本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體地涉及一株解磷菌根真菌及其在促進(jìn)藍(lán)莓生長(zhǎng)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

藍(lán)莓又稱越橘，杜鵑花科越橘屬植物，是具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值和廣闊開發(fā)前景的新興果樹。藍(lán)莓由于獨(dú)特的風(fēng)味及營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值，被譽(yù)為“第三代水果和人類五大健康保健食品之一”。近年來(lái)，在我國(guó)山東、江蘇和遼寧等地開始了大面積的栽培生產(chǎn)，已成為最具發(fā)展?jié)摿Φ墓麡錁浞N之一。隨著栽培面積的擴(kuò)大，藍(lán)莓苗的需求也日益增加。而藍(lán)莓同其它杜鵑花科植物一樣，為淺根系植物，沒(méi)有大的主根，根系纖細(xì)且不發(fā)達(dá)，對(duì)土壤中有機(jī)質(zhì)含量和酸堿度要求的苛刻。因此，如何加強(qiáng)藍(lán)莓植株健康快速生長(zhǎng)已成為目前影響藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展的因素之一。

菌根是生物界中一類備受關(guān)注的互惠共生體。植物可為菌根真菌提供碳素化合物和一些有機(jī)物以保證菌根真菌生存發(fā)展，而菌根真菌利用其龐大根外菌絲將土壤中豐富的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)傳遞宿主植物。杜鵑花科植物在自然狀態(tài)下普遍有菌根真菌共生，以促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。研究證實(shí)，將杜鵑花類植物根系上篩選出的有益菌根真菌進(jìn)行回接，可以大大促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)。

磷是植物生長(zhǎng)所必需的礦質(zhì)元素之一。磷在土壤中主要以無(wú)機(jī)磷化合物和有機(jī)磷化合物兩種形態(tài)存在，其中無(wú)機(jī)磷的含量約占全磷含量的50％以上，主要是以礦物形式存在無(wú)效磷，所以土壤中可溶性磷的含量很低。提高磷的利用率一直是科學(xué)工作者研究的熱點(diǎn)課題之一。

土壤中存在許多具有解磷特性的微生物，它們可以將植物難以吸收利用的磷轉(zhuǎn)化為可吸收利用的形式，改善植物磷素營(yíng)養(yǎng)，還能促進(jìn)土壤中有益微生物的代謝活動(dòng)。具有解磷能力的微生物包括細(xì)菌、真菌和放線菌。目前，關(guān)于根際土壤中解磷細(xì)菌的研究已有較多積累。相比之下，而對(duì)于解磷真菌的報(bào)道較少。解磷真菌的溶磷能力一般要強(qiáng)于細(xì)菌，且遺傳性狀更加穩(wěn)定，在微生物肥料應(yīng)用方面具有極大潛力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的問(wèn)題在于提供一株具有解磷能力的菌根真菌wr1；將其回接藍(lán)莓組培苗和實(shí)生苗，均表現(xiàn)出顯著促生效應(yīng)。因此，本發(fā)明的菌根真菌wr1能為開發(fā)微生物菌肥提供優(yōu)良的菌株資源，并具有良好的應(yīng)用開發(fā)前景。

本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的:

一株解磷菌根真菌wr1，其分類學(xué)名為minutisphaeraaspera，已在中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心保藏，其保藏號(hào)為cgmccno.13884。

本發(fā)明提供一種包含上述真菌wr1的促藍(lán)莓生長(zhǎng)劑。

本發(fā)明還提供上述真菌wr1在促藍(lán)莓生長(zhǎng)中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供一種所述解磷菌根真菌wr1接種劑的制備方法，從pda平板上打取3塊直徑為5mm的真菌wr1菌塊，接種到分裝后的pda培養(yǎng)液中，28℃震蕩培養(yǎng)15-20天，轉(zhuǎn)速為180rpm；所述分裝后的pda培養(yǎng)液制備：pda培養(yǎng)液分裝到容器中，放入玻璃球，并高壓滅菌。

