本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及谷氨酸棒桿菌中一種基因連續(xù)無痕敲除的方法。

背景技術(shù)：

谷氨酸棒桿菌(corynebacteriumglutamicum)被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)l-氨基酸，維他命，燃料乙醇以及其他的有機(jī)酸等產(chǎn)品中，目前主要通過代謝工程及合成生物學(xué)的方法在谷氨酸棒桿菌中完成相應(yīng)代謝產(chǎn)物的積累，因此連續(xù)無痕敲除的方法顯得尤為重要。在谷氨酸棒桿菌的模式菌株atcc13032中，反向篩選標(biāo)記系統(tǒng)，cre-loxp重組系統(tǒng)，rect介導(dǎo)的單鏈dna重組系統(tǒng)以及crispri干擾系統(tǒng)等方法已經(jīng)成功的運(yùn)用于靶標(biāo)基因的無痕敲除，點(diǎn)突變及抑制靶標(biāo)基因表達(dá)中，為相關(guān)生產(chǎn)菌株的構(gòu)建奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

然而，在谷氨酸棒桿菌的模式菌株atcc13032中，廣泛應(yīng)用的sacb反向篩選技術(shù)，需要在整合型質(zhì)粒的幫助下通過兩輪的交換才能完成靶標(biāo)基因的同源重組；該方法雙交換的概率低，耗時(shí)久，完成一個(gè)基因的敲除需要10～13天。rect介導(dǎo)的單鏈dna重組系統(tǒng)為基因組中的點(diǎn)突變提供一種非常有效的方法，但是當(dāng)前能有效的篩選正確重組子的方法非常有限。crispri干擾系統(tǒng)為有效干擾靶標(biāo)基因的表達(dá)提供一種非常有效的方法，但是該方法目前僅限于抑制靶標(biāo)基因的表達(dá)；利用cre-loxp重組系統(tǒng)，在谷氨酸棒桿菌中的靶標(biāo)基因的同源重組需要設(shè)計(jì)兩個(gè)質(zhì)粒以及兩輪的轉(zhuǎn)化，過程繁瑣。這使快速高效地構(gòu)建谷氨酸棒桿菌相關(guān)生產(chǎn)菌株進(jìn)入瓶頸，而迫切需要在谷氨酸棒桿菌中建立一種有效快速的基因連續(xù)無痕敲除的方法。

在一些能夠通過自身的重組系統(tǒng)完成外源線性雙鏈dna的同源重組的菌株中，通過構(gòu)建外源線性雙鏈dna完成靶標(biāo)基因的敲除的方法，過程簡單，省時(shí)。但是谷氨酸棒桿菌自身重組系統(tǒng)的限制，在沒有整合型質(zhì)粒協(xié)助的情況下，發(fā)生同源重組的概率很低。這使在谷氨酸棒桿菌中的同源重組需要通過整合型質(zhì)粒介導(dǎo)來完成，而使整個(gè)敲除過程繁瑣冗長。針對這個(gè)問題，利用核酸外切酶-重組酶協(xié)助外源線性雙鏈dna重組的系統(tǒng)，給簡化谷氨酸棒桿菌的同源重組提供有效方法。

基于大腸桿菌rec噬菌體的recet系統(tǒng)(receproteinid：np_415866.1；rectproteinid：np_415865.1)是協(xié)助完成外源線性雙鏈dna同源重組的核酸外切酶-重組酶系統(tǒng)中的典型。該系統(tǒng)由兩種蛋白組成，rece和rect組成：rece是一種雙鏈dna依賴的核酸外切酶，結(jié)合在5′-3′線性雙鏈dna的末端，從5′端向3′端降解dna，產(chǎn)生3′端突出端；rect是單鏈退火蛋白，結(jié)合在單鏈dna上，介導(dǎo)互補(bǔ)單鏈dna退火，能夠有效的實(shí)現(xiàn)單鏈dna的重組。此外recet功能相似的核酸外切酶-重組酶也具有類似的功能，例如orf47+orf48(orf47proteinid：cab53837.1；orf48proteinid：cab53838.1)、orfb+orfc(orfbproteinid：cac33455.1；orfcproteinid：cac33454.1)及orf60+orf61(orf60proteinid：aan12619.1；orf61proteinid：aan12618.1)。

cre/mutantlox特異位點(diǎn)重組系統(tǒng)在連續(xù)無痕敲除的方法中廣泛應(yīng)用。cre/mutantlox特異位點(diǎn)重組系統(tǒng)由cre重組酶(genbankaccessionald15663.1)和突變的loxp序列(loxp71：5′-taccgttcgtatagcatacattatacgaagttat-3′和loxp66：5′-ataacttcgtatagcatacattatacgaacggta-3′)兩部分組成。cre重組酶能夠特異性地識別loxp序列，當(dāng)兩個(gè)loxp位點(diǎn)位于一條dna鏈上且方向相同時(shí)，cre重組酶催化loxp71和loxp66位點(diǎn)間的dna進(jìn)行精確的位點(diǎn)特異性重組，完成loxp位點(diǎn)間序列的剪切，留下不被cre重組酶識別的loxp72(序列：5′-taccgttcgtatagcatacattatacgaacggta-3′)。這對簡化谷氨酸棒桿菌基因無痕敲除的過程具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的目的在于提供谷氨酸棒桿菌中一種基因連續(xù)無痕敲除的方法。該方法簡單有效，簡化了谷氨酸棒桿菌基因無痕敲除的過程。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

