本發(fā)明涉及基因缺失檢測領(lǐng)域，更具體地，涉及一種檢測y染色體azfa和azfb微缺失的多重pcr引物組、包括多重pcr引物組的該試劑盒和所述多重pcr引物組及試劑盒作為檢測y染色體azfa和azfb微缺失試劑的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

世界衛(wèi)生組織(who)的研究調(diào)查表明，全世界約有10-15％的育齡夫婦存在不孕不育，其中男性因素約占50％。y染色體微缺失，是除了克氏綜合征以外導(dǎo)致男性不育的第二大遺傳學(xué)病因。y染色體長臂的無精子因子(azf)是被證實(shí)為控制精子生成的關(guān)鍵基因簇；在男性不育領(lǐng)域，y染色體微缺失特指azf區(qū)微缺失。azf區(qū)分為azfa、azfb和azfc三個(gè)亞區(qū)，任何一個(gè)亞區(qū)的微缺失都可能導(dǎo)致生精障礙。

azfa區(qū)長度約為1100kb，該區(qū)候選功能基因有usp9y、dby、tb4y和uty，主導(dǎo)精母細(xì)胞的增生。azfa區(qū)缺失將導(dǎo)致嚴(yán)重的生精障礙、睪丸發(fā)育不良，表現(xiàn)為唯支持細(xì)胞綜合征，為絕對的無精子癥。azfa區(qū)完全缺失患者，即使通過睪丸穿刺手術(shù)無法獲得精子，因此不建議做單精子胞漿內(nèi)注射輔助生殖。有報(bào)道表明在azfa區(qū)部分缺失(sy83、sy86、sy84缺失)患者仍能自然生育男性后代，且子代與父代azfa缺失一致。

azfb區(qū)長度約為4.73mb，該區(qū)候選功能基因有smcy、eif1ay、rmby1a、cdy和xkry。azfb區(qū)缺失患者通常表現(xiàn)為生精阻滯，精子生成被阻滯在精母細(xì)胞或精子細(xì)胞階段，患者睪丸內(nèi)仍可見精原細(xì)胞和初級精母細(xì)胞，但沒有成熟精子生成。因此，azfb區(qū)完全缺失患者通過睪丸穿刺手術(shù)也無法獲得精子，也不能采用單精子胞漿內(nèi)注射輔助生殖。azfb區(qū)部分缺失患者臨床表現(xiàn)多樣，其睪丸組織內(nèi)尚存在一定的生精功能，可通過睪丸穿刺獲得精子進(jìn)行卵胞漿內(nèi)注射獲得后代。

azfc區(qū)域缺失是臨床上最常見的azf缺失類型，是引起生精障礙的一個(gè)重要原因。azfc缺失患者臨床表現(xiàn)多樣化，一般來說，患者尚存精子生成能力，因此可以通過輔助生殖技術(shù)獲得后代。

鑒于azfa區(qū)和azfb區(qū)部分缺失后生精能力的多樣性以及完全缺失導(dǎo)致的生精障礙的嚴(yán)重性，有必要對azfa區(qū)和azfb區(qū)缺患者的缺失程度及斷點(diǎn)位置進(jìn)行精確定位，確定其缺失類型是部分缺失或全部缺失，以正確評估患者睪丸生精障礙程度以及是否能夠獲得精子的可能性，為后續(xù)治療方案提供遺傳學(xué)依據(jù)。