附圖說(shuō)明

圖1wr1菌株的解磷量；

圖2wr1菌株的解磷率；

圖3wr1菌株發(fā)酵液可溶性磷含量的動(dòng)態(tài)變化；

圖4wr1菌株發(fā)酵液ph的動(dòng)態(tài)變化；

圖5wr1菌落的形態(tài)，a，菌落正面；b，菌落反面；

圖6wr1的菌絲；

圖7接種wr1對(duì)藍(lán)莓組培苗生長(zhǎng)的影響；a、對(duì)照組，b、接種wr1組；

圖8wr1侵入藍(lán)莓根的皮層細(xì)胞：箭頭所指為wr1在細(xì)胞內(nèi)形成的菌絲團(tuán)；

圖9接種wr1對(duì)藍(lán)莓實(shí)生苗地上部分干重的影響。

菌株保藏信息：菌株為wr1，其分類命名為minutisphaeraaspera；該菌株保藏于2017年4月11日中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)保藏編號(hào)為：cgmccno.13884。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例來(lái)對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步解釋，但本發(fā)明的技術(shù)方案不受實(shí)施例任何形式上的限制。

實(shí)施例1

藍(lán)莓根部解磷內(nèi)生真菌的分離、純化和篩選，步驟如下：

1、在大興安嶺地區(qū)采集帶土樣的野生藍(lán)莓根系，用清水洗凈藍(lán)莓根段，然后將其轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)中進(jìn)行如下操作：將根段浸泡在10％(質(zhì)量比)雙氧水中8min，期間用無(wú)菌鑷子輕輕翻動(dòng)幾次，以保證消毒徹底；無(wú)菌水漂洗2-3次后，將其轉(zhuǎn)入6％(質(zhì)量比)次氯酸鈉，浸泡15分鐘，無(wú)菌水漂洗2次；濾紙吸干根段表面殘留的液體。將消毒后的根段用無(wú)菌的剪刀剪成0.5cm長(zhǎng)的根段，接入制備好的pda平板，于25-30℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗倒置培養(yǎng)。pda平板的配方：0.6％馬鈴薯浸粉，2％葡萄糖，2％瓊脂，ph5.6。115℃滅菌20分鐘，冷卻至60℃時(shí)，加入無(wú)菌的氨芐青霉素(50ug/ml)和硫酸鏈霉素(100ug/ml)。上述各成份濃度均為pda培養(yǎng)基中的終濃度。

2、當(dāng)發(fā)現(xiàn)組織切口處有真菌長(zhǎng)出來(lái)的時(shí)候，盡快用接種針將其挑入不加青霉素和鏈霉素的pda平板中，25-30℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗倒置進(jìn)行純化培養(yǎng)，轉(zhuǎn)移3-5次后得到純菌落。

3、將純化后的內(nèi)生真菌分別接種于無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基上，25-30℃恒溫培養(yǎng)10天，測(cè)定菌落直徑(d)和溶磷圈直徑(d)，并計(jì)算比值(d/d)。無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基的配方：葡萄糖10g；ca3(po4)25g；mgso4·7h2o0.25g；mgcl2·6h2o5g；kcl0.2g；(nh4)2so40.1g；雙篜水定容1l后調(diào)節(jié)ph6.5-7.5，加入瓊脂16g，115℃滅菌20min。

實(shí)施例2

wr1菌株的解磷能力測(cè)試，步驟如下：

1、檢測(cè)菌株wr1對(duì)無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷的降解情況。經(jīng)上述初篩，得到一菌株，命名為wr1，其d/d為1.02。在超凈工作臺(tái)上，用打孔器打取5mm的wr1菌塊分別接種至裝有100ml無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷液體培養(yǎng)基的三角瓶中，三角瓶規(guī)格是250ml，28℃，180rpm震蕩培養(yǎng)。以接種無(wú)菌的pda培養(yǎng)基塊為對(duì)照，所有處理均設(shè)3次重復(fù)。培養(yǎng)7天后，過(guò)濾掉菌絲，采用鉬銻抗比色法測(cè)定上清液中od值，并計(jì)算上清液中的有效磷含量和解磷率。其中，解磷率(％)＝(接菌可溶性磷含量－對(duì)照可溶性磷含量)/加入磷酸鹽的量×100。無(wú)機(jī)磷酸鹽液體培養(yǎng)基有三種，其中1號(hào)培養(yǎng)基成分包括：葡萄糖10g、ca3(po4)25g、mgso4·7h2o0.25g、mgcl2·6h2o5g、kcl0.2g、(nh4)2so40.5g、雙篜水定容1l后調(diào)節(jié)ph6.5-7.5；2號(hào)培養(yǎng)基用磷酸鋁(alpo4)代替1號(hào)中的ca3(po4)2，其它成分和含量相同；3號(hào)培養(yǎng)基用磷酸鐵(fepo4·4h2o)代替1號(hào)中的ca3(po4)2，其它成分和含量相同。有機(jī)磷培養(yǎng)基成分包括：葡萄糖10g，(nh4)2so40.5g，mgso4·7h2o0.3g，kcl0.3g，feso4·7h2o0.03g，mnso4·7h2o0.03g，植酸鈣5g，蒸餾水1000ml，ph7.2。結(jié)果顯示，菌株wr1對(duì)磷酸三鈣、磷酸鋁、磷酸鐵及植酸鈣均有溶解，其中對(duì)磷酸三鈣的溶解效果最好(圖1和圖2)。