谷氨酸棒桿菌中一種基因連續(xù)無痕敲除的方法，包括以下步驟：

(1)構(gòu)建核酸外切酶-重組酶表達(dá)的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入谷氨酸棒桿菌的感受態(tài)細(xì)胞中；

(2)制備同時(shí)含有靶標(biāo)基因1的左同源臂及l(fā)oxp71序列，cre酶表達(dá)盒及谷氨酸棒桿菌中有效的抗性篩選標(biāo)記表達(dá)盒，loxp66序列及靶標(biāo)基因1的右同源臂的自我切割線性敲除表達(dá)盒；

(3)制備核酸外切酶-重組酶表達(dá)的的谷氨酸棒桿菌感受態(tài)細(xì)胞；

(4)將步驟(2)中的自我切割線性敲除表達(dá)盒轉(zhuǎn)化入步驟(3)中制備的感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于相應(yīng)的抗性篩選平板；

(5)將鑒定成功的陽性轉(zhuǎn)化子接種于誘導(dǎo)cre酶表達(dá)的液體培養(yǎng)基，誘導(dǎo)cre酶表達(dá)，執(zhí)行l(wèi)oxp71和loxp66序列間的dna的剪切，剔除cre酶表達(dá)盒及kan抗性表達(dá)盒；

(6)將誘導(dǎo)培養(yǎng)后的菌液劃線分離單菌落；單菌落點(diǎn)板于含以及不含自我切割線性敲除表達(dá)盒中相應(yīng)抗性的平板進(jìn)行篩選；

(7)將步驟(6)中鑒定正確的菌株進(jìn)行pcr及測序驗(yàn)證，成功獲取靶標(biāo)基因1無痕敲除的菌株，即含有核酸外切酶-重組酶表達(dá)質(zhì)粒的靶標(biāo)基因1無痕敲除菌株。

為了更好的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，還包括：

(8)制備同時(shí)含有靶標(biāo)基因2的左同源臂及l(fā)oxp71序列，cre酶表達(dá)盒及谷氨酸棒桿菌中有效的抗性篩選標(biāo)記表達(dá)盒，loxp66序列及靶標(biāo)基因2的右同源臂的自我切割線性敲除表達(dá)盒；

(9)制備核酸外切酶-重組酶表達(dá)的靶標(biāo)基因1無痕敲除菌株的谷氨酸棒桿菌感受態(tài)細(xì)胞，并按照上述步驟(4)～(7)完成靶標(biāo)基因2的連續(xù)無痕敲除；依次類推，完成多個(gè)靶標(biāo)基因的連續(xù)無痕敲除。

所述的核酸外切酶-重組酶，除了recet，還可以是在谷氨酸棒桿菌中功能類似的核酸外切酶-重組酶，例如：orf47+orf48或orfb+orfc或gp60+gp61。

所述的自我剪切敲除表達(dá)盒，在相同質(zhì)量的線性雙鏈dna的條件下左右同源臂長度最佳長度為500～1000bp。

具體的，

谷氨酸棒桿菌中一種基因連續(xù)無痕敲除的方法，具體包括以下步驟(圖1)：

(1)構(gòu)建異丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)可誘導(dǎo)的核酸外切酶-重組酶recet表達(dá)的質(zhì)粒pec-xc99e-recet(氯霉素抗性)，轉(zhuǎn)化入谷氨酸棒桿菌的感受態(tài)細(xì)胞中；

(2)通過重疊延伸pcr的方法制備同時(shí)含有長度在500～1000bp的靶標(biāo)基因1的左同源臂及l(fā)oxp71序列(片段1)，茶堿可誘導(dǎo)的cre酶表達(dá)盒及kan抗性篩選標(biāo)記表達(dá)盒(片段2)，loxp66序列及長度在500～1000bp的靶標(biāo)基因1的右同源臂(片段3)的自我切割線性敲除表達(dá)盒；

(3)制備已誘導(dǎo)pec-xc99e-recet表達(dá)的的谷氨酸棒桿菌感受態(tài)細(xì)胞；

(4)將步驟(2)中的自我切割線性敲除表達(dá)盒轉(zhuǎn)化入步驟(3)中制備的感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有卡那霉素25μg/ml和氯霉素7.5μg/ml的lbh固體平板(lbh+kan25+chl7.5)；

