本發(fā)明屬于核酸檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種原位核酸檢測方法。

背景技術(shù)：

核酸原位檢測技術(shù)能夠?qū)?xì)胞和組織樣本中的dna和rna進(jìn)行定位檢測。傳統(tǒng)的核酸原位檢測技術(shù)為原位雜交技術(shù)(ish)，該方法通過標(biāo)記的檢測探針與目標(biāo)核酸進(jìn)行雜交，未結(jié)合的探針被洗去，與目標(biāo)核酸特異雜交的檢測探針通過標(biāo)記被檢測，從而實現(xiàn)目標(biāo)核酸的檢測。其中，單分子熒光原位雜交技術(shù)(smfish)通過在單個rna分子上雜交多個檢測探針獲得足夠強(qiáng)的信號而實現(xiàn)對單個rna分子進(jìn)行原位檢測。與傳統(tǒng)的ish相比，單分子熒光原位雜交技術(shù)具有更高的靈敏度和特異性。

通過滾環(huán)擴(kuò)增亦可以實現(xiàn)對信號的放大，其前提是將檢測目標(biāo)核酸分子轉(zhuǎn)化為檢測與目標(biāo)核酸分子特異對應(yīng)的環(huán)狀核酸分子。鎖式探針法單分子rna原位檢測技術(shù)就是這樣的一種方法，該方法除了能夠檢測單分子rna，還能夠?qū)崿F(xiàn)對堿基變異的檢測。該方法通過一條單鏈dna構(gòu)成鎖式探針的兩段區(qū)域與目標(biāo)核酸的靶序列特異雜交，當(dāng)探針兩端的堿基與靶序列完全互補(bǔ)時，dna連接酶將探針兩端連接形成一個環(huán)狀dna分子，而后通過滾環(huán)擴(kuò)增(rca)對環(huán)狀dna分子進(jìn)行擴(kuò)增，最后再用檢測探針檢測擴(kuò)增產(chǎn)物實現(xiàn)對目標(biāo)rna的檢測。對堿基突變的檢測通常由帶有特異檢測探針結(jié)合區(qū)域的兩條或者兩條以上的鎖式探針同時與目標(biāo)核酸的靶序列競爭雜交，最終完全互補(bǔ)的鎖式探針結(jié)合到靶序列上并進(jìn)一步被連接和擴(kuò)增，通過特異的檢測探針獲得變異堿基的信息。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種原位核酸檢測方法，高度整合了原位雜交技術(shù)、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)和雙連接探針技術(shù)，實現(xiàn)對樣品中的核酸靶序列的檢測。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種原位核酸檢測方法，包括如下步驟：

(1)使至少一對連接探針與待測樣品中的靶序列特異的雜交互補(bǔ)；每對連接探針中包括一上游探針和一下游探針：上游探針的3’端具有一與上述靶序列的上游序列特異互補(bǔ)的上游識別序列，5’端具有一上游成環(huán)連接模板互補(bǔ)序列；下游探針的5’端具有一與上述靶序列的下游序列特異互補(bǔ)的下游識別序列，3’端具有一下游成環(huán)連接模板互補(bǔ)序列；上述靶序列的上游序列和下游序列互不重疊；

(2)通過連接酶將與待測樣品中的靶序列特異的雜交互補(bǔ)的上游識別序列和下游識別序列連接起來，形成至少一第一序列；

(3)使至少一成環(huán)連接模板同時與至少一第一序列兩側(cè)的上游成環(huán)連接模板互補(bǔ)序列和下游成環(huán)連接模板互補(bǔ)序列特異的雜交互補(bǔ)，上述上游成環(huán)連接模板互補(bǔ)序列和下游成環(huán)連接模板互補(bǔ)序列相對成環(huán)連接模板互不重疊；

(4)通過連接酶將與上述成環(huán)連接模板特異的雜交互補(bǔ)的上游成環(huán)連接模板互補(bǔ)序列和下游成環(huán)連接模板互補(bǔ)序列連接起來，得到至少一環(huán)形模板；

(5)對上述至少一環(huán)形模板通過滾環(huán)擴(kuò)增，得到至少一滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物；

(6)將上述至少一滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物與至少一檢測探針雜交以進(jìn)行檢測。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述靶序列為dna、rna或rna通過逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cdna。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述檢測探針修飾有熒光標(biāo)記物、顯色標(biāo)記物、酶標(biāo)記物、放射性標(biāo)記物、磁性標(biāo)記物或發(fā)光密度標(biāo)記物。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，至少一對連接探針中含有自然和/或非自然核苷酸。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述成環(huán)連接模板中含有自然和/或非自然核苷酸。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述待測樣品包括培養(yǎng)的細(xì)胞、組織和組織切片中的細(xì)胞。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述連接酶包括t4dna連接酶和ampligasedna連接酶。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明能夠有效的實現(xiàn)對目標(biāo)核酸的檢測，信噪比高，特異性好。

附圖說明

圖1為本發(fā)明中的一對連接探針的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為本發(fā)明的原理示意圖。

圖3為本發(fā)明實施例1的檢測結(jié)果圖。

具體實施方式

以下通過具體實施方式結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步的說明和描述。

實施例1人皮膚成纖維細(xì)胞為實驗樣品考察雙連接探針法原位檢測細(xì)胞actbmrna。

(一)細(xì)胞培養(yǎng)與固定：

人皮膚成纖維細(xì)胞經(jīng)dmem(含10％fbs)培養(yǎng)24-48h后，用胰蛋白酶處理成懸浮細(xì)胞，并種板于表面帶多聚賴氨酸的無菌載玻片上，重新培養(yǎng)12-24h。depc-pbs沖洗，3×3min；用depc-pbs配置的3％pfa常溫固定30min；再次用depc-pbs沖洗一次后，分別經(jīng)梯度乙醇：70％、85％、100％脫水處理，各5min?？諝饬栏?。

