本發(fā)明涉及合成化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種橙皮素酯化物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來，腫瘤成為嚴重危害人類健康的一種多發(fā)性疾病，腫瘤是由于機體在各種因素作用下，局部組織的細胞在基因水平上失去了對其生長的正常調(diào)控，使得細胞異常增生而形成的。不合理飲食、遺傳因素、環(huán)境因素等致癌因素以協(xié)同或序貫的方式引起dna損害，從而激活原癌基因和/或滅活腫瘤抑制基因，加上凋亡調(diào)節(jié)基因和/或dna修復(fù)基因的改變，繼而引起表達水平的異常，使靶細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的細胞最初多呈克隆性的增生，經(jīng)過一個漫長的多階段的演化過程，其中一個克隆相對無限制的擴增，通過附加突變，選擇性地形成具有不同特點的亞克隆，即異質(zhì)化，從而獲得浸潤和轉(zhuǎn)移的能力，形成惡性腫瘤。因此，治療腫瘤及研究抗腫瘤藥物一直是醫(yī)藥領(lǐng)域研究的重點內(nèi)容。
然而抗腫瘤藥物的作用機理以及藥物的作用靶點是多種多樣的，且由于腫瘤細胞易產(chǎn)生多藥耐藥往往導(dǎo)致治療的失敗。尋找有效安全、毒副作用小的抗腫瘤藥物一直是腫瘤藥物研發(fā)工作者孜孜以求的目標。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
基于此，有必要提供一種具有抗腫瘤活性的抗腫瘤藥物，具體提供了一種具有抗腫瘤活性的橙皮素酯化物及其制備方法和應(yīng)用。
一種橙皮素酯化物，其結(jié)構(gòu)式如下：
其中，r1為h或c1～c4烷基；r2～r6分別為h、鹵素、硝基、烷基和烷氧基中的一種。
上述橙皮素酯化物，以橙皮素為母核結(jié)構(gòu)，通過橙皮素7位的羥基引入苯磺酸基團，不僅保留了橙皮素獨特的電子特性和優(yōu)越的生物活性等特點，使其具有抗腫瘤活性，而且橙皮素和苯磺酸及其衍生物通過共價鍵連接形成孿藥(twindrug)，其在體內(nèi)代謝生成橙皮素和苯磺酸及其衍生物兩種藥物，該兩種藥物產(chǎn)生協(xié)同作用，進而增強了其抗腫瘤活性；同時還能在一定程度上提高抗腫瘤活性的選擇性，降低藥物的不良反應(yīng)。
在其中一個實施例中，r2～r6中至少一個為鹵素、硝基、c1～c4烷基、甲烷氧基和乙烷氧基中的一種。
在其中一個實施例中，r2、r3、r5及r6同時為h，r4為甲基、硝基或甲烷氧基；或r3、r4及r5同時為h，r2為cl，r6為硝基。
在其中一個實施例中，r1＝h或甲基。
上述橙皮素酯化物的制備方法，包括以下步驟：
在催化劑作用下，將化合物ⅰ和化合物ⅱ于第一有機溶劑中發(fā)生磺酸酯化反應(yīng)，得到橙皮素酯化物；其中化合物ⅰ和化合物ⅱ的結(jié)構(gòu)式如下：
上述橙皮素酯化物的制備方法，原料易得，反應(yīng)條件溫和，步驟少、收率高，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。得到的橙皮素酯化物不僅具有抗腫瘤活性，而且橙皮素和苯磺酸及其衍生物通過共價鍵連接形成孿藥，其在體內(nèi)代謝生成橙皮素和苯磺酸及其衍生物兩種藥物，該兩種藥物產(chǎn)生協(xié)同作用，進而增強了其抗腫瘤活性；同時還能在一定程度上提高抗腫瘤活性的選擇性，降低藥物的不良反應(yīng)。
在其中一個實施例中，所述化合物ⅰ和所述化合物ⅱ的物質(zhì)的量的比為1：1～1.5。
在其中一個實施例中，所述磺酸酯化反應(yīng)中的催化劑為堿，所述第一有機溶劑選自dmso、乙腈、dmf和丙酮中的至少一種，所述磺酸酯化反應(yīng)的條件為于60～100℃下反應(yīng)5～7小時。
在其中一個實施例中，所述化合物ⅰ由化合物ⅲ發(fā)生水解反應(yīng)制得，該步驟具體為：將化合物ⅲ溶于第二有機溶劑得到水解液，調(diào)節(jié)所述水解液的ph值為5～7，再將調(diào)節(jié)ph后的溶液于60～100℃下反應(yīng)2～5小時，過濾得到所述化合物??；其中化合物ⅲ的結(jié)構(gòu)式如下：
在其中一個實施例中，還包括所述橙皮素酯化物的提純步驟：將所述橙皮素酯化物用水洗滌，分離并濃縮有機層，再采用甲醇重結(jié)晶，得到提純后的橙皮素酯化物。
