4000rpm、10min。最終將所有收集得到的液相混合。
為了降低后續(xù)步驟中的試劑成本，可將步驟(a1)得到的液相進(jìn)行濃縮。所述濃縮具體可為減壓濃縮。所述濃縮具體可為將所述液相減壓濃縮至原來(lái)體積的1/4。
步驟(a2)中，醇沉采用的醇沉液為無(wú)水乙醇。具體可采用3倍體積的醇沉液。所述醇沉的參數(shù)具體可為：4℃靜置12-16h。醇沉后，具體通過(guò)離心收集沉淀。所述離心的參數(shù)具體可為：4000rpm、10min。
步驟(a2)中，所述“去除蛋白質(zhì)”具體通過(guò)sevag法實(shí)現(xiàn)。去除蛋白質(zhì)的具體方法如下：將沉淀溶解于水中后采用sevag法去除蛋白質(zhì)，收集上層液相。所述沉淀與水的配比關(guān)系為：1g沉淀：10ml水。
步驟(a3)中，所述“去除小分子雜質(zhì)”可通過(guò)透析實(shí)現(xiàn)。所述小分子雜質(zhì)為分子量小于3500da的物質(zhì)。所述“去除小分子雜質(zhì)”的方法具體可為：將步驟(a2)收集到的液相轉(zhuǎn)移到透析袋(透析袋規(guī)格為mw3500)中，然后將透析袋置于水中進(jìn)行透析，然后收集透析袋內(nèi)部的保留液。
步驟(a3)中，醇沉采用的醇沉液為無(wú)水乙醇。具體可采用3倍體積的醇沉液。所述醇沉的參數(shù)具體可為：4℃靜置12-16h。醇沉后，具體通過(guò)離心收集沉淀。所述離心的參數(shù)具體可為：4000rpm、15min。醇沉后，還包括將產(chǎn)物進(jìn)行冷凍干燥的步驟。
本發(fā)明還保護(hù)一種五味子提取物的制備方法，依次包括如下步驟：
(b1)取五味子，進(jìn)行水提，收集液相；所述水提過(guò)程前進(jìn)行超聲預(yù)處理；
(b2)將步驟(b1)得到的液相或其濃縮液進(jìn)行醇沉；
(b3)取步驟(b2)得到的沉淀，用水溶解后采用sevag法去除蛋白質(zhì)，收集上層液相；
(b4)取步驟(b3)得到的上清液轉(zhuǎn)移到規(guī)格為mw3500透析袋中進(jìn)行透析，收集透析袋內(nèi)部的保留液；
(b5)將步驟(b4)得到的保留液進(jìn)行醇沉，得到五味子提取物。
所述步驟(b1)具體包括如下步驟：將五味子浸泡于水中，進(jìn)行超聲預(yù)處理，然后75℃浸提3h，收集液相。步驟(b1)中，所述五味子的存在形式為五味子干粉。所述五味子干粉的制備方法包括如下步驟：將五味子60℃恒溫烘干至恒重，然后粉碎，過(guò)20目篩，得到五味子干粉。所述浸泡具體為室溫浸泡2h。所述五味子干粉和水的配比關(guān)系具體為1g五味子：25ml水。所述超聲預(yù)處理的超聲功率為340-380w，具體可為360w。所述超聲預(yù)處理的超聲時(shí)間為25-35min，具體可為30min。
步驟(b1)中，所述“收集液相”具體通過(guò)離心實(shí)現(xiàn)。所述離心的參數(shù)具體可為4000rpm、10min。為了提取充分，可將收集液相后的殘留物(五味子殘?jiān)?進(jìn)行第二次提取。具體步驟如下：五味子殘?jiān)尤胨校?5℃浸提3h，然后收集液相。五味子殘?jiān)退呐浔染唧w可為1g五味子殘?jiān)?0ml水。所述收集液相具體通過(guò)離心實(shí)現(xiàn)。所述離心的參數(shù)具體可為4000rpm、10min。最終將所有收集得到的液相混合。
為了降低后續(xù)步驟中的試劑成本，可將步驟(b1)得到的液相進(jìn)行濃縮，得到濃縮液。所述濃縮具體可為減壓濃縮。所述濃縮具體可為將所述液相減壓濃縮至原來(lái)體積的1/4。
步驟(b2)中，醇沉采用的醇沉液為無(wú)水乙醇。具體可采用3倍體積的醇沉液。所述醇沉的參數(shù)具體可為：4℃靜置12-16h。醇沉后，具體通過(guò)離心收集沉淀。所述離心的參數(shù)具體可為：4000rpm、10min。
步驟(b3)中，所述“去除蛋白質(zhì)”具體通過(guò)sevag法實(shí)現(xiàn)。去除蛋白質(zhì)的具體方法如下：將沉淀溶解于水中后采用sevag法去除蛋白質(zhì)，收集上層液相。所述沉淀與水的配比關(guān)系為：1g沉淀：10ml水。
步驟(b5)中，醇沉采用的醇沉液為無(wú)水乙醇。具體可采用3倍體積的醇沉液。所述醇沉的參數(shù)具體可為：4℃靜置12-16h。醇沉后，具體通過(guò)離心收集沉淀。所述離心的參數(shù)具體可為：4000rpm、15min。醇沉后，還包括將產(chǎn)物進(jìn)行冷凍干燥的步驟。
本發(fā)明還保護(hù)一種五味子提取物的制備方法，依次包括如下步驟：
(c1)取五味子，進(jìn)行水提，離心，分別收集沉淀和上清；所述水提過(guò)程前進(jìn)行超聲預(yù)處理；