azf微缺失的檢測主要是針對y染色體特定的序列標(biāo)簽位點(diǎn)(sts)檢測，2013年歐洲男科協(xié)會(eaa)和歐洲分子遺傳質(zhì)控網(wǎng)(emqn)聯(lián)合發(fā)布的《y染色體微缺失的最佳實(shí)踐操作指南》推薦檢測6個(gè)sts位點(diǎn)，即azfa(sy84，sy86)；azfb(sy127，sy134)；azfc(sy254，sy255)作為azf微缺失常規(guī)篩查位點(diǎn)。檢測這6個(gè)sts位點(diǎn)能夠診斷超過95％的azf缺失情形。然而，根據(jù)近幾年的基因型–臨床表型相關(guān)性數(shù)據(jù)，對于azfa(sy84，sy86)或者azfb(sy127，sy134)缺失，eaa/emqn指南推薦進(jìn)一步擴(kuò)大檢測位點(diǎn)以明確y染色體微缺失區(qū)域及類型：利用靠近著絲粒端的sy82、sy83/sy1064和靠近遠(yuǎn)端的sy1065/sy1182、sy88判斷azfa區(qū)域是否發(fā)生片段的完全缺失；利用靠近著絲粒端的sy105、sy121/sy1224和靠近遠(yuǎn)端的sy143/sy1192，sy153判斷azfb區(qū)域是否發(fā)生片段的完全缺失。

目前檢測azf區(qū)微缺失的方法包括多重pcr-凝膠電泳法、多重?zé)晒鈖cr法、芯片雜交法、多重連接探針擴(kuò)增(mlpa)等多種方法。最常用的是針對序列標(biāo)簽位點(diǎn)(sts)，采用多重pcr擴(kuò)增-凝膠電泳檢測，根據(jù)條帶的有無對azf各區(qū)的缺失情況做出定性分析。目前該方法已成為檢測azf微缺失的行業(yè)“金標(biāo)準(zhǔn)”；但是該方法的檢測敏感性不高，凝膠電泳易造成pcr產(chǎn)物污染導(dǎo)致假陽性；操作繁瑣，其檢測通量小，不適用于對大樣本量的檢測。多重?zé)晒鈖cr方法具有簡便、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，但是探針設(shè)計(jì)繁瑣并且需要報(bào)告基團(tuán)修飾，價(jià)格昂貴，不適合臨床推廣使用。目前，根據(jù)上述這兩種檢測方法，已有多種的y染色體微缺失檢測試劑盒面世。芯片雜交技術(shù)也有報(bào)道用于檢測azf區(qū)微缺失，該方法具有極高的準(zhǔn)確度和靈敏度；但是該方法需要設(shè)計(jì)大量的探針，成本較高，并且其檢測、分析也較為復(fù)雜，不適合臨床醫(yī)生判讀。

因此，建立一種簡單快速、準(zhǔn)確度高且低成本的分子遺傳學(xué)檢測方法對臨床具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提供一種操作簡單、高效、通過一次性擴(kuò)增多個(gè)基因片斷用于檢測y染色體azfa和azfb微缺失的方法。本發(fā)明克服了傳統(tǒng)多重pcr靈敏度低、非特異性擴(kuò)增等缺點(diǎn)，通過一套新型的穩(wěn)定的通用引物-多重pcr的反應(yīng)體系結(jié)合熒光標(biāo)記通用引物的方法，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳分析，確保了檢測的高靈敏度，有效降低了成本，并且可以實(shí)現(xiàn)大樣本量的高效檢測。毛細(xì)管的方法具有較高的分辨度和靈敏度，可以檢測單個(gè)核苷酸的差異，毛細(xì)管電泳圖清晰直觀，易于判讀，減少假陰性和假陽性結(jié)果率，提高了y染色體微卻缺診斷的準(zhǔn)確性。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種檢測y染色體azfa和azfb微缺失的多重pcr引物組，該多重pcr引物組包括通用引物和特異性引物，

所述通用引物具有如seqidno：1和seqidno：2所示的堿基序列：

正向dye-universalp-forward(fam-up-f)：5’-ggtgaccaagttcatgctct-3’(seqidno：1)

反向universalp-reverse(up-r)：5’-ggtccaggtcacgagatctt-3’(seqidno：2)

其中，seqidno：1所示堿基序列的5’端標(biāo)記有熒光基團(tuán)dye；

所述特異性引物包括具有如seqidno：3～seqidno：28所示堿基序列的引物。具體如表1所示。

所述引物組包括了4個(gè)azfa和azfb區(qū)常規(guī)篩查位點(diǎn)和8個(gè)拓展分析位點(diǎn)(azfa：sy82、sy83、sy84、sy86、sy1065、sy88；azfb：sy105、sy121、sy127、sy134、sy1192、sy153)的特異性引物序列和一對通用引物序列。

