本發(fā)明涉及分子生物學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)、rna測序領(lǐng)域。更具體地，涉及一種去除rna樣本中非目標(biāo)rna的方法。

背景技術(shù)：

隨著后基因組時(shí)代的來臨，轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究作為一種強(qiáng)有力的工具，在現(xiàn)今的生命科學(xué)研究中占有日益重要的地位。它可以幫助人們深入了解基因結(jié)構(gòu)，揭示特定條件下的基因表達(dá)情況，以及生物體應(yīng)對(duì)外界環(huán)境變化的調(diào)控機(jī)制。而二代測序技術(shù)的蓬勃發(fā)展，特別是rna測序技術(shù)的進(jìn)步，也迅速推進(jìn)了轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的廣泛應(yīng)用。但是目前rna測序技術(shù)面臨的最大挑戰(zhàn)，便是目標(biāo)rna在總rna中的低豐度。以mrna為例，通常僅占總rna的1～5％，總rna中的大部分，則是核糖體rna(rrna)與轉(zhuǎn)運(yùn)rna(trna)，而這些往往是不為研究人員所需要的。如不將其去除，則會(huì)消耗巨量的測序資源。因此，學(xué)者們需要在研究時(shí)，從總rna樣品中去除非目標(biāo)rna，然后再進(jìn)行測序與下游的生物信息學(xué)分析工作。

近年來，科研工作者們已經(jīng)開發(fā)出多種方法以去除以rrna為代表的非目標(biāo)的rna。這些方法使用不同rna之間的方方面面區(qū)別設(shè)計(jì)去除手段，如大小、序列特點(diǎn)、5’磷酸基、二級(jí)結(jié)構(gòu)、豐度等，都可作為去除方法的依據(jù)；同時(shí)，也有若干商業(yè)化的試劑盒可用于去除非目標(biāo)rna。首先要說明的是，對(duì)于真核生物，因其mrna具有poly(a)尾的結(jié)構(gòu)，因此很容易用poly(t)加以富集純化進(jìn)而去除其它rna，或是直接用poly(t)引物進(jìn)行合成cdna；而原核生物的mrna并不具備這樣的結(jié)構(gòu)，因此去除原核生物總rna中非目標(biāo)rna，具有更高的技術(shù)難度。因此下文要詳述的rna去除方法，均是針對(duì)包括原核生物與真核生物在內(nèi)的，普遍適用的方法。

從技術(shù)角度對(duì)這些方法加以區(qū)分，可以分為三大類：rna去除步驟在cdna合成之前，rna去除與cdna合成同步進(jìn)行，rna去除步驟在cdna合成之后。如何在這些方法中加以抉擇，最重要的兩點(diǎn)便是去除效率，以及去除過程中對(duì)rna攜帶信息的偏好性選擇。最理想的方法，自然是在最大限度保留所需rna的同時(shí)，盡可能去除其余非目標(biāo)rna。然而，任何方法都有其優(yōu)點(diǎn)與局限，以及可能存在的偏好性，下面將對(duì)這些方法逐一加以介紹：

1、利用凝膠電泳選擇不同大小的rna

完整的rrna在凝膠電泳時(shí)呈現(xiàn)單一條帶，因此，可以在電泳后回收位于rrna條帶之間的非核糖體rna(mcgrathkc,thomas-hallsr,chengct,leol,alexaa,schmidts,etal.isolationandanalysisofmrnafromenvironmentalmicrobialcommunities.jmicrobiolmethods2008；75(2):172–6.)。盡管該回收方法確可獲得相對(duì)富集的mrna，但其缺點(diǎn)也顯而易見：斷裂的rrna、rrna前體因其與成熟rrna的大小不一致而未被去除；而與rrna大小相近的目的rna則被一并除掉了。此外，較大的初始rna樣品量、操作過程中易發(fā)生rnase污染，也都是該方法的局限。

2、變性高效液相色譜技術(shù)分離rna

rna的物理分離亦可通過色譜技術(shù)實(shí)現(xiàn)，rna大小、與基質(zhì)的結(jié)合強(qiáng)度、洗脫液的離子條件，是分離的重要依據(jù)。已有學(xué)者用此原理實(shí)現(xiàn)了對(duì)棒狀桿菌屬rna樣品中rrna與mrna的快速分離(castrotlp,seyffertn,ramosrtj,barbosas,carvalhor,pintoac,etal.iontorrent-basedtranscriptionalassessmentofacorynebacteriumpseudotuberculosisequistrainrevealsdenaturinghigh-performanceliquidchromatographyapromisingrrnadepletionmethod.microbialbiotechnol2013；6(2):168–77.)。但該方法同樣需要較大的初始rna樣品量，其廣泛適用性亦有待更多測試。