上述橙皮素酯化物在制備具有抗腫瘤作用的藥物中的應(yīng)用。
具體實施方式
為了便于理解本發(fā)明，下面將對本發(fā)明進行更全面的描述，并給出了本發(fā)明的較佳實施例。但是，本發(fā)明可以以許多不同的形式來實現(xiàn)，并不限于本文所描述的實施例。相反地，提供這些實施例的目的是使對本發(fā)明的公開內(nèi)容的理解更加透徹全面。
除非另有定義，本文所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與屬于本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本文中在本發(fā)明的說明書中所使用的術(shù)語只是為了描述具體的實施例的目的，不是旨在于限制本發(fā)明。本文所使用的術(shù)語“和/或”包括一個或多個相關(guān)的所列項目的任意的和所有的組合。
本發(fā)明一實施方式的橙皮素酯化物，其結(jié)構(gòu)式如下：
其中，r1為h或c1～c4烷基；r2～r6分別為h、鹵素、硝基、烷基和烷氧基中的一種。即r2～r6同時為h，或r2～r6中至少一個為鹵素、硝基、烷基和烷氧基中的一種。值得一提的是，r2～r6可以相同也可不相同。
橙皮素具有獨特的電子特性和優(yōu)越的生物活性等特點，且橙皮素的來源廣、安全無副作用，使其具有抗高血糖、抗癌、抗菌、抗真菌及抗病毒等藥學(xué)性質(zhì)，進而具有抗腫瘤活性。橙皮素主要是從橙皮苷水解而來，橙皮苷可從柑橘等水果的果皮和果肉中提取得到。
上述橙皮素酯化物，以橙皮素為母核結(jié)構(gòu)，通過橙皮素7位的羥基引入苯磺酸基團，不僅保留了橙皮素獨特的電子特性和優(yōu)越的生物活性等特點，使其具有抗腫瘤活性，而且橙皮素和苯磺酸及其衍生物通過共價鍵連接形成孿藥(twindrug)，其在體內(nèi)代謝生成橙皮素和苯磺酸及其衍生物兩種藥物，該兩種藥物產(chǎn)生協(xié)同作用，進而增強了其抗腫瘤活性；同時還能在一定程度上提高抗腫瘤活性的選擇性，降低藥物的不良反應(yīng)。
此外苯磺酸基團的水溶性強，引入苯磺酸基團提高了上述橙皮素酯化物的水溶性。
經(jīng)初步的體外抗腫瘤活性測試，上述橙皮素酯化物具有較好的腫瘤抑制活性，能用于預(yù)防或者治療細胞異常增殖、形態(tài)變化等相關(guān)的疾病，尤其是用于治療或者預(yù)防腫瘤生長與轉(zhuǎn)移。且部分化合物的體外活性明顯優(yōu)于已知化合物橙皮素，這為我們尋找更多的以橙皮素為母核的抗腫瘤化合物開辟了新的領(lǐng)域。
優(yōu)選的，r1＝h或甲基。
優(yōu)選的，或r2～r6中至少一個為鹵素、硝基、c1～c4烷基、甲烷氧基和乙烷氧基中的一種。
更優(yōu)選的，r2、r3、r5及r6同時為h，r4為甲基。
更優(yōu)選的，r2、r3、r5及r6同時為h，r4為硝基。
更優(yōu)選的，r2、r3、r5及r6同時為h，r4為甲烷氧基。
更優(yōu)選的，r3、r4及r5同時為h，r2為cl，r6為硝基。
較佳實施例的橙皮素酯化物，化合物a～h、化合物j及化合物k，其結(jié)構(gòu)式如下所示。
本發(fā)明還提供了上述橙皮素酯化物的制備方法。
一實施方式的橙皮素酯化物的制備方法包括以下步驟：
在催化劑作用下，將化合物ⅰ和化合物ⅱ于有機溶劑中發(fā)生磺酸酯化反應(yīng)，得到橙皮素酯化物；其中r1為h或c1～c4烷基；r2～r6分別為h、鹵素、硝基、烷基和烷氧基中的一種?；衔铫『突衔铫⒌慕Y(jié)構(gòu)式如下：
由于苯磺酸基團的結(jié)構(gòu)較大以及空間位阻的作用，化合物ⅱ優(yōu)先與化合物ⅰ中的橙皮素母核7位的羥基發(fā)生磺酸酯化反應(yīng)。
上述橙皮素酯化物的制備方法，原料易得，反應(yīng)條件溫和，步驟少、收率高，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。得到的橙皮素酯化物不僅具有抗腫瘤活性，而且橙皮素和苯磺酸及其衍生物通過共價鍵連接形成孿藥(twindrug)，其在體內(nèi)代謝生成橙皮素和苯磺酸及其衍生物兩種藥物，該兩種藥物產(chǎn)生協(xié)同作用，進而增強了其抗腫瘤活性；同時還能在一定程度上提高抗腫瘤活性的選擇性，降低藥物的不良反應(yīng)。
