本發(fā)明一株抗苯乙醇胺a單克隆抗體雜交瘤細胞株k-6及其應(yīng)用，屬于食品安全免疫學(xué)檢測領(lǐng)域，涉及雜交瘤細胞株k-6及其產(chǎn)生的抗苯乙醇胺a單克隆抗體。

背景技術(shù)：

β-腎上腺受體興奮劑是一類能夠促進瘦肉生長的飼料添加劑，能夠顯著提高豬、牛、羊等牲畜的瘦肉生長率，從而使體重也得以增加。且這類藥物性質(zhì)穩(wěn)定、不易破壞，能通過進食攝取危害人體健康，嚴重的甚至有可能導(dǎo)致死亡。苯乙醇胺a具有典型的苯乙醇胺結(jié)構(gòu)，由于同β-腎上腺受體興奮劑結(jié)構(gòu)類似，因而被認為是一種新型“瘦肉精”。用其飼喂動物同樣具有促進骨骼生長，減少脂肪蓄積，增加瘦肉率等作用。由于苯乙醇胺a（簡稱pea）的檢測手段滯后，替代克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇等瘦肉精被廣泛應(yīng)用，造成苯乙醇胺a在可食性動物體內(nèi)蓄積性殘留，人食用后可引起頭暈、心跳加快、肌肉震顫、心悸、呼吸困難等癥狀，嚴重可引起中毒，甚至死亡，嚴重威脅人類的健康。我國農(nóng)業(yè)部的第1519號公告將苯乙醇胺a列為禁止在飼料和動物飲水中使用的物質(zhì)。

目前檢測苯乙醇胺a的方法主要是液相色譜法（hplc），液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（lc-ms/ms），酶聯(lián)免疫吸附法，免疫親和色譜柱和電化學(xué)傳感器等方法，但是這些方法存在操作繁瑣，耗時，費用比較貴等缺點，不能實現(xiàn)大量樣品的快速檢測，因此建立一種快速簡便的檢測方法具有重要意義。酶聯(lián)免疫法（elisa）是一種極為高效、敏感、快速的檢測方法，檢測時對樣本的純度要求不高而且操作簡便，適用于大量樣本的現(xiàn)場快速檢測。然而得到高特異性和高靈敏度的單克隆單體是免疫學(xué)檢測的前提，其中人工抗原的合成是其中重要的一步。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種對苯乙醇胺a具有較好特異性和檢測靈敏度的單克隆抗體雜交瘤細胞株的制備方法。

本發(fā)明提供一種抗苯乙醇胺a單克隆抗體雜交瘤細胞株，由該細胞株制備的抗體對苯乙醇胺a具有較好特異性和檢測靈敏度，可以用來建立苯乙醇胺a的免疫學(xué)檢測方法。

本發(fā)明提供一種對苯乙醇胺a具有較好特異性和檢測靈敏度的單克隆抗體的制備方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案：一株抗苯乙醇胺a單克隆抗體雜交瘤細胞株k-6，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱cgmcc，保藏編號為cgmccno.13092。

抗苯乙醇胺a單克隆抗體，它由所述保藏編號為cgmccno.13092的抗苯乙醇胺a單克隆抗體雜交瘤細胞株k-6分泌產(chǎn)生。

所述抗苯乙醇胺a單克隆抗體的應(yīng)用，用于食品安全檢測中苯乙醇胺a的殘留檢測。

本發(fā)明提供的細胞株k-6的制備基本步驟為：

1）免疫原的合成：采用蘭尼鎳還原法制備苯乙醇胺a的氨基衍生物制備含氨基半抗原，采用重氮化法合成苯乙醇胺a人工抗原。稱取4mg苯乙醇胺a于小玻璃瓶中，加入200μl的1mhcl溶液，再加入1ml超純水至完全溶解，4℃預(yù)冷30min；在溶液中加入18μl的30%nano2溶液，冰水浴反應(yīng)1h，得到活化液；用cb緩沖液稀釋牛血清蛋白（bsa）12mg；將適量活化液滴加入載體蛋白bsa中，邊滴加活化液，邊調(diào)節(jié)ph至9.0，直至反應(yīng)液顏色變深黃色停止滴加活化液，冰水浴反應(yīng)4～6小時；

