本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生態(tài)微生物的應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及到利用與植物具有密切共生關(guān)系的dse真菌，通過(guò)共培養(yǎng)建立互利共生關(guān)系以提高藍(lán)莓生長(zhǎng)和抗旱能力的方法。

背景技術(shù)：

植物根系與其根際微生物的共生是自然界中一種普遍存在的生物學(xué)現(xiàn)象。深色有隔內(nèi)生真菌(darkseptateendophytes，dse)是一類(lèi)廣泛存在于植物根內(nèi)，并形成深色有隔菌絲的真菌。dse生態(tài)分布極為廣泛，尤其在各種逆境生態(tài)環(huán)境中普遍存在，對(duì)宿主植物在各種逆境生態(tài)系統(tǒng)中的生存發(fā)揮重要作用。dse的研究也因此成為目前國(guó)內(nèi)外菌根研究領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)之一。

藍(lán)莓(vacciniumspp.)又稱(chēng)越橘，為杜鵑花科越橘屬植物，是具有廣闊開(kāi)發(fā)前景的新興果樹(shù)樹(shù)種。藍(lán)莓果實(shí)中富含維生素、花色苷、類(lèi)黃酮等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有延緩衰老、解除視疲勞、增強(qiáng)心臟功能和抗癌的獨(dú)特功效，被譽(yù)為“漿果之王”，藍(lán)莓種植也成為果樹(shù)業(yè)的“朝陽(yáng)”產(chǎn)業(yè)。盡管藍(lán)莓大面積栽培技術(shù)已較成熟，但在藍(lán)莓育苗過(guò)程中仍存在生根困難、生長(zhǎng)緩慢、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)等問(wèn)題。并且，由于藍(lán)莓為淺根系植物，根系纖細(xì)不發(fā)達(dá)，主根不明顯，無(wú)根毛，不能吸收土壤深層的水分，藍(lán)莓容易受到干旱的危害。如何促進(jìn)藍(lán)莓幼苗生長(zhǎng)，提高其抗旱性，成為藍(lán)莓規(guī)?；缂按竺娣e栽培亟需解決的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種從栽培藍(lán)莓的根內(nèi)篩選到的土著dse菌，對(duì)藍(lán)莓苗有顯著促生、抗旱作用。其目的是從保護(hù)生態(tài)環(huán)境和食品安全的角度出發(fā)，提高藍(lán)莓苗的生長(zhǎng)和抗逆性，并且盡可能減少農(nóng)藥、化學(xué)肥料的施用量，符合農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略。

本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：

一株土著dse菌r10，其分類(lèi)命名為phialocephalasp.保藏編號(hào)為cgmccno.13882。

一種含有所述dse菌r10的藍(lán)莓抗旱制劑。

本發(fā)明還提供所述dse菌r10在藍(lán)莓抗旱中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供dse菌r10接種劑的制備方法，將dse菌r10接種到pda平板，28℃倒置培養(yǎng)10天，每種菌打取3塊5mm菌塊，分別接種到分裝后的pda培養(yǎng)液中，28℃震蕩培養(yǎng)15-20天，轉(zhuǎn)速為180rpm；所述分裝后的pda培養(yǎng)液制備：pda培養(yǎng)液分裝到容器中，并放入個(gè)玻璃球，高壓滅菌。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果：

1.本發(fā)明所提供的dse菌株r10，能有效促進(jìn)藍(lán)莓組培苗和實(shí)生苗生長(zhǎng)。

2.在水分脅迫條件下，與未接種對(duì)照組相比，接種本發(fā)明dse真菌r10的藍(lán)莓地上部分生物量、葉片光合速率、sod和pod等保護(hù)酶活性顯著升高，而葉片中的丙二醛和h2o2含量明顯下降，說(shuō)明該菌株可一方面通過(guò)提高宿主植物葉片光合速率來(lái)增加有機(jī)物的積累，另一方面通過(guò)增強(qiáng)保護(hù)酶的活性，有效清除活性氧，降低了干旱脅迫對(duì)膜脂的過(guò)氧化程度，從而提高了藍(lán)莓的抗旱性。