其中，化合物ⅰ為橙皮素或其衍生物，化合物ⅱ為苯磺酸或其衍生物。例如，r1為h時，化合物ⅰ為橙皮素。又如，r2～r6同時為h時，化合物ⅱ為苯磺酸。
在其中一個實施例中，所述化合物ⅰ和化合物ⅱ的物質(zhì)的量的比為1：1～1.5。在該條件下有利于提高產(chǎn)率。優(yōu)選的，所述化合物ⅰ和化合物ⅱ的物質(zhì)的量的比為1：1～1.3。更優(yōu)選的，所述化合物ⅰ和化合物ⅱ的物質(zhì)的量的比為1：1.3。
在其中一個實施例中，所述磺酸酯化反應(yīng)中的催化劑為堿，所述磺酸酯化反應(yīng)中的有機溶劑選自dmso(二甲基亞砜)、乙腈、dmf(二甲基甲酰胺)和丙酮中的至少一種，所述磺酸酯化反應(yīng)的條件為于60～100℃下反應(yīng)5～7小時。
優(yōu)選的，磺酸酯化反應(yīng)中的有機溶劑為dmf。優(yōu)選的，所述堿選自碳酸鉀、氫氧化鉀和碳酸鈉中的至少一種。更優(yōu)選的，所述堿為碳酸鉀。優(yōu)選的，堿與化合物ⅰ的物質(zhì)的量的比為1：1～4。更優(yōu)選的，堿與化合物ⅰ的物質(zhì)的量的比為1：3。
優(yōu)選的，所述磺酸酯化反應(yīng)還于脫水劑的作用下反應(yīng)。更優(yōu)選的，脫水劑為dcc(二環(huán)己基碳二亞胺)。優(yōu)選的，脫水劑與化合物ⅰ的物質(zhì)的量的比為1：0.5～1.5。更優(yōu)選的，脫水劑與化合物ⅰ的物質(zhì)的量的比為1：1。
在其中一個實施例中，上述橙皮素酯化物的制備方法還包括所述橙皮素酯化物的提純步驟：將所述橙皮素酯化物用水洗滌，分離并濃縮有機層，再采用甲醇重結(jié)晶，得到提純后的橙皮素酯化物。
在其中一個實施例中，所述化合物ⅰ由化合物ⅲ發(fā)生水解反應(yīng)制得，其中化合物ⅲ的結(jié)構(gòu)式如下：
其中，r1為h或c1～c4烷基，即化合物ⅲ為橙皮苷或其衍生物，相應(yīng)的，得到的化合物ⅰ為橙皮素或其衍生物。例如，r1為h時，化合物ⅲ為橙皮苷。
化合物ⅲ發(fā)生水解反應(yīng)制得化合物ⅰ的步驟具體為：將化合物ⅲ溶于有機溶劑得到水解液，調(diào)節(jié)該水解液的ph值為5～7，再將調(diào)節(jié)ph后的溶液于60～100℃下反應(yīng)2～5小時，過濾得到所述化合物ⅰ。
優(yōu)選的，調(diào)節(jié)水解液的ph值為5，在該條件下橙皮素或其衍生物能更好的析晶。優(yōu)選的，在過濾得到化合物ⅰ的步驟之后，還包括化合物ⅰ的烘干步驟。優(yōu)選的，調(diào)節(jié)水解液的ph值所用的試劑為鹽酸或硫酸。優(yōu)選的，調(diào)節(jié)水解液的ph值所用的試劑為濃硫酸。
優(yōu)選的，所述水解反應(yīng)中的有機溶劑選自dmso、乙腈、dmf和丙酮中的至少一種。更優(yōu)選的，所述水解反應(yīng)中的有機溶劑為dmso。
在其中一個實施例中，當r1為c1～c4烷基時，化合物ⅰ可由橙皮苷發(fā)生水解和烷基化反應(yīng)得到，該步驟具體為將化合物ⅲ溶于有機溶劑得到水解液，調(diào)節(jié)該水解液的ph值為5～7，再將調(diào)節(jié)ph后的溶液于60～100℃下反應(yīng)2～5小時，冷卻至室溫，向溶液中加入烷基化試劑，在室溫下反應(yīng)，過濾得到所述化合物ⅰ。如此利用橙皮苷一步反應(yīng)得到橙皮素烷基化衍生物，步驟簡單；且在該條件下使得烷基化試劑只能與橙皮素中3-羥基-4-甲氧基苯基的羥基發(fā)生烷基化反應(yīng)。
優(yōu)選地，烷基化試劑為碘甲烷。優(yōu)選地，橙皮苷與烷基化試劑的物質(zhì)的量的比為1：3～5。優(yōu)選地，加入烷基化試劑后，在室溫下反應(yīng)的時間為6～10小時。
本發(fā)明還提供了上述橙皮素酯化物在制備具有抗腫瘤作用的藥物中的應(yīng)用。上述橙皮素酯化物具有較好的腫瘤抑制活性，能用于預(yù)防或者治療細胞異常增殖、形態(tài)變化等相關(guān)的疾病，尤其是用于治療或者預(yù)防腫瘤生長與轉(zhuǎn)移。且部分化合物的體外活性明顯優(yōu)于已知化合物橙皮素，這為我們尋找更多的以橙皮素為母核的抗腫瘤化合物開辟了新的領(lǐng)域。
以下為具體實施例。
實施例1