(5)將鑒定成功的陽性轉(zhuǎn)化子接種于含1mm茶堿及氯霉素7.5μg/ml的bhi液體培養(yǎng)基，誘導(dǎo)cre酶表達(dá)，執(zhí)行l(wèi)oxp71和loxp66序列間的dna的剪切，剔除cre酶表達(dá)盒及kan抗性表達(dá)盒；

(6)將誘導(dǎo)培養(yǎng)后的菌液劃線于含1mm茶堿及氯霉素7.5μg/ml的bhi平板(bhi+chl7.5+1mm茶堿)，分離單菌落；單菌落分別點(diǎn)板于同時(shí)含卡那霉素25μg/ml和氯霉素7.5μg/ml的含bhi平板(bhi+kan25+chl7.5)及僅含氯霉素7.5μg/ml的bhi平板(bhi+chl7.5)進(jìn)行篩選；在bhi+kan25+chl7.5平板上不生長，bhi+chl7.5平板上生長的菌落為初步鑒定為成功剔除cre酶表達(dá)盒及kan抗性表達(dá)盒的無痕敲除菌株；

(7)將步驟(6)中鑒定正確的菌株進(jìn)行pcr及測序驗(yàn)證，成功獲取靶標(biāo)基因1無痕敲除的菌株，即：含有核酸外切酶-重組酶recet表達(dá)質(zhì)粒的靶標(biāo)基因1無痕敲除菌株。

為了更好的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，還包括：

(8)通過重疊延伸pcr的方法制備同時(shí)含有長度在500～1000bp的靶標(biāo)基因2的左同源臂及l(fā)oxp71序列(片段1)，茶堿可誘導(dǎo)的cre酶表達(dá)盒及kan抗性篩選標(biāo)記表達(dá)盒(片段2)，loxp66序列及長度在500～1000bp的靶標(biāo)基因2的右同源臂(片段3)的自我切割線性敲除表達(dá)盒；

(9)制備核酸外切酶-重組酶recet表達(dá)的靶標(biāo)基因1無痕敲除菌株的感受態(tài)細(xì)胞，并按照上述步驟(4)～(7)完成靶標(biāo)基因2的連續(xù)無痕敲除；依次類推，完成多個(gè)靶標(biāo)基因的連續(xù)無痕敲除。

本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，首先確定核酸外切酶-重組酶recet、orf47+orf48、orfb+orfc及orf60+orf61分別在谷氨酸棒桿菌中對線性雙鏈dna表達(dá)盒的重組效率及recet對線性雙鏈dna重組的最佳同源臂長度。

在本發(fā)明中的具體實(shí)施方案中，將構(gòu)建的δargr自我切割線性敲除表達(dá)盒，轉(zhuǎn)化入14067-recet的感受態(tài)細(xì)胞中，完成基因argr(genbanknumber354510801)的無痕敲除。

在本發(fā)明中的具體實(shí)施方案中，將構(gòu)建的δcrtb自我切割線性敲除表達(dá)盒轉(zhuǎn)化入argr無痕敲除菌株的感受態(tài)細(xì)胞中，完成在基因argr的無痕敲除的基礎(chǔ)上crtb基因(genbanknumber：658107612)的連續(xù)無痕敲除。

在本發(fā)明中的具體實(shí)施方案中，另外分別構(gòu)建基因ncgl1221(genbanknumber：658108254)，prob(genbanknumber：658109122)的自我切割線性敲除表達(dá)盒，轉(zhuǎn)化入recet表達(dá)的感受態(tài)細(xì)胞中，分析recet對線性自我切割敲除表達(dá)盒的重組效率；通過茶堿誘導(dǎo)cre切除篩選標(biāo)記，測定無痕剪切的效率。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

本發(fā)明在谷氨酸棒桿菌中構(gòu)建了核酸外切酶-重組酶-cre/loxp連續(xù)無痕敲除系統(tǒng)，以recet-cre/loxp連續(xù)無痕敲除系統(tǒng)最佳。本方法在谷氨酸棒桿菌中的同源重組不需要質(zhì)粒的介導(dǎo)，在recet的協(xié)助下僅需轉(zhuǎn)化入線性雙鏈dna即可完成同源重組；僅需要一輪轉(zhuǎn)化，即可完成靶標(biāo)基因的無痕敲除，整個(gè)無痕敲除過程僅需4～6天，同時(shí)能夠完成基因的連續(xù)無痕敲除；利用抗性基因作為篩選標(biāo)記篩選過程簡單有效，相對于谷氨酸棒桿菌中的其他無痕敲除的方法更加簡單，有效且節(jié)省時(shí)間。

附圖說明

圖1是利用recet-cre/loxp系統(tǒng)完成谷氨酸棒桿菌基因連續(xù)無痕敲除的方法示意圖；其中，lbh+chl7.5+kan2.5表示含有氯霉素的濃度為7.5μg/ml和卡那霉素濃度為25μg/ml的lbh培養(yǎng)基；bhi+chl7.5+1mm茶堿表示含有氯霉素的濃度為7.5μg/ml和茶堿濃度為1mm的bhi培養(yǎng)基。