3、依賴5’磷酸基的核酸外切酶降解技術(shù)

epicentre公司已研發(fā)出利用特定酶解反應(yīng)降解rrna的試劑盒(mrna-onlyprokaryoticmrnaisolationkit)，該試劑盒利用的核酸外切酶可選擇性降解具有5’端單磷酸基的rna，而不會(huì)降解具有5’端三磷酸或羥基的rna。成熟rrna來自單一的前體rrna轉(zhuǎn)錄，均有5’端單磷酸，因而可被該酶選擇性降解；而mrna帶有5’端三磷酸帽子結(jié)構(gòu)，可抵御該酶的降解。該方法利用不同rna分子結(jié)構(gòu)的一般性特征加以區(qū)分，適用范圍較廣泛。然而，該方法的去除效率和保真性會(huì)明顯受到樣品中mrna部分降解的影響(hes,wurtzelo,singhk,froulajl,yilmazs,tringesg,etal.validationoftworibosomalrnaremovalmethodsformicrobialmetatranscriptomics.natmethods2010；7(10):807–12.)，特別是在細(xì)菌與古生菌中，mrna半壽期極短，往往轉(zhuǎn)錄起始數(shù)分鐘后便開始降解(rauhutr,klugg.mrnadegradationinbacteria.femsmicrobiolrev1999；23(3):353–70.)，因此如使用此試劑盒，這些部分降解后的、具有5’端單磷酸的mrna片段，則會(huì)被損失掉。

4、rnaseh，dnasei消化技術(shù)

另一種rrna酶解技術(shù)則是利用了rnaseh特異性降解dna:rna雜交分子中rna、而不降解rna單鏈的能力(hausenp,steinh,ribonucleaseh.anenzymedegradingthernamoietyofdna-rnahybrids.eurjbiochem/febs1970；14(2):278–83)。該方法中，總rna首先使用一系列針對(duì)rrna的特異性引物混合物進(jìn)行雜交或反轉(zhuǎn)錄，然后加入rnaseh以降解dna：rna雜交雙鏈中的rrna，繼而再加入dnasei以降解殘留的dna。johnmorlan利用此原理設(shè)計(jì)是針對(duì)人/大鼠/小鼠的5s、18s、28srrna的短的反義dna探針(50-80bp)。將這些探針與人體rna雜交后用rnaseh和dnasei處理，該方法可去除98％的rrna(johnd.morlan,kunbinqu,dominickv.sinicropi.selectivedepletionofrrnaenablewholetranscriptomeprofilingofarchivalfixedtissue.plosone,2012vol7,e42882)。

上述基于rnaseh，dnasei消化技術(shù)的缺點(diǎn)是十分顯著的：第一，由于利用的引物是針對(duì)目標(biāo)rna設(shè)計(jì)的，要達(dá)到這些引物不與非目標(biāo)rna雜交的可能性是極低的，所以極有可能在最終的目標(biāo)rna中存在部分非目標(biāo)rna；第二，目標(biāo)rna是在經(jīng)過rnaseh，dnase等一系列處理后得到的，而rna是極易被污染、被降解，目標(biāo)rna去除步驟越多，其被降解的可能性越大。

5、利用特異性探針的消減雜交技術(shù)