實施例1的橙皮素酯化物為化合物(s,e)-5-羥基-2-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-4-氧代色滿-7-基苯磺酸酯，其結(jié)構(gòu)式如上述化合物a所示。
實施例1的橙皮素酯化物的主要原料為橙皮苷和苯磺酸。實施例1的橙皮素酯化物的制備方法如下：
將0.16mol橙皮苷置于反應(yīng)容器中，加入500ml的dmso得到水解液。然后滴入50ml濃硫酸調(diào)節(jié)水解液的ph值為5，再于100℃下磁力攪拌反應(yīng)2小時，靜置過濾得到沉淀物，烘干得到0.13mol橙皮素。
將0.13mol橙皮素和0.2mol苯磺酸充分溶解于400mldmf中，并滴入0.13moldcc作脫水劑，加入0.42mol碳酸鈉于100℃下回流反應(yīng)6小時，得到的溶液冷卻至室溫，用水洗滌，靜置分離有機層，并濃縮有機層，再采用甲醇重結(jié)晶得57.27g白色固體，即化合物a。實施例1的收率為80.9％，所有實施例中的收率根據(jù)橙皮苷對應(yīng)的理論產(chǎn)物計算。
實施例1的橙皮素酯化物的質(zhì)譜結(jié)果如下：1h-nmr(300mhz,dmso)：7.8-7.6(5h,m,j＝7.5hz),6.99(1h,m),6.9-6.7(2h,m,j＝7.5hz),6.18(1h,m,j＝7.8hz),6.14(1h,m,j＝7.8hz),5.51(1h,s),5.35(2h,s),3.83(3h,s)，3.4-3.1(2h,s)；13c-nmr(75mhz,dmso)：196.8,163.8,156.9,149.0,147.3,135.4,132.5,130.4,128.1,119.6,113.4,102.8,95.1,82.8,56.1,43.0；hrms(esi)for(m+h)+:calcd443.0795,found443.0801。
實施例2～5
實施例2的橙皮素酯化物為化合物(s,e)-5-羥基-2-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-4-氧代色滿-7-基4-甲基苯磺酸酯，其結(jié)構(gòu)式如上述化合物b所示。
實施例3的橙皮素酯化物為化合物(s,e)-5-羥基-2-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-4-氧代色滿-7-基4-硝基苯磺酸酯，其結(jié)構(gòu)式如上述化合物c所示。
實施例4的橙皮素酯化物為化合物(s,e)-5-羥基-2-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-4-氧代色滿-7-基2-氯-6-甲基苯磺酸酯，其結(jié)構(gòu)式如上述化合物d所示。
實施例5的橙皮素酯化物為化合物(s,e)-5-羥基-2-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-4-氧代色滿-7-基4-甲氧基苯磺酸酯，其結(jié)構(gòu)式如上述化合物e所示。
實施例2～5的主要原料為橙皮苷和相應(yīng)的苯磺酸衍生物。如實施例2的主要原料為橙皮苷和4-甲基苯磺酸酯。實施例2～5中橙皮苷發(fā)生水解反應(yīng)得到橙皮素的步驟與實施例1相同；實施例2～5中橙皮素和相應(yīng)的苯磺酸衍生物發(fā)生磺酸酯化反應(yīng)得到橙皮素酯化物的步驟與實施例1除了原料不同，其他比例均相同：相應(yīng)的苯磺酸衍生物的加入量均為0.2mol。
實施例2得到55.87g白色固體，即化合物b。實施例2的收率為76.5％。其質(zhì)譜結(jié)果如下：1h-nmr(300mhz,dmso):7.8-7.4(4h,m,j＝7.5hz)，6.99(1h,m),6.9-6.7(2h,m,j＝7.5hz)，6.18(1h,m，j＝7.8hz)，6.14(1h,m,j＝7.8hz)，5.51(1h,s)，5.35(2h,s)，3.83(3h,s)3.4-3.1(2h,s)，2.34(3h,s)；13c-nmr(75mhz,dmso):196.8，163.8，156.9，149.0，147.3，138.2，132.4，130.8，126.7，119.6，113.8，113.0，102.8，95.1，82.8，56.1，43.0，21.3；hrms(esi)for(m+h)+:calcd457.0952，found457.0957。