3.本發(fā)明采用dse真菌接種劑提高藍(lán)莓抗旱性的方法，也可以將dse真菌菌劑以拌種的方法用于田間生產(chǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1、對(duì)照組和接菌實(shí)例組藍(lán)莓組培苗生長(zhǎng)狀態(tài)比較；a對(duì)照組，b接種dse菌r10組；

圖2、dse菌r10在藍(lán)莓根部的定植形成的菌絲團(tuán)和微菌核：

a箭頭所指為dse菌r10菌株在藍(lán)莓根部的定植形成的菌絲團(tuán)；

b箭頭所指為dse菌r10在藍(lán)莓根部的定植形成的微菌核；

圖3、dse菌r10菌落正面和背面的形態(tài)；

圖4、dse菌r10菌絲的形態(tài)特征；

圖5、干旱脅迫處理后對(duì)照組和接菌實(shí)例組藍(lán)莓苗抗逆生理指標(biāo)比較。

菌株保藏信息：菌株編號(hào)為r10，其分類(lèi)命名為phialocephalasp.；該菌株保藏于2017年4月11日中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)保藏編號(hào)為：cgmccno.13882。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例來(lái)對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步解釋?zhuān)景l(fā)明的保護(hù)范圍不受實(shí)施例任何形式上的限制。

實(shí)施例1

藍(lán)莓根內(nèi)生真菌的分離、純化，步驟如下：

1、用清水洗凈藍(lán)莓根段，然后將其轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)中進(jìn)行如下操作：將根段浸泡在10％(質(zhì)量比)雙氧水中8min，期間用無(wú)菌鑷子輕輕翻動(dòng)幾次，以保證消毒徹底；無(wú)菌水漂洗2-3次后，將其轉(zhuǎn)入6％(質(zhì)量比)次氯酸鈉，浸泡15分鐘，無(wú)菌水漂洗2次；濾紙吸干根段表面殘留的液體。將消毒后的根段用無(wú)菌的剪刀剪成0.5cm長(zhǎng)的根段，接入制備好的pda平板，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗倒置培養(yǎng)。pda平板的配方：0.6％馬鈴薯浸粉，2％葡萄糖，2％瓊脂，ph5.6。115℃滅菌20分鐘，冷卻至60℃時(shí)，加入無(wú)菌的氨芐青霉素(50ug/ml)和硫酸鏈霉素(100ug/ml),上述各成份濃度均為pda培養(yǎng)基中的終濃度。

2、當(dāng)發(fā)現(xiàn)組織切口處有真菌長(zhǎng)出來(lái)的時(shí)候，盡快用接種針將其挑入不加青霉素和鏈霉素的pda平板中，25℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗倒置進(jìn)行純化培養(yǎng)，轉(zhuǎn)移3-5次后得到純菌落。

實(shí)施例2

促生有益菌根真菌的篩選，具體步驟如下：

1、藍(lán)莓苗的培養(yǎng)

(1)藍(lán)莓芽分化

選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好，株高4-5cm的藍(lán)莓組培苗進(jìn)行快速繁殖。在超凈工作臺(tái)中用無(wú)菌的剪刀將組培瓶中的藍(lán)莓植株從基部剪斷，剪成2-3cm的莖段，然后用無(wú)菌的鑷子將其接到含有分化培養(yǎng)基的組培瓶中，每瓶中接入3-4個(gè)莖段，均勻分散放置。所用的培養(yǎng)基是以wpm培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，在每升wpm培養(yǎng)基中均添加蔗糖20g、瓊脂5-10g，添加植物激素玉米素1.0-3.0mg，培養(yǎng)基ph5.0-5.5，培養(yǎng)容器裝量10-30％，121℃高壓滅菌20min。培養(yǎng)條件設(shè)置為23-25℃，2000-3000lx的光強(qiáng)，光照時(shí)間8-16h/天，培養(yǎng)時(shí)間40-60天。