圖2是在谷氨酸棒桿菌中不同核酸外切酶-重組酶對線性雙鏈dna的重組效率；其中，同源臂長度為400bp的crtb基因的左右同源臂和抗性篩選標(biāo)記kan表達(dá)盒融合的線性雙鏈dna表達(dá)盒被用來測試不同核酸外切酶-重組酶對線性雙鏈dna同源重組的效率；每組實(shí)驗(yàn)至少做三組平行。

圖3是不同同源臂長度對recet同源重組效率的影響；其中，長度為100，200，300，400，500，800，1000，1200，1500，2000bp的crtb基因的左右同源臂和抗性篩選標(biāo)記kan表達(dá)盒融合的線性雙鏈dna表達(dá)盒被用來測試不同同源臂長度對recet同源重組效率的影響；每組實(shí)驗(yàn)至少做三組平行。

圖4是谷氨酸棒桿菌atcc14067-xc99e-recet中基因argr的無痕敲除；其中，圖a，δargr自我切割線性表達(dá)盒在atcc14067-xc99e-recet中的同源重組；mcargr：基因argr被4335bp的δargr自我切割線性表達(dá)盒替換；圖b，基因argr無痕敲除菌株的鑒定；margr：基因argr被34bp的loxp72序列替換。

圖5是谷氨酸棒桿菌atcc14067-recet-margr中基因crtb的無痕敲除；其中，margr-crtb：基因argr和crtb被34bp的loxp72序列替換；pr：引物δargr-jd-s，δargr-jd-a；pc：引物δcrtb-jd-s，δcrtb-jd-a。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

本發(fā)明所使用的實(shí)驗(yàn)材料若無特別說明均為市售購買產(chǎn)品。

實(shí)施例1核酸外切酶-重組酶在谷氨酸棒桿菌中對線性雙鏈dna的重組

一、核酸外切酶-重組酶表達(dá)的谷氨酸棒桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備

設(shè)計(jì)引物rect/rece-s：5′-caaaaaggaggcccttcagatgagcacaaaaccactcttc-3′及rect/rece-a：5′-ggcaccaataactgccttaattattcctctgaattatcga-3′，擴(kuò)增基因rect+rece；

設(shè)計(jì)引物orfc/orfb-s：5′-caaaaaggaggcccttcagatgacaaaattatgttttagtg-3′，orfc/orfb-a：5′-ggcaccaataactgccttaattaagccttatcctgattagt-3′，擴(kuò)增基因orfc+orfb；

設(shè)計(jì)引物orf48/orf47-s：5′-caaaaaggaggcccttcagatggctattgcaaaagaaaagac-3′，orf48/orf47-a：5′-ggcaccaataactgccttaattagatcattgacccttgaacc-3′，擴(kuò)增orf48+orf47基因；

設(shè)計(jì)引物gp60/61-s：5′-acaaaaaggaggcccttcagatgagtgtgcccacacaggacgga-3′，gp60/61-a：5′-ggcaccaataactgccttaatcatgcgttgggcccgtcgaacat-3′，擴(kuò)增gp60+gp61基因；

設(shè)計(jì)引物pec-a：5′-ctgaagggcctcctttttgttatccg-3′及pec-s：5′-ttaaggcagttattggtgcccatgcg-3′，擴(kuò)增pec-xc99e(genbanknumber：ay219682)的骨架序列；

將上述基因片段rect+rece、orfc+orfb、orf48+orf47及gp60+gp61分別和pec-xc99e的骨架序列用nebuilderhifidnaassemblymastermix(購自newenglandbiolabs)試劑盒進(jìn)行組裝，構(gòu)建核酸外切酶-重組酶誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒pec-xc99e-recet、pec-xc99e-orf47/orf48、pec-xc99e-orfb/orfc和pec-xc99e-gp60/61。將成功構(gòu)建的pec-xc99e-recet、pec-xc99e-orf47/orf48、pec-xc99e-orfb/orfc和pec-xc99e-gp60/61質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化入谷氨酸棒桿菌atcc14067感受態(tài)細(xì)胞中，并分別制備核酸外切酶-重組酶表達(dá)的感受態(tài)細(xì)胞atcc14067-xc99e-recet、atcc14067-xc99e-orf47/orf48、atcc14067-xc99e-orfb/orfc和atcc14067-xc99e-gp60/61。

以菌株atcc14067-xc99e-recet為例，描述制備核酸外切酶-重組酶表達(dá)的atcc14067感受態(tài)細(xì)胞的方法。首先，接種atcc14067-xc99e-recet的單菌落于含7.5μg/ml氯霉素的bhi液體培養(yǎng)基，過夜搖菌；將上述的菌體轉(zhuǎn)接入30mlepo培養(yǎng)基(含7.5μg/ml氯霉素和1mmiptg)，控制起始o(jì)d≈0.3，30℃，250rpm培養(yǎng)3～4h后，使od在0.9左右；將菌液轉(zhuǎn)移至滅菌的50ml離心管中，冰上放置20min；4℃、4000rpm離心10min，去上清，收集菌體；用預(yù)冷的10％甘油30ml重懸菌體，重復(fù)本步驟2次；用400μl預(yù)冷的10％甘油重懸細(xì)胞，分裝于預(yù)冷的ep管中，每管分裝80μl。