(c2)取步驟(c1)得到的沉淀，進(jìn)行水提，離心，收集上清；
(c3)將步驟(c1)得到的上清和步驟(c2)得到的上清混合，然后進(jìn)行濃縮，得到濃縮液；
(c4)將步驟(c3)得到的濃縮液進(jìn)行醇沉；
(c5)取步驟(c4)得到的沉淀，用水溶解后采用sevag法去除蛋白質(zhì)，收集上層液相；
(c6)取步驟(c5)得到的液相轉(zhuǎn)移到規(guī)格為mw3500透析袋中進(jìn)行透析，收集透析袋內(nèi)部的保留液；
(c7)將步驟(c6)得到的保留液進(jìn)行醇沉，得到五味子提取物。
所述步驟(c1)具體包括如下步驟：將五味子浸泡于水中，進(jìn)行超聲預(yù)處理，然后75℃浸提3h，離心，分別收集沉淀和上清。步驟(c1)中，所述五味子的存在形式為五味子干粉。所述五味子干粉的制備方法包括如下步驟：將五味子60℃恒溫烘干至恒重，然后粉碎，過(guò)20目篩，得到五味子干粉。所述浸泡具體為室溫浸泡2h。所述五味子干粉和水的配比關(guān)系具體為1g五味子：25ml水。所述超聲預(yù)處理的超聲功率為340-380w，具體可為360w。所述超聲預(yù)處理的超聲時(shí)間為25-35min，具體可為30min。所述離心的參數(shù)具體可為4000rpm、10min。
步驟(c2)的具體步驟如下：將沉淀加入水中，75℃浸提3h，離心收集液相。沉淀和水的配比具體可為1g沉淀：10ml水。所述離心的參數(shù)具體可為4000rpm、10min。
步驟(c3)中，所述濃縮具體可為減壓濃縮。所述濃縮具體可為將所述液相減壓濃縮至原來(lái)體積的1/4。
步驟(c4)中，醇沉采用的醇沉液為無(wú)水乙醇。具體可采用3倍體積的醇沉液。所述醇沉的參數(shù)具體可為：4℃靜置12-16h。醇沉后，具體通過(guò)離心收集沉淀。所述離心的參數(shù)具體可為：4000rpm、10min。
步驟(c5)中，所述沉淀與水的配比關(guān)系為：1g沉淀：10ml水。
步驟(c7)中，醇沉采用的醇沉液為無(wú)水乙醇。具體可采用3倍體積的醇沉液。所述醇沉的參數(shù)具體可為：4℃靜置12-16h。醇沉后，具體通過(guò)離心收集沉淀。所述離心的參數(shù)具體可為：4000rpm、15min。醇沉后，還包括將產(chǎn)物進(jìn)行冷凍干燥的步驟。
以上任一所述“sevag法去除蛋白質(zhì)”的方法具體可為：與0.5體積份的sevag試劑混合，充分振蕩后離心，收集上層溶液。棄掉中間層，中間層富含白色的蛋白質(zhì)。將1體積份的sevag試劑和2體積份所述上層溶液混合，充分振蕩后離心，收集上層溶液，棄掉中間層(重復(fù)進(jìn)行本步驟，直至中間層無(wú)蛋白質(zhì)出現(xiàn))。取最終收集的上層溶液。所述sevag試劑為4體積份氯仿和1體積份正丁醇的混合液。所述充分振蕩具體可為置于恒溫空氣振蕩器中劇烈震蕩30min。
以上任一所述水為蒸餾水。
本發(fā)明還保護(hù)以上任一所述方法制備得到的五味子提取物。
本發(fā)明還保護(hù)所述的五味子提取物的應(yīng)用；為如下(d1)和/或(d2)：
(d1)制備抑制ihnv的產(chǎn)品；
(d2)抑制ihnv。
本發(fā)明還保護(hù)一種產(chǎn)品，活性成分為所述五味子提取物；所述產(chǎn)品的用途為抑制ihnv。
以上任一所述抑制ihnv具體可為抑制ihnv在鯉魚(yú)上皮瘤細(xì)胞中的增殖。
以上任一所述ihnv具體可為虹鱒傳染性造血器官壞死病毒hlj-15。
虹鱒傳染性造血器官壞死病毒hlj-15于2016年4月15日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱cctcc；地址：中國(guó)武漢，武漢大學(xué)；郵編：430072)，保藏編號(hào)為cctccno：v201622。
ihnv能在大馬哈魚(yú)胚細(xì)胞系(chinooksalmonembryo，chse-214)、鯉魚(yú)上皮瘤細(xì)胞系(epc)、肥頭鰷魚(yú)細(xì)胞(fatheadminnow，fhm)、虹鱒性腺細(xì)胞系(rainbowtroutgonad，rtg-2)等魚(yú)類細(xì)胞系中進(jìn)行增殖，其中在細(xì)胞系epc中生長(zhǎng)速度較快。因此，本發(fā)明以epc細(xì)胞系為體外篩選細(xì)胞模型，研究了五味子多糖提取物對(duì)ihnv所致細(xì)胞病變的抑制作用。結(jié)果表明，適宜濃度下的五味子多糖提取物對(duì)epc細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性作用。當(dāng)五味子多糖的濃度為100μg/ml時(shí)，五味子多糖提取物對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)中ihnv的抑制率達(dá)到90.88％。本發(fā)明為篩選新型抗ihnv藥物提供了一定的理論依據(jù)。