2、wr1菌株解磷能力的動(dòng)態(tài)變化。選擇wr1菌株最敏感的磷酸鈣作為磷源，檢測(cè)其解磷能力的動(dòng)態(tài)變化。從選擇pda平板上取2個(gè)直徑5mm的wr1菌塊接入50mlpda液體培養(yǎng)基，28℃搖瓶震蕩4-5天制成種子液，按10％體積比例接入裝有200ml上述1號(hào)無(wú)機(jī)磷酸鹽液體培養(yǎng)液的500ml三角瓶中，放置于28℃震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為180rpm。以接種無(wú)菌的pda培養(yǎng)液為對(duì)照，所有處理均設(shè)3次重復(fù)。自培養(yǎng)第二天起每隔12h測(cè)一次發(fā)酵液的ph值及發(fā)酵液中可溶磷的含量，測(cè)至120小時(shí)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)直接用ph計(jì)測(cè)定發(fā)酵液，并采用上述鉬銻抗比色法測(cè)定發(fā)酵液中可溶性磷的含量。結(jié)果顯示，發(fā)酵液中的可溶性磷含量從24hr開始增加，持續(xù)到96hr達(dá)到最高1600mg/l，之后出現(xiàn)稍微下降趨勢(shì)(圖3)；發(fā)酵液的ph值與解磷量基本呈負(fù)相關(guān)，0-24hr變化不大，之后出現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)，96hr時(shí)最低4.34(圖4)。

實(shí)施例3

菌株wr1的形態(tài)和分子生物學(xué)鑒定，步驟如下：

1、挑取上述保存的純化菌種，接種到pda平板中，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)活化1-2周。用直徑為0.5cm的無(wú)菌打孔器從菌落的最外層打取菌餅，接種到新的pda平板上，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周，觀察菌落的形態(tài)。圖5示菌落呈灰白色，絨毛狀，菌絲致密，菌落的中間凸起，有放射狀的裂痕，菌落背面呈暗黃色。

2、用接種針挑取少量純化后的單菌落菌絲，將其放入滴有一滴生理鹽水的載玻片上制成臨時(shí)裝片，并在顯微鏡下觀察內(nèi)生真菌的菌絲結(jié)構(gòu)。圖6示菌絲曲直不一，有隔，不能產(chǎn)生孢子。

3、對(duì)菌種進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。采用全式金的plantgenomicdnakit試劑盒提取培養(yǎng)菌絲的基因組dna，擴(kuò)增引物是its1：5′-tccgtaggtgaacctgcgg-3′和its4：5′-tcctccgcttattgatatgc-3′。pcr反應(yīng)體系(25μl)包括：2.5μl10×pcr緩沖液(含mg2+)，2μldntp(2.5mmeach)，1.5μlits1(10μm)，1.5μlits4(10μm)，0.2μltaq酶，2μl基因組dna，15.3μlddh2o，。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min，循環(huán)1次；94℃變性1min，51℃退火1min，72℃延伸1min，35次循環(huán)；最后72℃延伸10min。pcr擴(kuò)增產(chǎn)物寄至北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。將獲得的rdna基因間內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列，即its序列(internallytranscribedspacer)，與美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)(ncbi，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的序列進(jìn)行blastn比對(duì)，與阿斯佩拉微球菌minutisphaeraaspera(no.kp309990.1)最為相似，最大相似度達(dá)97％。該菌株編號(hào)為wr1，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定為一株minutisphaeraaspera，已在中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter,cgmcc)保藏，其保藏號(hào)為13884。