(2)藍(lán)莓生根培養(yǎng)

在超凈工作臺(tái)中，選取步驟(1)高6cm生長(zhǎng)狀態(tài)良好的藍(lán)莓組培苗進(jìn)行生根培養(yǎng)。用無(wú)菌的剪刀從藍(lán)莓組培苗的基部剪斷，然后用無(wú)菌的鑷子將剪斷的植株插入帶有濾紙球的生根培養(yǎng)基中，植株插的深度以植株底部剛浸入培養(yǎng)基為宜，每瓶液體培養(yǎng)基中接入6-10株藍(lán)莓苗。所用培養(yǎng)基為1/2wpm培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，然后加入蔗糖20g，吲哚丁酸1-2.5mg，定容到1升，調(diào)培養(yǎng)基的ph為5.0-5.5。將配好的液體培養(yǎng)基倒入裝有濾紙球的組培瓶中，培養(yǎng)容器裝量10-30％(體積比)，121℃高壓滅菌20min。濾紙球以鋪滿(mǎn)組培瓶的底部以便于固定藍(lán)莓幼苗。培養(yǎng)條件設(shè)置為23-25℃，2000-3000lx的光強(qiáng)，光照時(shí)間8-16h/天，培養(yǎng)時(shí)間40-60天。

2、接種劑的制備

選取15株上述實(shí)例1純化的內(nèi)生真菌，分別接種到pda平板，28℃倒置培養(yǎng)10天。每種菌打取3塊5mm菌塊，分別接種到分裝后的pda培養(yǎng)液中，28℃震蕩培養(yǎng)15-20天，轉(zhuǎn)速為180rpm。所述分裝后的pda培養(yǎng)液制備：pda培養(yǎng)液分裝到500ml三角瓶中，每瓶分裝100-200ml，并放入10-20個(gè)玻璃球，121℃高壓滅菌20min。

3、回接藍(lán)莓組培苗，篩選促生菌根真菌

(1)共培養(yǎng)基質(zhì)的準(zhǔn)備

先將干苔蘚剪短，用清水洗凈，在蒸餾水中浸泡過(guò)夜，讓其充分吸水，ph5.5再分裝到組培瓶中，容器裝量為15％-25％(體積比)，121℃高壓滅菌30min，備用。

(2)菌株與藍(lán)莓組培苗共培養(yǎng)

將生根藍(lán)莓苗用無(wú)菌的鑷子接入上述制備共培養(yǎng)基質(zhì)中，再用移液槍加入4-6ml上述制備的各菌種接種劑。吸取前，需要將接種劑晃動(dòng)混勻。移液槍頭前端需剪掉2-3mm，并滅菌后才能使用。接種后，放至25℃，2000-3000lx的光強(qiáng)，光照時(shí)間8-16hr/天條件下進(jìn)行共培養(yǎng)60天后，觀察接種菌株對(duì)藍(lán)莓苗生長(zhǎng)的影響。每種菌設(shè)3次重復(fù)，每重復(fù)5瓶藍(lán)莓組培苗。

結(jié)果顯示，篩選到一株真菌，命名為r10，對(duì)藍(lán)莓組培苗根、莖、葉生長(zhǎng)均有明顯促生效應(yīng)(圖1)。取部分根段，檢測(cè)真菌r10在藍(lán)莓組培苗根部的定植情況。將根段放入提前配制好的faa固定液中固定12小時(shí)，沖洗后脫色。所述的脫色方法為經(jīng)過(guò)10％(g/ml)koh透明、10％(質(zhì)量比)h2o2漂白、1％(質(zhì)量比)hcl酸化、0.05％(g/ml)臺(tái)盼藍(lán)染色和50％(體積比)甘油脫色。隨機(jī)選取藍(lán)莓根段，在顯微鏡下鏡檢觀察。圖2示在藍(lán)莓根的皮層細(xì)胞中可看到菌絲和微菌核，表明r10可侵入宿主植物根內(nèi)。此外，取接種的藍(lán)莓苗的根樣，從中只分離得到與接種劑相同的菌株，進(jìn)一步證明上述接菌的藍(lán)莓苗所表現(xiàn)出的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)是真菌r10藍(lán)莓根部定植引起的。

