本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種多重刺激響應(yīng)交聯(lián)型聚合物納米水凝膠、其制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

根據(jù)大量研究表明，阿霉素是一種有效的抗癌藥物，可抑制rna和dna的合成，對(duì)rna的抑制作用最強(qiáng)，抗瘤譜較廣，對(duì)各種生長(zhǎng)周期的腫瘤細(xì)胞都有殺滅作用。但是直接注射后通過體液循環(huán)到達(dá)腫瘤組織的劑量很低，而且會(huì)給人體帶來嚴(yán)重的副反應(yīng)。世界上已經(jīng)有很多研究來發(fā)展目標(biāo)靶向藥物傳輸體系(drugdeliverysystems,dds)來增強(qiáng)藥效和降低副反應(yīng)，這些藥物載體包括各種形態(tài)的納米粒子、膠束、微膠囊、納米水凝膠等。

在各種藥物載體中，聚合物納米水凝膠是一種理想的藥物載體。作為一種通過物理或者化學(xué)交聯(lián)的三維高親水性的聚合物網(wǎng)絡(luò)，水凝膠是最接近于人體各種組織細(xì)胞的形態(tài)，從某種意義上說，人體各種組織都是不同水含量的凝膠。其中，化學(xué)交聯(lián)的納米水凝膠的高度親水性和膠體穩(wěn)定性使得它是一種理想的藥物傳輸載體。

對(duì)于目標(biāo)藥物載體，智能型的納米水凝膠尤其重要，因?yàn)樗梢赃x擇性的在目標(biāo)區(qū)域釋放藥物，而在別的區(qū)域保持穩(wěn)定，一般體現(xiàn)為對(duì)于ph值、溫度、離子濃度、谷胱甘肽或者它們之間的組合的刺激響應(yīng)性。其中，最重要的是ph、谷胱甘肽和溫度的刺激響應(yīng)性，因?yàn)槟[瘤組織(ph弱酸性)和正常細(xì)胞(ph中性)間，以及細(xì)胞外液(ph中性)和細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)涵體和溶酶體(ph酸性)之間存在著明顯的差異，而由腫瘤細(xì)胞內(nèi)液和外液不同濃度的谷胱甘肽濃度產(chǎn)生的環(huán)境差異則使得谷胱甘肽刺激響應(yīng)性也非常重要，除此之外由于腫瘤細(xì)胞代謝速快，腫瘤組織處溫也高于正常值，這使得溫度刺激響應(yīng)性也顯得尤為重要。針對(duì)這些不同組織部位的不同谷胱甘肽/ph/溫度設(shè)計(jì)多重刺激敏感性的藥物載體，可以智能化的控制釋藥和對(duì)于腫瘤細(xì)胞具有靶向殺傷性。

然而，目前還未存在對(duì)谷胱甘肽、ph、溫度刺等多重刺激都具有響應(yīng)性的納米水凝膠載體，這也是今后研發(fā)的重要方向。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于以上問題，本發(fā)明提供了一種多重刺激響應(yīng)交聯(lián)型聚合物納米水凝膠、其制備方法及應(yīng)用，所述納米水凝膠是可逆交聯(lián)、對(duì)谷胱甘肽、ph、溫度刺激具有響應(yīng)特性、并具有優(yōu)異可降解性能的納米水凝膠，并且該納米水凝膠的應(yīng)用是對(duì)藥物載體領(lǐng)域的一次重要變革。

具體而言，本發(fā)明提供一種多重刺激響應(yīng)交聯(lián)型聚合物納米水凝膠的制備方法，其包括下述步驟：

1）在單一的乙醇、乙睛、水、n-甲基吡咯烷酮或甲苯溶劑中，或者在乙醇-水、乙醇-乙睛、乙醇-n-甲基吡咯烷酮或乙醇-甲苯的混合溶劑中，加入聚乙二醇二縮水甘油醚及/或聚丙二醇二縮水甘油醚、以及具有ph響應(yīng)特性的單體，在攪拌下回流反應(yīng)6-24小時(shí)；

2）向反應(yīng)物溶液中加入具有谷胱甘肽刺激響應(yīng)特性的交聯(lián)劑繼續(xù)回流反應(yīng)12-24小時(shí)；

3）反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物沉析、過濾、洗滌，在30-50℃下真空干燥10-24小時(shí)，得到多重刺激響應(yīng)交聯(lián)型聚合物納米水凝膠粒子。