附圖說(shuō)明
圖1為五味子多糖提取物對(duì)細(xì)胞毒性的檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施方式
以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
虹鱒傳染性造血器官壞死病毒hlj-15于2016年4月15日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱cctcc；地址：中國(guó)武漢，武漢大學(xué)；郵編：430072)，保藏編號(hào)為cctccno：v201622。虹鱒傳染性造血器官壞死病毒hlj-15簡(jiǎn)稱為hlj-15。
鯉魚(yú)上皮瘤細(xì)胞(epitheliomapapulossumofcarp，epc)：美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(atcc)，編號(hào)：crl-2872。
五味子：黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)門(mén)診部。
超聲波振蕩器：深圳市深華泰超聲洗凈設(shè)備有限公司，ps-60a。
實(shí)施例1、五味子多糖提取物的制備
1、將五味子置于恒溫箱中60℃烘干至恒重，然后粉碎，過(guò)20目篩，得到五味子干粉。
2、將步驟1得到的五味子干粉加入蒸餾水中，室溫浸泡2h(每1g五味子干粉配比25ml蒸餾水)后進(jìn)行超聲處理(將整個(gè)體系置于超聲波振蕩器中，采用360w功率超聲處理30min)，然后置于恒溫水浴鍋中進(jìn)行高溫浸提(75℃、3h)，然后4000rpm離心10min，分別收集上清液和沉淀。
3、將步驟2得到的沉淀加入蒸餾水中(每1g濕重的沉淀配比10ml蒸餾水)，然后于恒溫水浴鍋中進(jìn)行高溫浸提(75℃、3h)，然后4000rpm離心10min，收集上清液。
4、將步驟2得到的上清液和步驟3得到的上清液合并，然后減壓濃縮至1/4體積，得到濃縮液。
5、將步驟4得到的濃縮液和3倍體積的無(wú)水乙醇混合，進(jìn)行醇沉(4℃靜置過(guò)夜)，然后4000rpm離心10min，收集沉淀。
6、將步驟5得到的沉淀(五味子粗提物)溶解于蒸餾水中(每1g五味子粗提物配比10ml蒸餾水)，得到五味子粗提物溶液。
7、從步驟6得到的五味子粗提物溶液中提純粗多糖。
將1體積份的sevag試劑(4體積份氯仿和1體積份正丁醇的混合液)和2體積份五味子粗提物溶液混合，置于恒溫空氣振蕩器中劇烈震蕩30min(目的是充分震蕩混勻)，然后4000rpm離心10min，收集上層(富含多糖)，棄掉中間層(富含白色的蛋白質(zhì))。
將1體積份的sevag試劑(4體積份氯仿和1體積份正丁醇的混合液)和2體積份前一步驟收集的上層混合，置于恒溫空氣振蕩器中劇烈震蕩30min，然后4000rpm離心10min，收集上層，棄掉中間層。重復(fù)進(jìn)行本步驟，直至中間層無(wú)蛋白質(zhì)出現(xiàn)。
最終收集的上層，即為五味子粗多糖溶液。
8、將步驟7得到的五味子粗多糖溶液轉(zhuǎn)移到透析袋(透析袋規(guī)格為mw3500，產(chǎn)品編號(hào)jm-md34-3.5，usa)中，然后將透析袋置于蒸餾水中進(jìn)行透析(每小時(shí)更換1次新的蒸餾水，更換4-5次)，然后收集透析袋內(nèi)部的保留液。
本步驟的目的是：去除小分子雜質(zhì)。
9、將步驟8收集的保留液和3倍體積的無(wú)水乙醇混合，進(jìn)行醇沉(4℃靜置12-16h)，然后4000rpm離心15min，收集沉淀并進(jìn)行冷凍干燥，得到五味子多糖提取物。
每克步驟1的五味子干粉得到142.53毫克步驟9的五味子多糖提取物。
10、取步驟9得到的五味子多糖提取物，采用苯酚硫酸法測(cè)定總糖含量，采用3，5二硝基水楊酸法測(cè)定還原糖含量，通過(guò)計(jì)算得出提取物中五味子多糖含量為37.58％(多糖＝總糖-還原糖)。每1g五味子多糖提取物中五味子多糖的含量為375.82mg。
實(shí)施例2、五味子多糖提取物對(duì)細(xì)胞毒性的檢測(cè)
本實(shí)施例中五味子多糖的濃度是根據(jù)實(shí)施例1步驟10中五味子多糖提取物中五味子多糖的占比計(jì)算得到的。