消減雜交利用rrna的反義序列作為特異性探針，因而rrna與結(jié)合在微球或磁珠上的探針雜交后，雜交分子可以從溶液中去除(pangx,zhouds,songyj,peid,wangj,guoz,etal.bacterialmrnapurificationbymagneticcapture-hybridizationmethod.microbiolimmunol2004；48(2):91–6.)。該方法是目前使用最為廣泛的技術(shù)，或許是由于多種商業(yè)化試劑盒均使用本技術(shù)的緣故。如ambion公司的microbexpresskit，使用兩部連續(xù)雜交將rrna捕獲于磁珠上。但該試劑盒使用上有明確的物種局限，所有古生菌樣本均不適用；且受限于所用探針種類與數(shù)量，該試劑盒對(duì)rna樣品的完整性要求很高——降解的rrna往往會(huì)丟失雜交位點(diǎn)而無法被有效去除。另有較為晚近的epicentre公司研發(fā)的ribo-zerokit，使用的則是偶聯(lián)生物素的特異探針，因而rrna與之雜交后可用相應(yīng)的鏈霉親和素包被的親和層析磁珠去除(sooknananr,peasej,doylek.novelmethodsforrrnaremovalanddirectional,ligation-freerna-seqlibrarypreparation.natmethodsapplnotes2010；7(10).)。與microbexpresskit相比，該試劑盒可提供更為寬廣的rrna去除范圍，這或與其使用了較多的專利性探針有關(guān)。然而，該方法要求較高的初始rna樣品量，否則去除效率便會(huì)顯著受限。

無論使用以上何種試劑盒，均會(huì)受到探針選擇的限制。因而亦有針對(duì)樣品進(jìn)行特異性去除的探針設(shè)計(jì)方法，實(shí)際上，該方法甚至早于商業(yè)化試劑盒而發(fā)明。近期，有學(xué)者開發(fā)了物種特異性的rrna消除系統(tǒng)(lis-k,zhouj-w,yimak-y,leungaky,tsuiskw,chantf,etal.organism-specificrrnacapturesystemforapplicationinnext-generationsequencing.plosone2013；8(9):e74286.)，該方法適用于單一物種或簡單群落；對(duì)于復(fù)雜群落，也有學(xué)者開發(fā)了相應(yīng)的rrna去除方案(stewartfj,ottesenea,delongef.developmentandquantitativeanalysesofauniversalrrna-subtractionprotocolformicrobialmetatranscriptomics.ismej2010；4(7):896–907.)。盡管這些方法都在一定范圍內(nèi)獲得了較成功的結(jié)果，但仍未得到廣泛推廣，主要是因其與商業(yè)化試劑盒相比，程序耗時(shí)較長，需要更加熟練的設(shè)計(jì)與優(yōu)化技巧。

6、基于mrna相對(duì)rrna的3’端聚腺苷酸化偏好之去除方法

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)使用酵母來源的poly(a)聚合酶，可對(duì)大腸桿菌的mrna而非rrna進(jìn)行選擇性聚腺苷酸化，進(jìn)而推測rrna與核糖體蛋白結(jié)合時(shí)，3’端聚腺苷酸化受到空間位阻(amararr,vijayas.specificpolyadenylationandpurificationoftotalmessengerrnafromescherichiacoli.nucleicacidsres1997；25(17):3465–70.)?；诖爽F(xiàn)象，有學(xué)者以此方法結(jié)合oligo(dt)親和層析純化技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)mrna的富集(wendischvf,zimmerdp,khodurskya,peterb,cozzarellin,kustus.isolationofescherichiacolimrnaandcomparisonofexpressionusingmrnaandtotalrnaondnamicroarrays.analbiochem2001；290(2):205–13.)。另有學(xué)者用此方法對(duì)mrna添加poly(a)后，使用oligo(dt)引物特異性合成cdna(frias-lopezj,shiy,tysongw,colemanml,schustersc,chisholmsw,etal.microbialcommunitygeneexpressioninoceansurfacewaters.procnatlacadsciusa2008；105(10):3805–10.)，據(jù)作者介紹，此方法對(duì)mrna的富集作用不僅源于聚腺苷酸化的偏好性，也可能與rrna的二級(jí)結(jié)構(gòu)阻礙合成有關(guān)。但同時(shí)也有學(xué)者指出了使用該方法時(shí)，oligo(dt)引物與隨機(jī)引物相比，對(duì)于5’端、特別是長轉(zhuǎn)錄子的局限性(wilhelmbt,landryjr.rna-seq-quantitativemeasurementofexpressionthroughmassivelyparallelrna-sequencing.methods2009；48(3):249–57.)。