根據(jù)如上所述的制備方法，體系中除溶劑外的所有成分的總質(zhì)量與溶劑的比為0.1g/ml-0.5g/ml。

根據(jù)如上所述的制備方法，所述聚乙二醇二縮水甘油醚及/或聚丙二醇二縮水甘油醚的數(shù)均分子量為200-2000。

根據(jù)如上所述的制備方法，所述的具有ph響應(yīng)特性的單體為哌嗪、甲胺、丙胺、十二胺中的一種或幾種。

根據(jù)根據(jù)如上所述的制備方法，各成分的質(zhì)量比為：聚乙二醇縮水甘油醚及/或聚丙二醇二縮水甘油醚200份、具有ph響應(yīng)特性的單體4-60份：具有谷胱甘肽刺激響應(yīng)特性的交聯(lián)劑1.9-38份。

根據(jù)如上所述的制備方法，所述具有谷胱甘肽刺激響應(yīng)特性的交聯(lián)劑為胱胺、2,2'-二硫代二苯胺、3,3'二硫代二丙胺、2,2'二硫代二乙胺中的一種或幾種。

根據(jù)如上所述的制備方法，在步驟1）中所述的攪拌是在60-80℃下的磁力攪拌；在步驟3）中，所述以甲醇為溶劑對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行沉析及洗滌。

本發(fā)明還提供一種通過如上所述制備方法制得的多重刺激響應(yīng)交聯(lián)型聚合物納米水凝膠，所述水凝膠的大小為50-950nm，多分散度為0.04-0.16。

并且，本發(fā)明還提供一種如上所述的多重刺激響應(yīng)交聯(lián)型聚合物納米水凝膠的應(yīng)用，將所述納米水凝膠用作藥物載體。

根據(jù)如上所述的應(yīng)用，所述藥物為抗癌藥物阿霉素。

本發(fā)明所述制備方法制得的納米水凝膠，具有谷胱甘肽、ph、溫度刺激響應(yīng)特性和優(yōu)異可降解性能。并且，本發(fā)明制備工藝清晰簡(jiǎn)潔，得到的納米水凝膠藥物載體具有谷胱甘肽/ph/溫度多重刺激響應(yīng)性，谷胱甘肽響應(yīng)性可以使得納米水凝膠在腫瘤細(xì)胞外低谷胱甘肽濃度的環(huán)境中保持穩(wěn)定，長(zhǎng)時(shí)間循環(huán)，很少泄露藥物，而在腫瘤細(xì)胞內(nèi)高谷胱甘肽濃度的環(huán)境中快速降解，變?yōu)樾》肿恿康木€性鏈，從而快速釋放藥物，達(dá)到在目標(biāo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)控制釋放抗癌藥物的效果。ph和溫度響應(yīng)性則使得納米水凝膠在內(nèi)涵體、溶酶體等亞細(xì)胞器官內(nèi)更有效的釋放出阿霉素，體現(xiàn)出與谷胱甘肽的協(xié)同效應(yīng)。而凝膠粒子的可生物降解性和降解后的小分子量又可以使得藥物載體迅速代謝排出體外，進(jìn)一步減少對(duì)人體的副作用。以上設(shè)計(jì)思路基本覆蓋了藥物傳遞領(lǐng)域所關(guān)心的一些基本問題，因此產(chǎn)品具有良好的全面性。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的納米水凝膠的sem形貌圖。

圖2為本發(fā)明的納米水凝膠在不同ph下的粒徑分布圖。

圖3為本發(fā)明的納米水凝膠在不同溫度下的粒徑分布圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，本部分的描述僅是示范性和解釋性，不應(yīng)對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍有任何的限制作用。

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等,如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

一、多重刺激響應(yīng)交聯(lián)型聚合物納米水凝膠的制備

實(shí)施例1

在60ml乙醇中加入20g聚乙二醇二縮水甘油醚(mn=200)及6g無水哌嗪，在60℃磁力攪拌下回流反應(yīng)6小時(shí)；之后向反應(yīng)物溶液中加入3.8g胱胺繼續(xù)回流反應(yīng)12小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物沉析在甲醇中，之后過濾，用甲醇反復(fù)洗滌三次產(chǎn)物，在50℃下真空干燥24小時(shí)，得到納米水凝膠粒子。

實(shí)施例2

在206ml乙醇中加入20g聚乙二醇二縮水甘油醚(mn=2000)及0.4g無水哌嗪，在80℃磁力攪拌下回流反應(yīng)24小時(shí)；之后向反應(yīng)物溶液中加入0.19g胱胺繼續(xù)回流反應(yīng)24小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物沉析在甲醇中，之后過濾，用甲醇反復(fù)洗滌三次產(chǎn)物，在50℃下真空干燥10小時(shí)，得到納米水凝膠粒子。