測(cè)序結(jié)果：

agttgttcgagcggccccaggcatcgccaggtggccgcttagacatcaacaccctctgtatatataccgcgttgctttggcgggacggcagccagcagccccgctgggaagctgtccgtagggcctgtccaagggccccgcgagcgcccgccagagaaccgtcaaactcatgttaaaccgtggtgtctgagctttacaagcaaataagttaaaactttcaacaacggatctcttggttctcgcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgcgaagtaatgtgaattgcagtattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcatattgcgccccttggtattccgaggggcatgccttttcgagcgtcattacaaccgtcaagctctgcttggtactgggcctccgtccccacgccggcgggcctctaagtcatcagcggctgagagaacggcgttctagcgtagtagaaattaactcggcagggaccggcctcgggcagctgtcaaacccgcgcctctgcgcccatcttaggttgacctcggataaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcaaa。

實(shí)施例4

菌株wr1對(duì)藍(lán)莓組培苗的接種效應(yīng)分析，步驟如下：

1、藍(lán)莓苗的培養(yǎng)

(1)藍(lán)莓芽分化

選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好，株高4-5cm的藍(lán)莓組培苗進(jìn)行快速繁殖。在超凈工作臺(tái)中用無(wú)菌的剪刀將組培瓶中的藍(lán)莓植株從基部剪斷，剪成2-3cm的莖段，然后用無(wú)菌的鑷子將其接到含有分化培養(yǎng)基的組培瓶中，每瓶中接入3-4個(gè)莖段，均勻分散放置。所用的培養(yǎng)基是以wpm培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，在每升wpm培養(yǎng)基中均添加蔗糖20g、瓊脂5-10g，添加植物激素玉米素1.0-3.0mg，培養(yǎng)基ph5.0-5.5，培養(yǎng)容器裝量10-30％，121℃高壓滅菌20min。培養(yǎng)條件設(shè)置為23-25℃，2000-3000lx的光強(qiáng)，光照時(shí)間8-16h/天，培養(yǎng)時(shí)間40-60天。

(2)藍(lán)莓生根培養(yǎng)

在超凈工作臺(tái)中，選取高5-6cm生長(zhǎng)狀態(tài)良好的藍(lán)莓組培苗進(jìn)行生根培養(yǎng)。用無(wú)菌的剪刀從藍(lán)莓組培苗的基部剪斷，然后用無(wú)菌的鑷子將剪斷的植株插入帶有濾紙球的生根培養(yǎng)基中，植株插的深度以植株底部剛浸入培養(yǎng)基為宜，每瓶液體培養(yǎng)基中接入6-10株藍(lán)莓苗。所用培養(yǎng)基為1/2wpm培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，然后加入蔗糖20g，吲哚丁酸1-2.5mg，定容到1升，調(diào)培養(yǎng)基的ph為5.0-5.5。將配好的液體培養(yǎng)基倒入裝有濾紙球的組培瓶中，培養(yǎng)容器裝量10-30％(體積比)，121℃高壓滅菌20min。濾紙球以鋪滿組培瓶的底部以便于固定藍(lán)莓幼苗。培養(yǎng)條件設(shè)置為23-25℃，2000-3000lx的光強(qiáng)，光照時(shí)間8-16h/天，培養(yǎng)時(shí)間40-60天。

2、wr1接種劑的制備

配制將pda液體培養(yǎng)基，分裝到1l三角瓶中，每瓶分裝100-200ml，并放入10-20個(gè)玻璃球，121℃高壓滅菌20min。將冷凍保藏的試管斜面上的菌株wr1活化后接入上述分裝后的pda液體培養(yǎng)基中，種子菌種接種量為培養(yǎng)容器裝量的10-20％(體積比)。培養(yǎng)液培養(yǎng)條件為28℃，震蕩培養(yǎng)轉(zhuǎn)速180rpm，培養(yǎng)時(shí)間為15天。從pda平板上打取3塊直徑為5mm的wr1菌塊，接種到分裝后的pda培養(yǎng)液中，28℃震蕩培養(yǎng)15-20天，轉(zhuǎn)速為180rpm。所述分裝后的pda培養(yǎng)液制備：pda培養(yǎng)液分裝到500ml三角瓶中，每瓶分裝100-200ml，并放入10-20個(gè)玻璃球，121℃高壓滅菌20min。

3、wr1促進(jìn)藍(lán)莓組培苗生長(zhǎng)

(1)共培養(yǎng)基質(zhì)的準(zhǔn)備

先將干苔蘚剪短，用清水洗凈，在蒸餾水中浸泡過(guò)夜，讓其充分吸水，再分裝到組培瓶中，容器裝量為15％-25％(體積比)，121℃高壓滅菌30min，備用。

(2)菌株wr1與藍(lán)莓組培苗共培養(yǎng)