(二)actb的mrna原位逆轉(zhuǎn)錄

對人成纖維細(xì)胞的細(xì)胞膜進(jìn)行透膜打孔，在樣本上加入0.1mhcl室溫下孵育5min。用depc-pbs-tween20洗三次后進(jìn)行actbmrna的原位逆轉(zhuǎn)錄。在反應(yīng)體系中，以樣本中所含有的actb的mrna為模板，加入50ul含有1mmdntp、1μm逆轉(zhuǎn)錄引物(5'-ctgacccatgcccaccatcacgccc-3’，seqidno01)和20u/ulrevertaidhminusm-mulv逆轉(zhuǎn)錄酶(fermentas)以及1u/μlribolockrna酶抑制劑(fermantas)以及終濃度為1x的rtbuffer(fermantas)的逆轉(zhuǎn)錄混合液，mrna分子在原位下被逆轉(zhuǎn)錄成cdna。37℃下孵育3小時后，用depc-pbs-tween20洗三次。

(三)原位核酸檢測，如圖1和圖所示，具體包括如下步驟：

(1)雙連接探針雜交連接

在樣品加入50ul含有終濃度為1×的ampligasebuffer(epicenter)、0.1μm上游探針、0.1μm下游探針、0.5u/μlampligase(epicenter)、1u/μlribolockrna酶抑制劑(fermantas)、50mmkcl和20％甲酰胺的連接反應(yīng)混合液，37℃下孵育30分鐘后，45℃下孵育45分鐘。使一對連接探針與上述cdna中的靶序列特異的雜交互補(bǔ)；每對連接探針中包括一上游探針

(5'-gccggcttcgcgggcgacgattcctctatgattactgacctatgc-3’，seqidno02)和一下游探針

(5'-gtctatttagtggagcctcttctttacggcgccggcatgtgcaag-3’，seqidno03)：上游探針的3’端具有一與上述靶序列的上游序列特異互補(bǔ)的上游識別序列，5’端具有一上游成環(huán)連接模板互補(bǔ)序列；下游探針的5’端具有一與上述靶序列的下游序列特異互補(bǔ)的下游識別序列，3’端具有一下游成環(huán)連接模板互補(bǔ)序列；上述靶序列的上游序列和下游序列互不重疊；具體的，上述上游探針和下游探針經(jīng)t4pnk磷酸化處理(將含有2μm探針、1×pnkbuffera(fermentas)、1mmatp、0.1u/μlt4多聚核苷酸激酶(fermantas)的反應(yīng)混合物在37℃條件下先反應(yīng)10min，然后在65℃繼續(xù)反應(yīng)10min，完成后-20℃保存?zhèn)溆?。通過ampligasedna連接酶將與靶序列特異的雜交互補(bǔ)的上游識別序列和下游識別序列連接起來(連接反應(yīng)條件為37℃，30min后45℃，45min)，形成一第一序列；反應(yīng)完成后用depc-pbs-tween20洗三次。

(2)探針成環(huán)

在樣本中加入50ul含有終濃度為1×的ampligasebuffer(epicenter)、1μm成環(huán)模板寡核酸(5'-ctaaatagacgcataggtca-3’，seqidno04)、0.5u/μlampligase(epicenter)、1u/μlribolockrna酶抑制劑(fermantas)、50mmkcl和20％甲酰胺的連接反應(yīng)混合液，37℃下孵育30分鐘后，45℃下孵育45分鐘。使一成環(huán)連接模板同時與第一序列兩側(cè)的上游成環(huán)連接模板互補(bǔ)序列和下游成環(huán)連接模板互補(bǔ)序列特異的雜交互補(bǔ)，上述上游成環(huán)連接模板互補(bǔ)序列和下游成環(huán)連接模板互補(bǔ)序列相對成環(huán)連接模板互不重疊；ampligasedna連接酶將與上述成環(huán)連接模板特異的雜交互補(bǔ)的上游成環(huán)連接模板互補(bǔ)序列和下游成環(huán)連接模板互補(bǔ)序列連接起來，得到一環(huán)形模板；

(3)滾環(huán)擴(kuò)增

對上述環(huán)形模板通過滾環(huán)擴(kuò)增，得到滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物，具體的：用depc-pbs-tween20洗三次，在樣本中加入50uldepc處理過的水中含有終濃度為1×的phi29buffer(fermantas)、1u/μlphi29聚合酶(fermantas)、0.25mmdntp、0.2mg/mlbsa以及5％甘油的滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)混合液，反應(yīng)條件為37℃下擴(kuò)增2-3h或室溫下過夜；

(4)檢測探針雜交和圖像獲取

將上述滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物與一檢測探針(5’-tgcgtctatttagtggagcc-3’，seqidno05，5’端標(biāo)記有cy3)雜交，最后用dapi進(jìn)行細(xì)胞核染色，進(jìn)行檢測，具體的：將樣本用depc-pbs-tween20洗三次后加入含有1μm檢測探針、20％甲酰胺的2×ssc緩沖液，37℃下孵育30分鐘后，分別經(jīng)梯度乙醇：70％、85％、100％脫水處理，各5min?？諝饬栏?。最后加入含有100ng/mldapi的goldantifademountan封片劑(fermantas)室溫下孵育10min后進(jìn)行熒光顯微鏡檢測并拍照。檢測結(jié)果如圖3所示。

以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實施的范圍，即依本發(fā)明專利范圍及說明書內(nèi)容所作的等效變化與修飾，皆應(yīng)仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內(nèi)。

<110>華僑大學(xué)

<120>一種原位核酸檢測方法

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<213>人工序列

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