1、取實(shí)施例1制備的五味子多糖提取物和m199培養(yǎng)基(含2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素)，配制如下工作液：
工作液a(正常細(xì)胞對(duì)照組)：m199培養(yǎng)基(含2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素)。
工作液b(實(shí)驗(yàn)組i)：將五味子多糖提取物溶解于m199培養(yǎng)基(含2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素)中，得到工作液b；工作液b中五味子多糖的濃度為25μg/ml。
工作液c(實(shí)驗(yàn)組ii)：將五味子多糖提取物溶解于m199培養(yǎng)基(含2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素)中，得到工作液b；工作液b中五味子多糖的濃度為50μg/ml。
工作液d(實(shí)驗(yàn)組iii)：將五味子多糖提取物溶解于m199培養(yǎng)基(含2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素)中，得到工作液b；工作液b中五味子多糖的濃度為100μg/ml。
工作液e(實(shí)驗(yàn)組iv)：將五味子多糖提取物溶解于m199培養(yǎng)基(含2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素)中，得到工作液b；工作液b中五味子多糖的濃度為200μg/ml。
工作液f(實(shí)驗(yàn)組v)：將五味子多糖提取物溶解于m199培養(yǎng)基(含2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素)中，得到工作液b；工作液b中五味子多糖的濃度為400μg/ml。
工作液g(實(shí)驗(yàn)組vi)：將五味子多糖提取物溶解于m199培養(yǎng)基(含2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素)中，得到工作液b；工作液b中五味子多糖的濃度為800μg/ml。
2、將鯉魚(yú)上皮瘤細(xì)胞(epc)接種至96孔板中(每孔104個(gè)細(xì)胞)，采用m199培養(yǎng)基(含10％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素)，25℃培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)成單層。設(shè)置不接種細(xì)胞的空白對(duì)照組。
3、完成步驟2后，取所述96孔板，棄掉培養(yǎng)基，每孔加入100μl步驟1制備的工作液，每個(gè)工作液設(shè)6個(gè)重復(fù)。空白對(duì)照組每孔加入100μlm199培養(yǎng)基(含2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素)。25℃培養(yǎng)7天后采用mtt法檢測(cè)細(xì)胞活性。
結(jié)果如圖1所示。圖1中，橫坐標(biāo)為五味子多糖的濃度，縱坐標(biāo)為細(xì)胞活力值(odt/odm×100％，odt：實(shí)驗(yàn)組吸光度值-空白對(duì)照組吸光度值；odm：正常細(xì)胞組-空白對(duì)照組吸光度值)。五味子多糖濃度為25-400μg/ml時(shí)，epc細(xì)胞仍然可以保持95％以上的活性。結(jié)果表明，當(dāng)五味子多糖在此濃度范圍內(nèi)對(duì)epc細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性作用。
實(shí)施例3、五味子多糖提取物抗ihnv活性研究
本實(shí)施例中五味子多糖的濃度是根據(jù)實(shí)施例1步驟10中五味子多糖提取物中五味子多糖的占比計(jì)算得到的。
1、取實(shí)施例1制備的五味子多糖提取物和m199培養(yǎng)基(含2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素)，配制如下工作液：
工作液a(處理組i)：將五味子多糖提取物溶解于m199培養(yǎng)基(2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素)中，得到工作液a；工作液a中五味子多糖的濃度為3.12μg/ml。
工作液b(處理組ii)：將五味子多糖提取物溶解于m199培養(yǎng)基(2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素)中，得到工作液b；工作液b中五味子多糖的濃度為6.25μg/ml。