二、含同源臂及篩選標(biāo)記的線性雙鏈dna的制備

設(shè)計(jì)引物crtb-l-s：5′-taataggtacgccagaccaaaagg-3′，crtb-l-a：5′-atgaagacatcaactacaactcca-3′，以atcc14067基因組為模板，擴(kuò)增2487bp的crtb基因的左同源臂；

設(shè)計(jì)引物crtb-r-a：5′-catcgcctatgctcgaaatactgc-3′，crtb-r-s：5′-tcatagctgagcctgcttctggta-3′，以atcc14067基因組為模板，擴(kuò)增2581bp的crtb基因的右同源臂；

設(shè)計(jì)引物kan-crtb-a：5′-agaagcaggctcagctatgaatgggttaaaaaggatcgatcctc-3′，kan-crtb-s：5′-gttgtagttgatgtcttcatcgcaagcgcaaagagaaagcaggt-3′，擴(kuò)增質(zhì)粒pec-k18mob2(genbanknumber：af445080)上1103bp的kan抗性篩選標(biāo)記表達(dá)盒；

設(shè)計(jì)引物pbs-crtb-a：5′-ttggtctggcgtacctattattgttatccgctcacaattccacac-3′，pbs-crtb-s：5′-atttcgagcataggcgatgatgcaggaattcgatatcaagctta-3′，擴(kuò)增2877bp的pbluescriptiisk(+)(購自stratagene)質(zhì)粒骨架序列。

用nebuilderhifidnaassemblymastermix(購自newenglandbiolabs)試劑盒通過同源重組的方法將上述四個(gè)片段進(jìn)行組裝，構(gòu)建質(zhì)粒pbs-crtb-l/r-kan質(zhì)粒，用于擴(kuò)增含有kan篩選標(biāo)記表達(dá)盒及同源臂長度分別為100，200，300，400，500，800，1000，1200，1500和2000bp的線性雙鏈dna表達(dá)盒crtb/100-kan，crtb/200-kan，crtb/300-kan，crtb/400-kan，crtb/500-kan，crtb/800-kan，crtb/1000-kan，crtb/1200-kan，crtb/1500-kan，crtb/2000-kan。

三、不同核酸外切酶-重組酶對線性雙鏈dna的重組

將構(gòu)建的crtb基因同源臂長度為400bp的線性雙鏈雙鏈dna表達(dá)盒crtb/400-kan分別電擊轉(zhuǎn)化入核酸外切酶-重組酶表達(dá)的atcc14067-xc99e-recet，atcc14067-xc99e-orf47/orf48，atcc14067-xc99e-orfb/orfc和atcc14067-xc99e-gp60/61感受態(tài)細(xì)胞中。電擊轉(zhuǎn)化的方法如下：(1)吸取預(yù)冷的線性雙鏈dna，加入核酸外切酶-重組酶表達(dá)的感受態(tài)細(xì)胞中，彈壁使其混勻，冰浴5～10min；(2)將上述混合物加入預(yù)冷的電擊杯中，1.8kv，5ms電擊3次，加入6mllbh恢復(fù)培養(yǎng)基(含7.5μg/ml的氯霉素)，46℃水浴6min，30℃，250rpm復(fù)蘇培養(yǎng)5h；(3)4000rpm，離心10min，收集菌體；(4)棄上清，剩余200μl液體，重懸菌體，涂布于lbh+kan25+chl7.5固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)36～48h。計(jì)數(shù)平板上的菌落個(gè)數(shù)，pcr鑒定分析菌落的重組情況，結(jié)果表明核酸外切酶-重組酶recet、orf47+orf48、orfb+orfc及gp60+gp61均能在谷氨酸棒桿菌中協(xié)助完成線性雙鏈dna的同源重組，且核酸外切酶-重組酶recet的效果最好，結(jié)果見圖2。

四、500～1000bp的同源臂長度提高核酸外切酶-重組酶recet對的線性雙鏈dna的同源重組效率

將500ng不同同源臂長度的線性雙鏈dna表達(dá)盒crtb/100-kan，crtb/200-kan，crtb/300-kan，crtb/400-kan，crtb/500-kan，crtb/800-kan，crtb/1000-kan，crtb/1200-kan，crtb/1500-kan和crtb/2000-kan分別轉(zhuǎn)化入recet表達(dá)的atcc14067-xc99e-recet的感受態(tài)細(xì)胞中，30℃培養(yǎng)36～48h后計(jì)數(shù)平板上的菌落個(gè)數(shù)，pcr鑒定分析菌落的重組情況。結(jié)果表明，在谷氨酸棒桿菌中，在相同質(zhì)量的線性雙鏈dna的條件下，同源臂長度在500～1000bp左右，核酸外切酶-重組酶recet對線性雙鏈dna的同源重組的效率最佳(圖3)。