通用引物中正向引物的5’端標(biāo)記有熒光基團(tuán)，所述熒光基團(tuán)為fam、hex、vic、tet、joe、rox、texas-red、cy3、cy5或cy5.5。

根據(jù)本發(fā)明，多重pcr引物組中，seqidno：1～seqidno：28的摩爾比優(yōu)選為(2-20)：(2-20)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)。上述優(yōu)選比例的各個(gè)引物，能夠獲得更好的檢測效果。

根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供一種檢測y染色體azfa和azfb微缺失的試劑盒，該試劑盒包括：

如上所述的多重pcr引物組；

多重pcr反應(yīng)試劑。

其中，所述多重pcr反應(yīng)試劑包括但不限于：mgcl2、甜菜堿、熱啟動taq酶、dntps和pcr反應(yīng)緩沖液。

上述pcr反應(yīng)試劑，可根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)方式進(jìn)行自行配制或通過普通市售獲得。

根據(jù)本發(fā)明，試劑盒中，所述mgcl2的濃度為50-200mmol/l；所述甜菜堿的濃度為5-20mol/l；所述dntps的濃度為5-20mmol/l。

使用時(shí)，所述mgcl2的終濃度為1.0～5.0mmol/l；所述甜菜堿的終濃度為0.5～2.5mol/l；所述dntps的終濃度為50～1000μmol/l。

根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，該試劑盒包括：對照dna標(biāo)本。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述dna標(biāo)本為正常男性對照標(biāo)本、azfa區(qū)缺失對照標(biāo)本和azfb區(qū)缺失對照標(biāo)本中的至少一種。優(yōu)選地，包括上述全部對照dna標(biāo)本。

根據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明還提供上述的多重pcr引物組或上述的試劑盒作為檢測y染色體azfa和azfb微缺失試劑的應(yīng)用。

應(yīng)用本發(fā)明的多重pcr引物組或試劑盒可用于男性y染色體azfa和azfb微缺失通用引物-多重pcr檢測，檢測方法包括以下步驟：

1)從待測人外周血、口腔黏膜上皮細(xì)胞、干血片或者組織切片提取人基因組dna；

2)以步驟1)所得dna為模板，利用所述特異性擴(kuò)增引物組進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

3)多重pcr產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳分析。

本發(fā)明的12對引物分別特異性擴(kuò)增azfa和azfb亞區(qū)，1對內(nèi)對照引物擴(kuò)增男性特有基因。每條引物的正反向引物的5’端含有一段20bp的共同序列。設(shè)計(jì)的通用引物序列與這一段序列完全一致，并在正向通用引物5’端連接熒光基團(tuán)。本發(fā)明利用一管pcr反應(yīng)體系實(shí)現(xiàn)13對引物的特異性擴(kuò)增，同時(shí)利用帶熒光的通用引物對所有特異性擴(kuò)增的目的片段二次擴(kuò)增并帶上熒光，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度呈梯度分布，結(jié)果通過毛細(xì)管電泳分析，以達(dá)到簡單、快速、高通量和經(jīng)濟(jì)的目的。

與現(xiàn)有檢測試劑盒及方法相比，本發(fā)明具有以下突出優(yōu)點(diǎn)：

1)檢測體系里只需要一個(gè)單末端熒光標(biāo)記的引物，不需要多個(gè)taqman等熒光探針，大大降低了成本。

2)單管pcr即可完成所有位點(diǎn)的檢測，節(jié)省了成本又簡化了操作，既適用于小樣本的檢測，也適用于大樣本的通量檢測。

3)涵蓋了azfa和azfb亞區(qū)的12個(gè)缺失熱點(diǎn)的檢測，同時(shí)引入sry基因作為內(nèi)對照保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4)通過優(yōu)化的引物設(shè)計(jì)及反應(yīng)條件，本檢測具有穩(wěn)定的、高效的pcr反應(yīng)體系。不僅可以應(yīng)用于外周血樣本，同樣適用于極其微量的樣品，如口腔黏膜脫落細(xì)胞、干血片、組織切片等。