2）包被原的合成：利用章魚胺，發(fā)生還原胺化反應(yīng)，水解后引入活性羧基制備含羧基半抗原（rct），rct半抗原結(jié)構(gòu)式為：

稱取10mgrct半抗原于棕色小瓶中，加入800μl的無水dmf和1ml的ph4.7、0.1mmes緩沖溶液溶解；將22.6mgedc和13.6mgnhs固體加入到半抗原反應(yīng)瓶中，攪拌6～8h，得到活化液；稱取牛血清蛋白bsa溶解于cb溶液中，將活化液加入到蛋白質(zhì)溶液中，用1mnaoh溶液調(diào)節(jié)ph至9.0，室溫反應(yīng)過夜，整個過程避光進行。通過透析分離完全抗原和未偶聯(lián)的小分子半抗原，并通過紫外吸收掃描方法鑒定；包被原偶聯(lián)式rct-bsa如下式所示：

3）小鼠的免疫：苯乙醇胺a完全抗原與等量弗氏佐劑混合乳化后，通過背部皮下注射免疫balb/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐劑，之后都用不完全弗氏佐劑。首免與加強免之間間隔一個月，加強免之間間隔21天。最后一次用苯乙醇胺a完全抗原（不含佐劑）沖擊免疫；通過間接elisa檢測血清效價和抑制；

4）細胞融合與細胞株建立：通過聚乙二醇（peg1500）法將小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞融合，通過hat培養(yǎng)基培養(yǎng)，利用間接elisa檢測陽性細胞孔，并進一步利用間接競爭elisa法測定陽性細胞孔的抑制效果，通過有限稀釋法對有最好抑制的陽性細胞孔進行三次亞克隆，最終篩選獲得雜交瘤細胞株k-6；

5）雜交瘤細胞株k-6性質(zhì)的鑒定：通過elisa法測定靈敏度和特異性。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：（1）本發(fā)明獲得的抗苯乙醇胺a單克隆抗體細胞株k-6，對苯乙醇胺a有較好的檢測靈敏度和特異性（ic50值為0.24ng/ml）；（2）一種新的半抗原合成的思路，在用異原包被進行檢測，得到靈敏度很好的單克隆抗體細胞株。

生物材料樣品保藏：一株單克隆細胞株k-6，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱cgmcc，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為cgmccno.13092，保藏日期2016年10月31日。

附圖說明

圖1.苯乙醇胺a免疫原合成紫外鑒定圖。

圖2.細胞株k-6分泌的單克隆抗體的抑制標(biāo)準曲線。

具體實施方式

本發(fā)明下面的實施例僅作為本發(fā)明內(nèi)容的進一步說明，不能作為本發(fā)明的限定內(nèi)容或范圍。下面通過實施例對本發(fā)明作進一步說明。

本發(fā)明通過將苯乙醇胺a完全抗原免疫小鼠，通過細胞融合，hat選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，通過間接elisa和間接競爭elisa篩選細胞上清，最終得到了對苯乙醇胺a有較好特異性和靈敏度的單克隆抗體雜交瘤細胞株。

實施例1：雜交瘤細胞株k-6的制備

1、完全抗原的合成

稱取4mg苯乙醇胺a于小玻璃瓶中，加入200μl的1mhcl溶液，再加入1ml超純水至完全溶解，4℃預(yù)冷30min；在溶液中加入18μl的質(zhì)量百分濃度30%nano2溶液，冰水浴反應(yīng)1h，得到活化液；用cb緩沖液稀釋牛血清蛋白(bsa)12mg；將適量活化液滴加入載體蛋白bsa中，邊滴加活化液，邊調(diào)節(jié)ph至9.0，直至反應(yīng)液顏色變深黃色停止滴加活化液，冰水浴反應(yīng)4～6小時后，通過透析分離完全抗原和未偶聯(lián)的小分子，并通過紫外吸收掃描方法鑒定。

2、動物免疫

選擇健康的6～8周齡的balb/c小鼠進行免疫。取苯乙醇胺a完全抗原與等量弗氏佐劑混合乳化后，通過背部皮下注射免疫balb/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐劑，之后都用不完全弗氏佐劑。首免與加強免之間間隔一個月，加強免之間間隔21天。三免后7天采血，使用間接競爭elisa方法測定小鼠血清效價和抑制，選擇效價高抑制好的小鼠，在四免后18天沖擊免疫，不使用佐劑，腹腔注射。