實(shí)施例3

在60ml乙醇中加入20g聚丙二醇二縮水甘油醚(mn=200)及3g丙胺，在70℃磁力攪拌下回流反應(yīng)12小時(shí)；之后向反應(yīng)物溶液中加入2g胱胺繼續(xù)回流反應(yīng)18小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物沉析在甲醇中，之后過濾，用甲醇反復(fù)洗滌三次產(chǎn)物，在30℃下真空干燥24小時(shí)，得到納米水凝膠粒子。

實(shí)施例4

在60ml乙醇中加入20g聚乙二醇二縮水甘油醚(mn=2000)及1g十二胺，在80℃磁力攪拌下回流反應(yīng)20小時(shí)；之后向反應(yīng)物溶液中加入1g3,3'二硫代二丙胺繼續(xù)回流反應(yīng)20小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物沉析在甲醇中，之后過濾，用甲醇反復(fù)洗滌三次產(chǎn)物，在40℃下真空干燥16小時(shí)，得到納米水凝膠粒子。

實(shí)施例5

在90ml乙醇中加入20g聚丙二醇二縮水甘油醚(mn=2000)及0.6g甲胺，在80℃磁力攪拌下回流反應(yīng)24小時(shí)；之后向反應(yīng)物溶液中加入0.19g2,2'二硫代二乙胺繼續(xù)回流反應(yīng)24小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物沉析在甲醇中，之后過濾，用甲醇反復(fù)洗滌三次產(chǎn)物，在50℃下真空干燥10小時(shí)，得到納米水凝膠粒子。

實(shí)施例6

在90ml乙醇中加入20g聚乙二醇二縮水甘油醚(mn=2000)及0.8g哌嗪，在75℃磁力攪拌下回流反應(yīng)18小時(shí)；之后向反應(yīng)物溶液中加入0.5g2,2'-二硫代二苯胺，繼續(xù)回流反應(yīng)18小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物沉析在甲醇中，之后過濾，用甲醇反復(fù)洗滌三次產(chǎn)物，在50℃下真空干燥24小時(shí)，得到納米水凝膠粒子。

實(shí)施例7

在90ml乙醇中加入20g聚丙二醇二縮水甘油醚(mn=2000)及6g哌嗪，在75℃磁力攪拌下回流反應(yīng)18小時(shí)；之后向反應(yīng)物溶液中加入3.8g胱胺繼續(xù)回流反應(yīng)24小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物沉析在甲醇中，之后過濾，用甲醇反復(fù)洗滌三次產(chǎn)物，在50℃下真空干燥24小時(shí)，得到納米水凝膠粒子。

二、多重刺激響應(yīng)交聯(lián)型聚合物納米水凝膠的性能測(cè)試

（1）粒徑及多分散度測(cè)試

取實(shí)施例1-7中制得的納米水凝膠粒子，分別配制1mg/ml的納米水凝膠水溶液，在zetasizernanozs90儀（malvern）上測(cè)定納米水凝膠的粒徑大小和粒徑分布，取五次測(cè)試的平均值。其中，粒徑分布的五次測(cè)試平均值為多分散度。另外，4mwhe-nelaser的波長(zhǎng)為633nm，測(cè)試角為90o，采用contin分析方法。結(jié)果如表1所示。

表1

由測(cè)試可知，本發(fā)明制得的納米水凝膠為球狀，且由表1中測(cè)得的數(shù)據(jù)可知，本發(fā)明制得的納米水凝膠粒徑為50-950nm，多分散度為0.04-0.16。

（2）降解性測(cè)試

取3個(gè)50ml的單口燒瓶，分別加入10mg的納米水凝膠粒子，然后依次分別加入10ml下述緩沖溶液：磷酸鹽緩沖溶液ph=7.4、磷酸鹽緩沖溶液ph=6.0、醋酸鹽緩沖溶液ph=5.0；然后每個(gè)單口燒瓶分別加入20mm的谷胱甘肽，放入恒溫?fù)u床(200rpm搖速，37.5℃)勻速振蕩12小時(shí)。通過gpc測(cè)定降解后納米水凝膠粒子的分子量。對(duì)本發(fā)明實(shí)施例1-7中制得的納米水凝膠分別進(jìn)行如上的降解性測(cè)試，分子量結(jié)果如表2所示。

表2

由表2可知，本發(fā)明制得的納米水凝膠粒子在ph為7.4、6.0和5.0的情況都發(fā)生了降解，且分子量均小于3500，遠(yuǎn)小于代謝閡值(45-50kda)。且ph值越小降解程度越高，從側(cè)面證明本發(fā)明所制納米水凝膠在人體中ph較低的腫瘤細(xì)胞降解更快。由此可知本發(fā)明制得的納米水凝膠粒子的降解性優(yōu)異，并且具有降解選擇性，如在腫瘤環(huán)境（ph5.0）中降解更快。