實(shí)施例2單基因無痕敲除菌株atcc14067-recet-margr的獲得

一、自我剪切的線性雙鏈dna敲除表達(dá)盒δargr的制備

設(shè)計(jì)引物pbs-kan-s：5′-tcgatcctttttaacccattgcaggaattcgatatcaag-3′，pbs-cre-a：5′-gcgacacgaattatgcagtttgttatccgctcacaattc-3′，擴(kuò)增2875bp的質(zhì)粒pbluescriptiisk(+)骨架片段；

設(shè)計(jì)引物theoe-cre-s：5′-actgcataattcgtgtcgctcaag-3′，theoe-cre-a：5′-ctttgcgcttgcgcggaattaattcatgagcg-3′，擴(kuò)增1594bp的誘導(dǎo)型cre酶表達(dá)盒；

設(shè)計(jì)引物kan-s：5′-aattaattccgcgcaagcgcaaagagaaagca-3′，

kan-a：5′-atgggttaaaaaggatcgatcctc-3′，擴(kuò)增1074bp的kan抗性篩選標(biāo)記表達(dá)盒；

將上述三個(gè)片段膠回收后用nebuilderhifidnaassemblymastermix(newenglandbiolabs)試劑盒進(jìn)行組裝，得到通用質(zhì)粒pbs-cre-kan。

設(shè)計(jì)通用引物c-k-loxp66：5′-taccgttcgtataatgtatgctatacgaagttatatgggttaaaaaggatcgatcc-3′，c-k-loxp71：5′-taccgttcgtatagcatacattatacgaagttatactgcataattcgtgtcgctca-3′，以通用質(zhì)粒pbs-cre-kan為模板擴(kuò)增左端含有l(wèi)oxp71序列，右端含有l(wèi)oxp66序列的2712bp的通用的cre-kan表達(dá)盒(片段2)(圖1)；

設(shè)計(jì)引物argr-l-s：5′-tcaactcgtactcgcttctccttc-3′，argr-l-loxp71：5′-tgcagtataacttcgtataatgtatgctatacgaacggtagtcttacctcggctggttggc-3′，以atcc14067的基因組為模板，擴(kuò)增841bp的含有argr基因左同源臂及l(fā)oxp71序列的dna序列(片段r-1)；

設(shè)計(jì)引物argr-r-loxp66：5′-acccatataacttcgtatagcatacattatacgaacggtaagcgcccctagttcaaggcttg-3′，argr-r-a：5′-tgatgacctcatctggagcgttac-3′，擴(kuò)增862bp的含有l(wèi)oxp66及argr基因右同源臂的dna序列(片段r-3)。

以argr-l-s，argr-r-a作為引物，片段r-1，片段2和片段r-3作為模板，重疊延伸pcr擴(kuò)增4335bp的δargr自我剪切線性敲除表達(dá)盒。

二、argr基因的無痕敲除

將上述制備的δargr自我剪切線性敲除表達(dá)盒，1μg轉(zhuǎn)入新鮮制備atcc14067-xc99e-recet的感受態(tài)細(xì)胞中，按照實(shí)施例1中電擊轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化δargr自我剪切線性敲除表達(dá)盒。在抗性平板上，平均有轉(zhuǎn)化子122個(gè)，設(shè)計(jì)引物δargr-jd-s：5′-gttgtcatcaccgatacctgggtatcca-3′，δargr-jd-a：5′-aggtcgagagaaactgcgatgacttcac-3′，對平板上長出的菌落進(jìn)行pcr驗(yàn)證，δargr自我剪切線性敲除表達(dá)盒成功重組的菌株在3265bp處有條帶，野生菌株在1069bp處有條帶(圖4)。挑取約30個(gè)轉(zhuǎn)化子，用引物δargr-jd-s，δargr-jd-a進(jìn)行pcr鑒定，結(jié)果表明94％的轉(zhuǎn)化子均為正確重組的陽性轉(zhuǎn)化子(表1)。