將生根藍(lán)莓苗用無(wú)菌的鑷子接入上述制備共培養(yǎng)基質(zhì)中，再用移液槍加入4-6ml上述制備的dse接種劑。吸取前，需要將dse接種劑晃動(dòng)混勻。移液槍頭前端需剪掉2-3mm，并滅菌后才能使用。接種后，放至25℃，2000-3000lx的光強(qiáng)，光照時(shí)間8-16h/天條件下進(jìn)行共培養(yǎng)60天后，觀察接種菌株對(duì)藍(lán)莓苗生長(zhǎng)的影響。

結(jié)果顯示，wr1對(duì)藍(lán)莓組培苗根、莖、葉生長(zhǎng)均有明顯促生效應(yīng)(圖7)。取部分根段，檢測(cè)wr1真菌在藍(lán)莓組培苗根部的定植情況。將根段放入提前配制好的faa固定液中固定12小時(shí)，沖洗后脫色。所述的脫色方法為經(jīng)過(guò)10％(質(zhì)量體積比)koh透明、10％(質(zhì)量比)h2o2漂白、1％(質(zhì)量比)hcl酸化、0.05％(質(zhì)量體積比)臺(tái)盼藍(lán)染色和50％(體積比)甘油脫色。隨機(jī)選取藍(lán)莓根段，在顯微鏡下鏡檢觀察。圖8示在藍(lán)莓根的皮層細(xì)胞中可看到菌絲，表明wr1可侵入宿主植物根內(nèi)。此外，取接種的藍(lán)莓苗的根樣，從中只分離得到與接種劑相同的菌株，進(jìn)一步證明上述接菌的藍(lán)莓苗所表現(xiàn)出的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)是dse真菌在藍(lán)莓根部定植引起的。

實(shí)施例6菌株wr1對(duì)藍(lán)莓實(shí)生苗的接種效應(yīng)分析

wr1對(duì)藍(lán)莓實(shí)生苗的接種效應(yīng)分析，具體步驟如下：

1、wr1與藍(lán)莓幼苗共培養(yǎng)

將原土與草炭土(1:1v/v)混合，121℃滅菌3hr，加入硫磺調(diào)節(jié)ph值為5.2后，分裝到經(jīng)75％酒精消毒的塑料營(yíng)養(yǎng)缽中，營(yíng)養(yǎng)缽直徑為10cm，高為9cm。將1年生藍(lán)莓幼苗，移栽至上述營(yíng)養(yǎng)缽中，預(yù)培養(yǎng)2周。選取長(zhǎng)勢(shì)一致的藍(lán)莓苗(株高為20±1cm)進(jìn)行接種效應(yīng)分析。設(shè)置接菌實(shí)例組和對(duì)照組，每組各36盆。接菌實(shí)例組：每盆倒入20ml菌液，wr1接種劑的制備同實(shí)施例4；對(duì)照組：未加菌液。藍(lán)莓苗放置在玻璃溫室中培養(yǎng)，條件均為18-25℃，自然光照，環(huán)境濕度為60％-80％，常規(guī)管理。分別在接種后0天、30天、60天、90天時(shí)測(cè)定藍(lán)莓苗株高、葉片數(shù)，地上部分干重。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，接菌實(shí)例組和對(duì)照組各取9盆，3個(gè)重復(fù)(3盆/重復(fù))。結(jié)果顯示，接菌實(shí)例組的藍(lán)莓苗株高高于對(duì)照組，葉片數(shù)和地上部分的干重顯著高于對(duì)照組(表1，圖9)。

表1接種wr1對(duì)藍(lán)莓實(shí)生苗生長(zhǎng)的影響

由此可見本發(fā)明菌株wr1對(duì)藍(lán)莓具有促生長(zhǎng)作用，可以制備成包含所述菌株的藍(lán)莓生長(zhǎng)劑，用于實(shí)際藍(lán)莓種植。

sequencelisting

<110>魯東大學(xué)

<120>一株解磷菌根真菌及其在促進(jìn)藍(lán)莓生長(zhǎng)中的應(yīng)用

<130>無(wú)

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>578

<212>dna

<213>minutisphaeraaspera

<400>1

agttgttcgagcggccccaggcatcgccaggtggccgcttagacatcaacaccctctgta60

tatataccgcgttgctttggcgggacggcagccagcagccccgctgggaagctgtccgta120

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