工作液c(處理組iii)：將五味子多糖提取物溶解于m199培養(yǎng)基2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素)中，得到工作液c；工作液c中五味子多糖的濃度為12.50μg/ml。
工作液d(處理組iv)：將五味子多糖提取物溶解于m199培養(yǎng)基2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素)中，得到工作液d；工作液d中五味子多糖的濃度為25.00μg/ml。
工作液e(處理組v)：將五味子多糖提取物溶解于m199培養(yǎng)基2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素)中，得到工作液e；工作液e中五味子多糖的濃度為50.00μg/ml。
工作液f(處理組vi)：將五味子多糖提取物溶解于m199培養(yǎng)基2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素)中，得到工作液f；工作液f中五味子多糖的濃度為100.00μg/ml。
2、將鯉魚(yú)上皮瘤細(xì)胞(epc)接種至96孔板中(每孔104個(gè)細(xì)胞)，采用m199培養(yǎng)基(含10％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素)，25℃培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)成單層。設(shè)置不接種細(xì)胞的空白對(duì)照組。
3、完成步驟2后，取所述96孔板，棄掉培養(yǎng)基，進(jìn)行如下分組處理：
處理組：每孔加入含有100tcid50的hlj-15病毒液及步驟1制備的含不同濃度五味子多糖的的工作液100μl，15℃培養(yǎng)2h，吸棄孔內(nèi)液體，加入100μlm199培養(yǎng)基(含2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素)。
正常細(xì)胞組：每孔加入100μlm199培養(yǎng)基(含2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素)，15℃培養(yǎng)2h后吸棄孔內(nèi)液體，加入100μlm199培養(yǎng)基(含2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素)。
病毒對(duì)照組：每孔加入含100tcid50hlj-15病毒液100μl，15℃培養(yǎng)2h后吸棄孔內(nèi)液體，每孔加入100μlm199培養(yǎng)基(含2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素)。
空白對(duì)照組：每孔加入100μlm199培養(yǎng)基(含2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素)，15℃培養(yǎng)2h，吸棄孔內(nèi)液體，每孔加入100μlm199培養(yǎng)基(含2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素)。
每組設(shè)6個(gè)重復(fù)。15℃培養(yǎng)觀察細(xì)胞病變情況(cytopathiceffect，cpe)，當(dāng)病毒對(duì)照組cpe達(dá)到75％以上時(shí)，記錄各組cpe情況(cpe判定標(biāo)準(zhǔn)：記錄“-”為正常細(xì)胞，“+”為25％以上的細(xì)胞出現(xiàn)cpe，“++”為50％以上的細(xì)胞出現(xiàn)cpe?！?++”為75％以上細(xì)胞出現(xiàn)cpe)，并采用mtt法測(cè)定細(xì)胞活性。
結(jié)果如表1所示。
抑制率＝odtv-odcv/odm-odcv，
odtv：處理組吸光度值-空白對(duì)照組吸光度值；
odcv：病毒對(duì)照組-空白對(duì)照組吸光度值；
odm：正常細(xì)胞組-空白對(duì)照組吸光度值。
表1五味子多糖提取物抗ihnv活性
注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母間表示t檢驗(yàn)差異達(dá)顯著水平(p＜0.05)。
結(jié)果表明，五味子多糖提取物濃度為100μg/ml時(shí)，提取物對(duì)ihnv的抑制能力達(dá)到90.88％，隨著五味子多糖提取物濃度的不斷降低，其對(duì)ihnv的抑制能力逐漸下降。