挑取正確重組的轉(zhuǎn)化子，誘導(dǎo)cre酶表達(dá)，執(zhí)行l(wèi)oxp71和loxp66位點(diǎn)間序列的剪切，完成argr基因的無痕敲除。誘導(dǎo)cre酶表達(dá)，執(zhí)行l(wèi)oxp71和loxp66位點(diǎn)間序列的剪切及無痕敲除菌株的篩選方法如下：將驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子，挑取5株，接種于含7.5μg/ml氯霉素及1mm茶堿的bhi液體培養(yǎng)基中，30℃，250rpm，搖菌24h；蘸取菌液，劃線于含1mm茶堿及7.5μg/ml氯霉素的bhi固體培養(yǎng)基上，30℃，培養(yǎng)24h；將上述長出的單菌落分別點(diǎn)板于含bhi+kan25+chl7.5及bhi+chl7.5的平板上，30℃，培養(yǎng)12h后，觀察菌落的生長情況。在僅含氯霉素的平板上生長，同時(shí)在含氯霉素和卡那霉素的平板上不生長(圖4)，初步鑒定有效剔除cre表達(dá)盒及kan篩選標(biāo)記，點(diǎn)板結(jié)果表明100％的cre切割菌株均有效完成loxp位點(diǎn)間dna序列的剪切(表1)；用引物δargr-jd-s，δargr-jd-a進(jìn)一步pcr驗(yàn)證，無痕敲除在600bp左右處有條帶，野生的對照菌株在1100bp左右處有條帶(圖4)，進(jìn)一步確定成功有效剔除cre表達(dá)盒及kan篩選標(biāo)記；用引物δargr-jd-s，δargr-jd-a擴(kuò)增的敲除菌株的條帶進(jìn)行測序，再一步確定基因組上的argr基因被34bp的loxp72代替，測序結(jié)果表明重組切割后的無痕敲除菌株基因突變的概率為0％。成功獲得argr基因無痕敲除的菌株，atcc14067-recet-margr。

實(shí)施例3無痕敲除菌株atcc14067-recet-margr中疊加無痕敲除crtb基因

按照實(shí)施例2中的方法設(shè)計(jì)引物crtb-l-s(1)：5′-gaagtgttgatagaaatgacctca-3′，crtb-l-loxp71：5′-tgcagtataacttcgtataatgtatgctatacgaacggtaatgaagacatcaactacaactcc-3′，以atcc14067的基因組為模板擴(kuò)增840bp的含有crtb基因左同源臂及l(fā)oxp71序列的dna序列(c-1)；

設(shè)計(jì)引物crtb-r-loxp66：5′-acccatataacttcgtatagcatacattatacgaacggtatcatagctgagcctgcttctgg-3′，crtb-r-a(1)：5′-gtcactagtgctgactccccctct-3′，以atcc14067的基因組為模板擴(kuò)增850bp的含有l(wèi)oxp66及crtb基因右同源臂的dna序列(c-3)。

以crtb-l-s(1)，crtb-r-a(1)作為引物，片段c-1、2712bp的通用的cre-kan表達(dá)盒(片段2)和片段c-3作為模板，融合4322bp的δcrtb自我剪切的線性敲除表達(dá)盒。

按照施例1中的方法，完成recet表達(dá)的atcc14067-recet-margr感受態(tài)細(xì)胞的制備并完成δcrtb線性敲除表達(dá)盒的轉(zhuǎn)化。

設(shè)計(jì)引物δcrtb-jd-s：5′-ccaggcgttaattctaccaaatcgagat-3′，δcrtb-jd-a：5′-ggtctgacagtaaccggcggagtaatta-3′，對平板上長出的菌落進(jìn)行pcr驗(yàn)證，δcrtb線性敲除表達(dá)盒成功同源重組的菌株在3257bp處有條帶，野生菌株在1455bp處有條帶。挑取約30個(gè)轉(zhuǎn)化子，用引物δcrtb-jd-s，δcrtb-jd-a進(jìn)行pcr鑒定，結(jié)果表明97％的轉(zhuǎn)化子均為成功重組的陽性轉(zhuǎn)化子(表1)。按照實(shí)施例2中的方法完成cre酶的誘導(dǎo)剪切及點(diǎn)板篩選，點(diǎn)板結(jié)果表明100％的cre切割菌株均有效完成loxp位點(diǎn)間dna序列的剪切(表1)；用引物δcrtb-jd-s，δcrtb-jd-a進(jìn)一步pcr驗(yàn)證，無痕敲除在600bp左右處有條帶，野生的對照菌株在1455bp左右處有條帶(圖5)，進(jìn)一步確定成功剔除cre酶表達(dá)盒及kan篩選標(biāo)記表達(dá)盒序列；用引物δcrtb-jd-s，δcrtb-jd-a擴(kuò)增的敲除菌株的條帶進(jìn)行測序，再一步確定基因組上的crtb基因被34bp的loxp72代替，測序結(jié)果表明重組切割后的無痕敲除菌株基因突變的概率為0％，成功獲得crtb基因無痕敲除的菌株；同時(shí)對無痕敲除菌株用引物δargr-jd-s，δargr-jd-a進(jìn)行pcr驗(yàn)證，在600bp左右處有條帶，表明成功獲得argr和crtb基因連續(xù)無痕敲除的菌株atcc14067-recet-margr-crtb。

實(shí)施例4recet對線性敲除表達(dá)盒重組效率及cre酶切割效率分析

為了探索recet-cre/loxp系統(tǒng)在谷氨酸棒桿菌中的同源重組效率及cre切割效率，首先按照實(shí)施例2中制備自我剪切敲除表達(dá)盒的方法分別制備敲除基因ncgl1221和prob的自我剪切線性敲除表達(dá)盒。