（3）載藥性測(cè)試

將5mg的阿霉素（起始藥物量）和25mg的納米水凝膠，溶于5ml的dmf中，再加入10ul的三乙胺，攪拌24小時(shí)。然后將混合溶液在冷凍干燥箱中凍干。精確稱取2mg適量?jī)龈珊蟮募{米凝膠載藥粉末，溶于4mldmso中，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度(λ=485nm)，根據(jù)阿霉素吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線得到阿霉素的含量，進(jìn)而算出阿霉素含量，計(jì)算載藥率和包封率。對(duì)實(shí)施例1-7中的制得的納米水凝膠進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。

載藥率和包封率按以下公式計(jì)算:

載藥率=阿霉素的含量/納米藥物的質(zhì)量×100%

實(shí)際載藥量=載藥率×上述凍干后的納米凝膠載藥粉末

包封率=實(shí)際載藥量/起始藥物量×100%

表3

由上述表3可知，本發(fā)明中制得的納米水凝膠的載藥率及包封率均優(yōu)異。

（4）釋藥試驗(yàn)

將8-10mg載藥納米水凝膠粒子分散在8-10ml的兩種緩沖溶液中(磷酸鹽緩沖溶液ph=7.4；醋酸—醋酸鈉緩沖溶液ph=6.0)，超聲分散均勻，然后分為4-5份，每份2ml左右，再放入80ml的含不同濃度的谷胱甘肽的緩沖溶液中，即刻開始測(cè)試，通過紫外測(cè)定藥物濃度來計(jì)算釋藥率。在48小時(shí)后，從瓶?jī)?nèi)取出3ml釋藥的緩沖溶液進(jìn)行紫外測(cè)量，并且分別在25℃、36℃和37.5℃的條件下恒測(cè)定。

隨機(jī)選取實(shí)施例1及實(shí)施例6制得的納米水凝膠進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)，藥物釋放率結(jié)果如表4所示。

表4藥物釋放率結(jié)果

由表4可知，關(guān)于阿霉素的釋放，在高谷胱甘肽濃度、較低ph值條件下和較高溫度下展現(xiàn)出較快的釋放速度，可以達(dá)到65%以上，而在低谷胱甘肽濃度、中性的ph值及低溫度條件下保持穩(wěn)定、釋放量小于20%。而眾所周知，谷胱甘肽濃度高、ph值低、溫度高的條件下，相似于腫瘤細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境，在該環(huán)境下藥物釋放率高，可實(shí)現(xiàn)藥物最大量釋放的效果，相反，在谷胱甘肽濃度低、ph值高、溫度低的條件下，相似于正常細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境下，藥物釋放得到控制，保證對(duì)正常細(xì)胞的安全性。由此可知，通過本發(fā)明制得的納米水凝膠，谷胱甘肽濃度、ph值及溫度具有刺激響應(yīng)性，通過本發(fā)明的納米水凝膠對(duì)藥物包封可實(shí)現(xiàn)藥物選擇性釋放的效果。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證本發(fā)明的ph和溫度刺激響應(yīng)特性，隨機(jī)選取實(shí)施例3的納米水凝膠溶液，在不同溫度和ph下測(cè)試了它們的粒度分布。有圖2可知，在不同的ph下，納米水凝膠粒子的粒徑不同，從而側(cè)面證明該水凝膠粒子有ph響應(yīng)特性；相同的，由圖3可知，本發(fā)明制備的納米水凝膠粒子具有溫度響應(yīng)特性。

（3）細(xì)胞試驗(yàn)

將子宮腫瘤細(xì)胞接種于96孔板中，每孔加入100uldmem完全培養(yǎng)基。在37^oc和5%濃度co2空氣環(huán)境下培養(yǎng)24小時(shí)然后吸去培養(yǎng)液，每孔加入濃度為200ug/ml的載有阿霉素藥物的聚合物納米水凝膠粒子的培養(yǎng)基（100ul），一起培養(yǎng)，并用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。其中載藥的具體操作同（3）載藥試樣中操作一致。通過熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)6h后載藥納米水凝膠粒子已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞，12h后阿霉素藥物對(duì)于細(xì)胞的殺傷作用已經(jīng)非常明顯，細(xì)胞存活率大幅降低，剩余的少量細(xì)胞也處于皺縮狀態(tài)，說明所制備的納米水凝膠是一種較好的藥物載體。