本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后具體實(shí)施方式部分予以詳細(xì)說明。

附圖說明

通過結(jié)合附圖對本發(fā)明示例性實(shí)施方式進(jìn)行更詳細(xì)的描述。

圖1示出了azfa和azfb亞區(qū)微缺失拓展分析的13個(gè)檢測位點(diǎn)(12個(gè)sts位點(diǎn)+1個(gè)對照位點(diǎn))在y染色體分布的模式圖。

圖2的a行示出了正常男性經(jīng)多重pcr在13個(gè)檢測位點(diǎn)的擴(kuò)增峰；b行示出了azfa區(qū)完全缺失樣本經(jīng)多重pcr在10個(gè)檢測位點(diǎn)的擴(kuò)增峰；c行示出了azfb區(qū)完全缺失樣本經(jīng)多重pcr在10個(gè)檢測位點(diǎn)的擴(kuò)增峰；d行和e行分別示出了azfb區(qū)不完全缺失樣本經(jīng)多重pcr在10個(gè)檢測位點(diǎn)的擴(kuò)增峰。

具體實(shí)施方式

下面將參照附圖更詳細(xì)地描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。

實(shí)施例1外周血樣本檢測azf區(qū)微缺失

1、材料：

1例正常已育男性樣本、4例已經(jīng)確診的azf微缺失型少精或無精癥男性患者樣本：1例azfa區(qū)完全缺失[sy82(+)、sy83(-)、sy84(-)、sy86(-)、sy1065(-)、sy88(+)]，1例azfb區(qū)完全缺失[sy105(+)、sy121(-)、sy127(-)、sy134(-)、sy1192(-)、sy153(+)]，2例azfb區(qū)部分缺失：[sy105(+)、sy121(-)、sy127(-)、sy134(-)、sy1192(+)、sy153(+)]和[sy105(+)、sy121(+)、sy127(-)、sy134(-)、sy1192(+)、sy153(+)]。所有樣本均已通過eaa/emqn(2013版)的y染色體微缺失檢測指南推薦的多重pcr-凝膠電泳方法驗(yàn)證。

2、基因組dna的提取

使用omega公司“基因組dna抽提試劑盒”從edta抗凝全血中提取人基因組dna。

3、多重pcr擴(kuò)增與檢測

所有引物在公司合成，其中通用引物的正向引物5’端選用fam修飾，其余引物無需特殊修飾，所有引物經(jīng)高效液相色譜(hplc)純化。。

多重引物組合：每對正、反向引物按照1：1混合，終濃度10μmol/l，然后將各組引物sy82：sy83：sy84：sy86：sy1065：sy88：sy105：sy121：sy127：sy134：sy1192：sy153：sry：fam-up-f：up-r按照1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：4：4的比例配置成多重pcr引物組合存儲液。

pcr實(shí)驗(yàn)選擇kapabiosystems公司的kapa2gmultiplexpcr試劑盒(kk5802)。為了簡少人為誤差，簡化操作流程，本實(shí)施例中首先將pcr擴(kuò)增試劑配置成mix(包括buffer、dntps、h2o、引物組、hotstartdnapolymerase)，分裝至每個(gè)反應(yīng)管；最后加入不同樣本dna(各反應(yīng)組分如表2所示)。