設(shè)計(jì)引物ncgl-l-s：5′-gacggtggtgacttttgaacgaag-3′，ncgl-l-loxp71：5′-tgcagtataacttcgtataatgtatgctatacgaacggtagacgctgattacagacgtgtcc-3′，以atcc14067基因組為模板擴(kuò)增886bp的含有ncgl1221基因左同源臂及l(fā)oxp71序列的dna序列(片段n-1)；

設(shè)計(jì)引物ncgl-r-loxp66：5′-acccatataacttcgtatagcatacattatacgaacggtagagccaagattagcgctgaaaagtag-3′，ncgl-r-a：5′-gaacggagtccaagtttgcatcag-3′，以atcc14067的基因組為模板擴(kuò)增826bp的含有l(wèi)oxp66序列及ncgl1221基因右同源臂的dna序列(片段n-3)。

以ncgl-l-s，ncgl-r-a為引物，片段n-1，2712bp的通用的cre-kan表達(dá)盒(片段2)和片段n-3作為模板，融合4343bp的δncgl自我剪切線性敲除表達(dá)盒。

設(shè)計(jì)引物prob-l-s：5′-gatggcccgtgttcattatctccg-3′，prob-l-loxp71：5′-tgcagtataacttcgtataatgtatgctatacgaacggtatccggattcatgtccgtatgcg-3′，以atcc14067的基因組為模板擴(kuò)增849bp的含有prob基因左同源臂及l(fā)oxp71序列的dna序列(p-1)；

設(shè)計(jì)引物prob-r-loxp66：5′-acccatataacttcgtatagcatacattatacgaacggtaagcgcgggcctgctggtggcag-3′，prob-r-a：5′-gtcaggaagtggctcaggatc-3′，以atcc14067的基因組為模板擴(kuò)增849bp的含有l(wèi)oxp66序列及prob基因右同源臂的dna序列(p-3)。

以prob-l-s，prob-r-a作為引物，片段p-1，通用的cre-kan表達(dá)盒片段(片段2)和片段p-3作為模板，融合4330bp的δprob自我剪切線性敲除表達(dá)盒。

按照實(shí)施例1中的方法，將制備好的1μg自我剪切的δncgl1221及δprob的線性敲除表達(dá)盒分別轉(zhuǎn)化入recet表達(dá)的atcc14067-xc99e-recet及atcc14067-recet-margr感受態(tài)細(xì)胞中。按照實(shí)施例2中的方法計(jì)數(shù)平板上長出的單菌落個(gè)數(shù)，不同基因的敲除菌株挑取轉(zhuǎn)化子30個(gè)進(jìn)行菌落pcr驗(yàn)證，分析recet對線性敲除表達(dá)盒的替換頻率(表1)。

按照實(shí)施例2中的方法，誘導(dǎo)cre酶的表達(dá)，執(zhí)行l(wèi)oxp位點(diǎn)間的剪切、點(diǎn)板篩選及測序，分析不同敲除基因中cre酶的切割效率(表1)，并分別獲得無痕敲除菌株atcc14067-recet-mncgl1221，atcc14067-recet-mprob，atcc14067-recet-margr-ncgl1221，atcc14067-recet-margr-prob。

表1recet對自我剪切線性敲除表達(dá)盒的重組效率及cre剪切效率統(tǒng)計(jì)結(jié)果

本發(fā)明中，通過將構(gòu)建的recet-cre/loxp系統(tǒng)應(yīng)用于谷氨酸棒桿菌atcc14067中，利用核酸外切酶-重組酶recet直接有效地完成線性雙鏈dna的同源重組，整個(gè)過程只需要一輪的轉(zhuǎn)化，且成功重組的轉(zhuǎn)化子的概率≥94％；同時(shí)cre酶能夠有效的執(zhí)行l(wèi)oxp位點(diǎn)間的剪切，剪切效率≥97％；recet-cre/loxp系統(tǒng)完成靶標(biāo)基因的無痕敲除僅需4～6天，同時(shí)能夠完成靶標(biāo)基因的連續(xù)無痕敲除，相對于谷氨酸棒桿菌中的其他無痕敲除的方法更加簡單，有效而且節(jié)省時(shí)間。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>華南理工大學(xué)

<120>谷氨酸棒桿菌中一種基因連續(xù)無痕敲除的方法

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acccatataacttcgtatagcatacattatacgaacggtaagcgcccctagttcaaggct60

tg62

<210>33

<211>24

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>argr-r-a

<400>33

tgatgacctcatctggagcgttac24

<210>34

<211>28

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>△argr-jd-s

<400>34

gttgtcatcaccgatacctgggtatcca28

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<211>28

<212>dna

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<220>

<223>△argr-jd-a

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<211>24

<212>dna

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<212>dna

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acccatataacttcgtatagcatacattatacgaacggtatcatagctgagcctgcttct60

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<220>

<223>△crtb-jd-a

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<212>dna

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<212>dna

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<220>

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tgcagtataacttcgtataatgtatgctatacgaacggtagacgctgattacagacgtgt60

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<212>dna

<213>artificialsequence

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<220>

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