實(shí)施例3

dse菌株的形態(tài)和分子生物學(xué)鑒定，步驟如下:

1、挑取上述保存的純化菌種，接種到pda平板中，于25-30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)活化1-2周。用直徑為0.5cm的無(wú)菌打孔器從菌落的最外層打取菌餅，接種到新的pda平板上，于25-30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周，觀察菌落的形態(tài)。菌落為白色，薄氈狀，平展，邊緣光滑，菌落反面為淡黃色(圖3)。

2、用接種針挑取少量純化后的單菌落菌絲，將其放入滴有一滴生理鹽水的載玻片上制成臨時(shí)裝片，并在顯微鏡下觀察內(nèi)生真菌的菌絲結(jié)構(gòu)。菌絲有隔，易聚集成束，能產(chǎn)生孢子，分生孢子梗及黏連在一起的孢子形成頭形結(jié)構(gòu)。(圖4)。

3、對(duì)菌種進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。采用全式金的plantgenomicdnakit試劑盒提取培養(yǎng)菌絲的基因組dna，擴(kuò)增引物是its1：5′-tccgtaggtgaacctgcgg-3′和its4：5′-tcctccgcttattgatatgc-3′。pcr反應(yīng)體系(25μl)包括：2.5μl10×pcr緩沖液(含mg²⁺)，2μldntp(2.5mmeach)，1.5μlits1(10μm)，1.5μlits4(10μm)，0.2μltaq酶，2μl基因組dna，15.3μlddh2o，。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min，循環(huán)1次；94℃變性1min，51℃退火1min，72℃延伸1min，35次循環(huán)；最后72℃延伸10min。pcr擴(kuò)增產(chǎn)物寄至北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。將獲得的rdna基因間內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列，即its序列(internallytranscribedspacer)，與美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)(ncbi，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的序列進(jìn)行blastn比對(duì)，與一株helotialessp.(ab847035)最為相似，最大相似度達(dá)98％。該菌種編號(hào)為r10，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定為一株phialocephalasp.，已在中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter,cgmcc)保藏，其保藏號(hào)為cgmccno.13882。測(cè)序結(jié)果：taccttcgggtataccccatccgtgtctacatactcttgttgctttggcaggccgtggtctcccactgtgggctctgcctgcatgtgcctgccagaggaccaaactctgaatgttagtgatgtctgagtactatataatagttttaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatatgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcacccggtggtattccgccgggtatgcctgttcgagcgtcattatcgccactcaagcctgtcttggtgatggggattgcgaatcttgcagccctagagtccaggagcgtcacctgtaggtcctacgcgtagtaatttctcctcgctacagagcctgccggtggatagtgtaaatccagttaagtctgtgtgtcctgctattaaacccccaaattttaaaaggttgacctcggatcaagtag。

實(shí)施例4

dse菌對(duì)藍(lán)莓實(shí)生苗的接種效應(yīng)分析，具體步驟如下：

1、dse真菌與藍(lán)莓幼苗共培養(yǎng)