表2.多重pcr反應(yīng)體系

pcr反應(yīng)在abipcr儀器上進(jìn)行，按以下條件進(jìn)行擴(kuò)增檢測：

第一階段：95℃3min；

第二階段：95℃15sec，62℃30sec，72℃45sec，10個(gè)循環(huán)；

第三階段：95℃15sec，58℃30sec，72℃45sec，15個(gè)循環(huán)。

第四階段：72℃15min。

4、毛細(xì)管電泳分析

多重pcr產(chǎn)物采用abiappliedbiosytems公司的3130xl分析儀。取1μl多重pcr產(chǎn)物與8.5μl甲酰胺、0.5ul分子量內(nèi)標(biāo)liz500size混合，95℃加熱3min，-20℃快速降溫并放置3min，上機(jī)檢測，結(jié)果經(jīng)gene-mapper軟件分析。檢測位點(diǎn)與相應(yīng)的電泳坐標(biāo)位置如下：sry(510±1)、sy82(304±1)、sy322(371±1)、sy84(366±1)、sy86(358±1)、sy1065(379±1)、sy88(165±1)、sy105(332±1)、sy121(230±1)、sy127(314±1)、sy134(342±1)、sy1192(295±1)、sy153(177±1)。

陽性對照：以正常男性基因組dna作為模板的多重pcr，在上述13個(gè)坐標(biāo)位置均有明確的擴(kuò)增峰。

內(nèi)對照：以待測男性基因組dna作為模板的反應(yīng)管內(nèi)，sry(509±1)位置應(yīng)該有明確的擴(kuò)增峰。

結(jié)果分析

(1)毛細(xì)管電泳結(jié)果的橫坐標(biāo)顯示為擴(kuò)增片段的大小，縱坐標(biāo)顯示為擴(kuò)增片段的熒光強(qiáng)度，間接反應(yīng)片段擴(kuò)增的量。每一個(gè)單一擴(kuò)增峰代表一個(gè)擴(kuò)增片段，沒有擴(kuò)增峰則表示該片段沒有擴(kuò)增，該sts位點(diǎn)為缺失。

(2)陽性對照組在12個(gè)sts位點(diǎn)(sy82、sy83、sy84、sy86、sy1065、sy88、sy105、sy121、sy127、sy134、sy1192、sy153)和內(nèi)對照(sry)具有單一、清楚的擴(kuò)增峰(如圖2的a行示)。

(3)azfa區(qū)微缺失判定：sy84、sy86位置不存在擴(kuò)增峰，表明azfa亞區(qū)缺失；sy82和sy88位于azfa亞區(qū)兩端邊緣位置，存在擴(kuò)增峰；sy83和sy1065分別位于sy84、sy86的兩側(cè)位置，sy83和sy1065位置不存在擴(kuò)增峰，則可以判定為azfa亞區(qū)完全缺失(如圖2的b行示)；sy83和sy1065位置均存在或者其中之一存在擴(kuò)增峰，則可以判定為azfa亞區(qū)不完全缺失。

(4)azfb區(qū)微缺失判定：sy127、sy134位置不存在擴(kuò)增峰，表明azfb亞區(qū)缺失；sy105和sy153位于azfb亞區(qū)兩端邊緣位置，存在擴(kuò)增峰；sy121和sy1192分別位于sy84、sy86的兩側(cè)位置，sy121和sy1192位置不存在擴(kuò)增峰，則可以判定為azfb亞區(qū)完全缺失(如圖2的c行示)；sy121和sy1192位置均存在或者其中之一存在擴(kuò)增峰，則可以判定為azfb亞區(qū)不完全缺失(如圖2的d行和e行所示)。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明的多重pcr引物和試劑盒用于檢測y染色體微缺失的方法可靠、靈敏度高，成本低，并且可以實(shí)現(xiàn)大樣本量的高效檢測。

以上已經(jīng)描述了本發(fā)明的各實(shí)施例，上述說明是示例性的，并非窮盡性的，并且也不限于所披露的各實(shí)施例。在不偏離所說明的各實(shí)施例的范圍和精神的情況下，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說許多修改和變更都是顯而易見的。

sequencelisting

<110>鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院

<120>檢測y染色體azfa和azfb微缺失的多重pcr引物組、試劑盒和應(yīng)用

<130>1700052

<160>28

<170>patentinversion3.3

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<212>dna

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<400>3

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<211>42

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ggtccaggtcacgagatcttcggctggtgctccattcttgag42

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<212>dna

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<212>dna

<213>人工序列

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<213>人工序列

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ggtgaccaagttcatgctctagttcacagaatggagcctg40

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<212>dna

<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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