3、細胞融合

在沖擊免疫3天后，按照常規(guī)peg（聚乙二醇，分子量為1500）方法進行細胞融合，具體步驟如下：（1）無菌取小鼠脾臟，研磨并通過200目細胞篩網(wǎng)得到脾細胞懸液，并進行細胞計數(shù)；（2）收集sp2/0細胞，懸浮于rpmi-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，進行細胞計數(shù)；（3）將脾細胞和sp2/0細胞按照計數(shù)比1︰10的比例混合，離心后用50%peg融合，時間1min，之后按照從慢到快，加入rpmi-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，離心后懸浮于含20%胎牛血清、2%的50×hat的rpmi-1640篩選培養(yǎng)液中，加到96孔細胞培養(yǎng)板，置于37℃、5%co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4、細胞篩選與細胞株建立

在細胞融合的第3天對融合細胞進行rpmi-1640篩選培養(yǎng)液半換液，第5天進行用含20%胎牛血清、1%的100×ht的rpmi-1640過渡培養(yǎng)液進行全換液，在第7天取細胞上清進行篩選。篩選分兩步：第一步先用間接elisa篩選出陽性細胞孔，第二步選用苯乙醇胺a為標(biāo)準品，用間接競爭elisa對陽性細胞進行抑制效果測定。選擇對苯乙醇胺a標(biāo)準品均有較好抑制的細胞孔，采用有限稀釋法進行亞克隆，用同樣的方法進行檢測。重復(fù)三次，獲得細胞株k-6。

5、單克隆抗體的制備與鑒定

取8～10周齡balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蠟油1ml；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶雜交瘤細胞，從第7天開始收集腹水，將腹水通過辛酸-硫酸銨法純化，獲得的單抗置于-20℃保存。

使用間接競爭elisa，測定單克隆抗體苯乙醇胺a的ic50為：0.24ng/ml，說明對苯乙醇胺a有很好的靈敏度，可用于苯乙醇胺a免疫分析檢測。

6、抗體應(yīng)用

將雜交瘤細胞株k-6通過體內(nèi)腹水制備的單克隆抗體應(yīng)用于苯乙醇胺a的elisa添加回收試驗，具體步驟如下：

（1）包被：將包被原rct-bsa用0.05mph9.6碳酸鹽緩沖液從2μg/ml開始倍比稀釋，100μl/孔，37℃反應(yīng)2h；

（2）洗滌：將板內(nèi)溶液傾去，甩干，并用洗滌液洗滌3次，每次3min；

（3）封閉：拍干后，加入200μl/孔封閉液，37℃反應(yīng)2h。洗滌后烘干備用；

（4）加樣：將抗血清從1︰1000開始倍比稀釋，并加入到各稀釋度的包被孔中，100μl/孔，37℃反應(yīng)30min；充分洗滌后，加入1︰3000稀釋的hrp-羊抗鼠igg，100μl/孔，37℃反應(yīng)1min；

（5）顯色：將酶標(biāo)板取出，充分洗滌后，每孔加入100μl的tmb顯色液，37℃避光反應(yīng)15min；

（6）終止和測定：每孔加入50μl終止液2mh2so4以終止反應(yīng)，然后用酶標(biāo)儀測定各孔的od450值。

（7）結(jié)果判讀：以od450值大于或等于陰性對照孔的2.1倍（即p/n≥2.1）所對應(yīng)的血清最高稀釋倍數(shù)即為血清的elisa效價。

溶液的配置：

碳酸鹽緩沖液（cbs）：稱取na2co31.59g，nahco32.93g，分別溶于少量雙蒸水后混合，加雙蒸水至約800ml混勻，調(diào)ph值至9.6，加雙蒸水定容至1000ml，4℃貯存?zhèn)溆茫?/p>

磷酸鹽緩沖液（pbs）：8.00gnacl，0.2gkcl，0.2gkh2po4，2.9gna2hpo4·12h2o，溶于800ml純水中，用naoh或hcl調(diào)ph到7.2～7.4，定容至1000ml；

pbst：含0.05%吐溫20的pbs；

tmb顯色液：a液：na2hpo4·12h2o18.43g，檸檬酸9.33g，純水定容至1000ml；b液：60mgtmb溶于100ml乙二醇中。a、b液按體積比1︰5混合即為tmb顯色液，現(xiàn)用現(xiàn)混。

綜上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并非用來限定本發(fā)明的實施范圍。即凡依本發(fā)明申請專利范圍的內(nèi)容所作的等效變化與修飾，都應(yīng)為本發(fā)明的技術(shù)范疇。