實施例3得到62.70g白色固體，即化合物c。實施例3的收率為80.4％。其質(zhì)譜結(jié)果如下：1h-nmr(300mhz,dmso):8.4-8.1(4h,m,j＝7.5hz),6.99(1h,m)，6.9-6.7(2h,m,j＝7.5hz)6.18(1h,m,j＝7.8hz)，6.14(1h,m,j＝7.8hz)，5.51(1h,s),5.35(2h,s)，3.4-3.1(2h,s),3.83(3h,s)；13c-nmr(75mhz,dmso):196.8,163.8,156.9,151.7,149.0,147.3,141.5,130.8,130.1,123.8,119.6,113.8,113.0,102.8,95.1,82.8,56.1,43.0；hrms(esi)for(m+h)+:calcd488.0646,found488.0651。
實施例4得到64.80g白色固體，即化合物d。實施例4的收率為82.5％。其質(zhì)譜結(jié)果如下：1h-nmr(300mhz,dmso):7.6-7.2(3h,m,j＝7.5hz),6.99(1h,m),6.9-6.7(2h,m,j＝7.5hz),6.18(1h,m,j＝7.8hz),6.14(1h,m,j＝7.8hz),5.51(1h,s),5.35(2h,s),3.83(3h,s),3.4-3.1(2h,s),2.64(3h,s)；13c-nmr(75mhz,dmso):196.8,163.8,156.9,149.0,147.3,144.6,138.8,133.8,132.2,130.8,128.2,119.6,113.8,113.0,102.8,95.1,82.8,56.1,43.0,21.4；hrms(esi)for(m+h)+:calcd491.0562,found491.0567。
實施例5得到63.80g白色固體，即化合物e。實施例5的收率為84.4％。其質(zhì)譜結(jié)果如下：1h-nmr(300mhz,dmso):7.8-7.1(4h,m,j＝7.5hz),6.99(1h,m),6.9-6.7(2h,m,j＝7.5hz),6.18(1h,m,j＝7.8hz),6.14(1h,m,j＝7.8hz),5.51(1h,s),5.35(2h,s),3.83(6h,s)，3.4-3.1(2h,s)；13c-nmr(75mhz,dmso):196.8,164.4,163.8,156.9,149.0,147.3,132.6,130.8,127.7,119.6,115.6,113.8,113.0,102.8,95.1,82.8,56.1,43.0；hrms(esi)for(m+h)+:calcd473.0901,found473.0906。
實施例6
實施例6的橙皮素酯化物中r1為h，r2、r3、r5及r6同時為h，r4為cl。實施例6的橙皮素酯化物的制備方法如下：將0.16mol橙皮苷置于反應(yīng)容器中，加入300ml的dmso得到水解液。然后滴入濃硫酸調(diào)節(jié)水解液的ph值為6，再于60℃下磁力攪拌反應(yīng)5小時，靜置過濾得到沉淀物，烘干得到0.12mol橙皮素。將0.12mol橙皮素和0.12mol4-cl-苯磺酸充分溶解于400mldmf中，并滴入0.06moldcc作脫水劑，加入0.48mol碳酸鉀于60℃下回流反應(yīng)7小時，得到的溶液冷卻至室溫，用水洗滌，靜置分離有機層，并濃縮有機層，再采用甲醇重結(jié)晶得白色固體。
實施例7
實施例7的橙皮素酯化物中r1為h，r2、r3、r5及r6同時為h，r4為乙氧基。實施例7的橙皮素酯化物的制備方法如下：將0.16mol橙皮苷置于反應(yīng)容器中，加入500ml的dmso得到水解液。然后滴入濃硫酸調(diào)節(jié)水解液的ph值為7，再于80℃下磁力攪拌反應(yīng)3小時，靜置過濾得到沉淀物，烘干得到0.13mol橙皮素。將0.13mol橙皮素和0.20mol4-乙氧基苯磺酸酯充分溶解于400mldmf中，并滴入0.20moldcc作脫水劑，加入0.13mol碳酸鉀于80℃下回流反應(yīng)6小時，得到的溶液冷卻至室溫，用水洗滌，靜置分離有機層，并濃縮有機層，再采用甲醇重結(jié)晶得白色固體。
實施例8
實施例8的橙皮素酯化物為化合物(s,e)-2-(3,4-二甲氧基苯基)-5-羥基-4-氧代色滿-7-基苯磺酸酯，其結(jié)構(gòu)式如上述化合物f所示。