共培養(yǎng)基質(zhì)為苔蘚與草炭土，按重量比例1:1混勻，高壓蒸汽滅菌鍋121℃，滅菌2hr，分裝到經(jīng)75％酒精消毒的塑料營(yíng)養(yǎng)缽中，營(yíng)養(yǎng)缽直徑為10cm，高為9cm。選取長(zhǎng)勢(shì)一致的1年生藍(lán)莓幼苗，移栽至上述營(yíng)養(yǎng)缽中。設(shè)置接菌實(shí)例組和對(duì)照組，每組30盆。接菌實(shí)例組：每盆倒入10-15mldse菌液，dse接種劑的制備同實(shí)施例4。對(duì)照組：未加菌液。藍(lán)莓苗放置在玻璃溫室中培養(yǎng)，條件均為18-25℃，自然光照，環(huán)境濕度為60％-80％。常規(guī)管理30天后，進(jìn)行干旱處理。

2、dse真菌提高藍(lán)莓抗旱的效果

對(duì)上述接菌實(shí)例組和對(duì)照組進(jìn)行盆栽控水，模擬干旱脅迫，以有效、定量的研究dse真菌提高藍(lán)莓抗旱的效果。利用每天稱(chēng)重澆水的方法進(jìn)行控水處理，其中正常水分為田間持水量的80％，干旱處理為田間持水量的40％。接菌實(shí)例組和對(duì)照組每個(gè)處理均為3次重復(fù)(5盆/重復(fù))。除進(jìn)行不同水分處理外，均進(jìn)行常規(guī)管理，60天后進(jìn)行各指標(biāo)的測(cè)定。

表1示無(wú)論在正常水分還是水分脅迫條件下，接菌組的藍(lán)莓苗地上部分生物量和光合速率均顯著高于對(duì)照組，表明在這兩種情況下，dse真菌均可通過(guò)促進(jìn)光合速率增加有機(jī)物的積累，促進(jìn)藍(lán)莓苗生長(zhǎng)。但與正常供水相比，水分脅迫條件下，r10的侵染率有所下降。但圖5示在正常水分條件下，接菌實(shí)例組和對(duì)照組的藍(lán)莓葉片中丙二醛含量差異不大，而在水分脅迫條件下，接菌實(shí)例組藍(lán)莓葉片中的丙二醛含量明顯低于對(duì)照組。丙二醛含量是植物細(xì)胞膜質(zhì)過(guò)氧化程度的體現(xiàn)，丙二醛含量高，說(shuō)明植物細(xì)胞膜質(zhì)過(guò)氧化程度高，細(xì)胞膜受到的傷害嚴(yán)重。同時(shí)，無(wú)論在正常水分還是水分脅迫條件下，接菌組的藍(lán)莓葉片中過(guò)氧化氫(h2o2)量均低于對(duì)照組，而超氧化物歧化酶(sod)和過(guò)氧化物酶(pod)活性均高于對(duì)照組，說(shuō)明dse接種可通過(guò)增強(qiáng)藍(lán)莓苗中抗氧化酶sod和pod的活性提高其抗旱性。sod和pod是植物體中重要的保護(hù)酶類(lèi)，參與清除植物體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧，其活性越高，越有利于植物抗旱。

表1

sequencelisting

<110>魯東大學(xué)

<120>一種dse菌及其在提高藍(lán)莓生長(zhǎng)及抗旱中的應(yīng)用

<130>無(wú)

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>499

<212>dna

<213>phialocephalasp.

<400>1

taccttcgggtataccccatccgtgtctacatactcttgttgctttggcaggccgtggtc60

tcccactgtgggctctgcctgcatgtgcctgccagaggaccaaactctgaatgttagtga120

tgtctgagtactatataatagttttaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcg180

atgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatatgaattgcagaattcagtgaatcatcga240

atctttgaacgcacattgcacccggtggtattccgccgggtatgcctgttcgagcgtcat300

tatcgccactcaagcctgtcttggtgatggggattgcgaatcttgcagccctagagtcca360

ggagcgtcacctgtaggtcctacgcgtagtaatttctcctcgctacagagcctgccggtg420

gatagtgtaaatccagttaagtctgtgtgtcctgctattaaacccccaaattttaaaagg480

ttgacctcggatcaagtag499