實施例8的橙皮素酯化物的主要原料為橙皮苷和苯磺酸。實施例8的橙皮素酯化物的制備方法如下：
將0.16mol橙皮苷置于反應(yīng)容器中，加入500ml的dmso得到水解液。然后滴入50ml濃硫酸調(diào)節(jié)水解液的ph值為5，再于100℃下磁力攪拌反應(yīng)2小時，冷卻至室溫。向溶液中加入0.70mol碘甲烷，接著在室溫下攪拌8小時，靜置過濾得到沉淀物，烘干得到0.128mol橙皮素衍生物。
將0.128mol橙皮素衍生物和0.2mol苯磺酸充分溶解于400mldmf中，并滴入0.13moldcc作脫水劑，加入0.42mol碳酸鈉于100℃下回流反應(yīng)6小時，得到的溶液冷卻至室溫，用水洗滌，靜置分離有機層，并濃縮有機層，再采用甲醇重結(jié)晶得58.94g白色固體，即化合物f。實施例8的收率為80.7％。
實施例8的橙皮素酯化物的質(zhì)譜結(jié)果如下：1h-nmr(300mhz,dmso):7.9-7.6(5h,m,j＝7.5hz),7.03(1h,m),6.81(2h,m,j＝7.5hz),6.18(1h,m,j＝7.8hz),6.14(1h,m,j＝7.8hz),5.51(1h,s),5.35(1h,s),3.83(6h,s)3.4-3.1(2h,s)；13c-nmr(75mhz,dmso):196.8,163.8,156.9,150.0,148.7,135.4,132.5,130.4,128.1,119.3,112.6,109.4,102.8,95.1,82.8,56.1,43.0；hrms(esi)for(m+h)+:calcd457.0952,found457.0957。
實施例9～12
實施例9的橙皮素酯化物為化合物(s,e)-2-(3,4-二甲氧基苯基)-5-羥基-4-氧代色滿-7-基4-甲基苯磺酸酯，其結(jié)構(gòu)式如上述化合物g所示。
實施例10的橙皮素酯化物為化合物(s,e)-2-(3,4-二甲氧基苯基)-5-羥基-4-氧代色滿-7-基4-硝基苯磺酸酯，其結(jié)構(gòu)式如上述化合物h所示。
實施例11的橙皮素酯化物為化合物(s,e)-2-(3,4-二甲氧基苯基)-5-羥基-4-氧代色滿-7-基2-氯-6-甲基苯磺酸酯，其結(jié)構(gòu)式如上述化合物j所示。
實施例12的橙皮素酯化物為化合物(s,e)-2-(3,4-二甲氧基苯基)-5-羥基-4-氧代色滿-7-基4-甲氧基苯磺酸酯，其結(jié)構(gòu)式如上述化合物k所示。
實施例9～12的主要原料為橙皮苷和相應(yīng)的苯磺酸衍生物。實施例9～12中橙皮苷發(fā)生水解和甲基化反應(yīng)得到橙皮素衍生物的步驟與實施例8相同；實施例9～12中橙皮素衍生物和相應(yīng)的苯磺酸衍生物發(fā)生磺酸酯化反應(yīng)得到橙皮素酯化物的步驟與實施例8除了原料不同，其他比例均相同：相應(yīng)的苯磺酸衍生物的加入量均為0.2mol。
實施例9得到60.00g白色固體，即化合物g。實施例9的收率為79.7％。其質(zhì)譜結(jié)果如下：1h-nmr(300mhz,dmso)：7.8-7.4(4h,m,j＝7.5hz),7.03(1h,m),6.81(2h,m,j＝7.5hz),6.18(1h,m,j＝7.8hz)，6.14(1h,m,j＝7.8hz),5.51(1h,s),5.35(1h,s),3.83(6h,s),3.4-3.1(2h,s),2.34(3h,s)；13c-nmr(75mhz,dmso)：196.8,163.8,156.9,150.0,148.7,138.2,132.4,130.4,126.7,119.3,112.6,109.4,102.8,95.1,82.8,56.1,43.0,21.3；hrms(esi)for(m+h)+:calcd471.1108,found471.1114。
實施例10得到67.08g白色固體，即化合物h。實施例10的收率為83.6％。其質(zhì)譜結(jié)果如下：1h-nmr(300mhz,dmso):8.4-8.1(4h,m,j＝7.5hz),7.03(1h,m),6.81(2h,m,j＝7.5hz),6.18(1h,m,j＝7.8hz),6.14(1h,m,j＝7.8hz),5.51(1h,s),5.35(1h,s),3.83(6h,s),3.4-3.1(2h,s)；13c-nmr(75mhz,dmso):196.8,163.8,156.9,151.7,150.0,148.7,141.5,130.4,123.8,119.3,112.6,109.4,102.8,95.1,82.8,56.1,51.7,43.0；hrms(esi)for(m+h)+:calcd502.0802,found502.0808。
實施例11得到65.60g白色固體，即化合物i。實施例11的收率為81.2％。其質(zhì)譜結(jié)果如下：1h-nmr(300mhz,dmso)：7.6-7.2(3h,m,j＝7.5hz),7.03(1h,m),6.81(2h,m,j＝7.5hz),6.18(1h,m,j＝7.8hz),6.14(1h,m,j＝7.8hz),5.51(1h,s),5.35(1h,s),3.83(6h,s),3.4-3.1(2h,s),2.64(3h,s)；13c-nmr(75mhz,dmso)：196.8,163.8,156.9,150.0,148.7,144.6,138.8,133.8,132.2,130.6,128.2,119.3,112.6,109.4,102.8,95.1,82.8,56.1,43.0,21.4；hrms(esi)for(m+h)+:calcd505.0718,found505.0724。
實施例12得到66.24g白色固體，即化合物j。實施例12的收率為85.1％。其質(zhì)譜結(jié)果如下：1h-nmr(300mhz,dmso):7.8-7.1(4h,m,j＝7.5hz),7.03(1h,m),6.81(2h,m,j＝7.5hz),6.18(1h,m,j＝7.8hz),6.14(1h,m,j＝7.8hz),5.51(1h,s),5.35(1h,s),3.83(9h,s),3.4-3.1(2h,s)；13c-nmr(75mhz,dmso):196.8,164.4,163.8,156.9,150.0,148.7,132.6,130.4,127.7,119.3,115.6,112.6,109.4,102.8,95.1,82.8,56.1,43.0,21.4；hrms(esi)for(m+h)+:calcd487.1057,found487.1063。
實施例13
實施例13的橙皮素酯化物中r1為ch3，r2、r3、r5及r6同時為h，r4為cl。實施例13的橙皮素酯化物的制備方法如下：將0.16mol橙皮苷置于反應(yīng)容器中，加入300ml的dmso得到水解液。然后滴入濃硫酸調(diào)節(jié)水解液的ph值為6，再于60℃下磁力攪拌反應(yīng)5小時，冷卻至室溫。向溶液中加入0.48mol碘甲烷，接著在室溫下攪拌10小時，靜置過濾得到沉淀物，烘干得到0.128mol橙皮素衍生物。將0.128mol橙皮素衍生物和0.12mol4-cl-苯磺酸充分溶解于400mldmf中，并滴入0.06moldcc作脫水劑，加入0.48mol碳酸鉀于60℃下回流反應(yīng)7小時，得到的溶液冷卻至室溫，用水洗滌，靜置分離有機層，并濃縮有機層，再采用甲醇重結(jié)晶得白色固體。
實施例14
實施例14的橙皮素酯化物中r1為c2h5，r2、r3、r5及r6同時為h，r4為乙氧基。實施例14的橙皮素酯化物的制備方法如下：將100g(0.16mol)橙皮苷置于反應(yīng)容器中，加入300ml的dmso得到水解液。然后滴入濃硫酸調(diào)節(jié)水解液的ph值為6，再于60℃下磁力攪拌反應(yīng)5小時，冷卻至室溫。向溶液中加入0.80mol碘乙烷，接著在室溫下攪拌6小時，靜置過濾得到沉淀物，烘干得到0.128mol橙皮素衍生物。將0.128mol橙皮素衍生物和0.12mol4-cl-苯磺酸充分溶解于400mldmf中，并滴入0.06moldcc作脫水劑，加入0.48mol碳酸鉀于60℃下回流反應(yīng)7小時，得到的溶液冷卻至室溫，用水洗滌，靜置分離有機層，并濃縮有機層，再采用甲醇重結(jié)晶得白色固體。
實施例15
實施例15的橙皮素酯化物中r1為ch3，r2、r3、r5及r6同時為h，r4為乙氧基。實施例15的橙皮素酯化物的制備方法如下：將0.16mol橙皮苷衍生物(化合物ⅲ，r1為ch3)置于反應(yīng)容器中，加入300ml的dmso得到水解液。然后滴入濃硫酸調(diào)節(jié)水解液的ph值為6，再于60℃下磁力攪拌反應(yīng)5小時，靜置過濾得到沉淀物，烘干得到0.128mol橙皮素衍生物。將0.128mol橙皮素衍生物和0.12mol4-cl-苯磺酸充分溶解于400mldmf中，并滴入0.06moldcc作脫水劑，加入0.48mol碳酸鉀于60℃下回流反應(yīng)7小時，得到的溶液冷卻至室溫，用水洗滌，靜置分離有機層，并濃縮有機層，再采用甲醇重結(jié)晶得白色固體。
將實施例1～5及實施例8～12得到的橙皮素酯化物分別進行抗腫瘤活性試驗。具體試驗為腫瘤細胞增殖抑制試驗，試驗方法采用常規(guī)的mtt法(參考呂秋軍主編《新藥藥理學(xué)研究方法》，2007：242-243)。細胞株選用：非小細胞肺癌細胞(a549)，人肝癌細胞(smmc-7721)，人膠質(zhì)瘤細胞(u251)，人胃腺癌細胞(sgc-7901)，人乳腺癌細胞(mcf-7)。培養(yǎng)液為dmem+15％nbs+雙抗。
樣品液的配制：用dmso(merck)溶解后，加入pbs(-)配成的100ìmol/l的溶液或者均勻的混懸液，然后用dmso的pbs(-)稀釋，最終濃度分別為0.1、1、10、20、40、60、80100ìmol/l。將上市的抗腫瘤藥物阿糖胞苷(ara-c)以同樣的條件配成對照品溶液。
細胞培養(yǎng)：貼壁生長腫瘤細胞培養(yǎng)于含10％滅活新生牛血清和青霉素、鏈霉素(各100萬u/l)的1640培養(yǎng)液中，置于37℃，5％co2，飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞貼壁生長，每2～3天傳代1次，傳代時首先倒出培養(yǎng)液，pbs洗2次，胰酶消化后，加入新鮮的培養(yǎng)液吹打均勻，調(diào)整細胞至適當濃度移入新的培養(yǎng)瓶中，添加培養(yǎng)液至適量。取對數(shù)生長期細胞用于實驗。
mtt法檢測細胞活性及ic50的測定。
實驗原理：活細胞線粒體中脫氫酶能將黃色的mtt還原成不溶于水的藍紫色產(chǎn)物甲臜(mttformazan)，并沉積在細胞中，生成的量與活細胞數(shù)目成正比，而死細胞沒有這種功能。dmso能溶解藍紫色結(jié)晶物，顏色深淺與所含的量成正比，因此用酶標儀測定的光吸收值可反映細胞存活率。
實驗方法：取對數(shù)生長期細胞，消化、計數(shù)，以2×104/ml的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100ìl。培養(yǎng)24小時后，將待測化合物以0.1，1，10，20，40，60，80，100ìmol/l濃度處理細胞。實驗組每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，以含0.4％dmso的培養(yǎng)液作對照。藥物作用48小時后，棄上清，每孔加入100ìl的mtt(2-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-3,5-二苯基-2h-四唑氫溴酸鹽)(1mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，棄上清，每孔加入100ìl的dmso，振蕩混勻，用酶標儀在570nm處測定吸光度值，采用ic50計算軟件求出半數(shù)抑制濃度(ic50)。得到實施例的化合物及對照組的抗腫瘤藥物阿糖胞苷(ara-c)對不同腫瘤細胞的半數(shù)抑制濃度ic50的結(jié)果見表1(單位：ìmol/l)。
表1
以上實驗結(jié)果表明，本發(fā)明的橙皮素酯化物均具有良好的抗腫瘤活性。且其中化合物a、b、c、d、f、g、h、j在體外抗腫瘤活性突出，優(yōu)于或接近抗腫瘤藥物阿糖胞苷(ara-c)，此外也發(fā)現(xiàn)不同橙皮素酯化物對不同腫瘤細胞的活性不同。因此本發(fā)明橙皮素酯化物及其藥學(xué)上可接受的鹽或藥學(xué)上可接受的溶劑合物或者其混合物作為活性成份的藥物組合物可以用于制備抗腫瘤藥物。
以上所述實施例的各技術(shù)特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術(shù)特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當認為是本說明書記載的范圍。
以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準。