7、cdna合成時(shí)的選擇性引物結(jié)合

以上方法均為在cdna合成之前去除非目標(biāo)rna，而在合成時(shí)使用隨機(jī)引物實(shí)現(xiàn)無偏好性的轉(zhuǎn)錄組覆蓋。實(shí)際上，在完全隨機(jī)的引物中選擇一部分序列不完全隨機(jī)的子集以區(qū)別對(duì)待不同的rna分子，則可實(shí)現(xiàn)對(duì)特定rna的選擇性合成cdna(gonzalezjm,robbft.counterselectionofprokaryoticribosomalrnaduringreversetranscriptionusingnon-randomhexamericoligonucleotides.jmicrobiolmethods2007；71(3):288–91.)。本方法易于在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)操作，且無須較高的初始rna樣品量。為了獲得高特異性的選擇引物，基于計(jì)算機(jī)的設(shè)計(jì)必不可少，已有學(xué)者在此方面做出了探索性的工作(armourcd,castlejc,chenr,babakt,loerchp,jacksons,etal.digitaltranscriptomeprofilingusingselectivehexamerprimingforcdnasynthesis.natmethods2009；6(9):647–9.)。另外nugen公司也研發(fā)了針對(duì)不同種屬的選擇性引物的試劑盒(ovationprokaryoticrna-seqsystem)，然而其實(shí)戰(zhàn)表現(xiàn)并未盡如人意，針對(duì)不同物種有極大的差異；與前文介紹的基于其它原理研發(fā)的若干種試劑盒相比，其特異性僅位于下游。

8、cdna文庫標(biāo)準(zhǔn)化

rrna還可以在cdna合成后被去除(komsh.an“equalizedcdnalibrary”bythereassociationofshortdouble-strandedcdnas.nucleicacidsres1990；18(19):5705–11.)，該方法首先高溫變性雙鏈cdna后再低溫重退火，因?yàn)閏dna重新退火速率與其濃度平方成比例，因而源自高濃度rna(如rrna、trna)轉(zhuǎn)錄的cdna會(huì)先于源自低濃度rna(如mrna)所轉(zhuǎn)錄cdna而退火，即更早形成雙鏈。因此控制合適的時(shí)間點(diǎn)終止退火，即可使不同來源的rna形成的cdna分別主要處于單鏈或雙鏈的不同狀態(tài)；此時(shí)再用雙鏈特異性核酸酶(dsn)進(jìn)行消化或通過色譜手段物理分離，即可去除非目標(biāo)rna。因該方法在cdna文庫構(gòu)建之后加以操作，所需起始rna樣品量可降至微克級(jí)以下。但該方法亦有顯著局限，受濃度、gc含量、mrna豐度的影響明顯，且針對(duì)群落rna樣品，其中不同物種的rna本身濃度差異也是嚴(yán)重影響因素之一，使得不同rna無法被有效分離。

上文介紹的各種方法，都各自有其局限性，因此有學(xué)者嘗試組合不同的方法以提高去除效率(poretskyrs,hewsoni,suns,allenae,zehrjp,moranma.comparativeday/nightmetatranscriptomicanalysisofmicrobialcommunitiesinthenorthpacificsubtropicalgyre.environmicrobiol2009；11(6):1358–75.peanoc,pietrellia,consolandic,rossie,petitil,tagliabuel,etal.anefficientrrnaremovalmethodforrnasequencingingc-richbacteria.microbialinformexperiment2013；3(1):1.)。但這些方法可能在某些情況下，能夠提升去除效率的同時(shí)卻產(chǎn)生更高的偏好性；且增加的處理、純化等步驟會(huì)帶來更多的材料損失與污染概率。因此選擇多種方法的組合時(shí)，仍需慎重。

綜上，從總rna樣品中富集所需rna、去除非目標(biāo)rna，是轉(zhuǎn)錄組學(xué)與rna測序研究中至關(guān)重要的步驟?，F(xiàn)有的各種去除方法均有其局限，表現(xiàn)在對(duì)樣品的要求、去除效率、偏好性等方面。針對(duì)這些方法的評(píng)估測試，以及新方法的開發(fā)，也是目前備受關(guān)注的研究內(nèi)容。就現(xiàn)有方法來看，沒有一種技術(shù)可以完全除凈非目標(biāo)rna，而這些未除凈的rna在后續(xù)的文庫構(gòu)建、擴(kuò)增過程中，是能夠被擴(kuò)增的，進(jìn)而產(chǎn)生無用的信息，影響后續(xù)分析工作。因此，急需一種技術(shù)，可將非目標(biāo)rna在文庫構(gòu)建完成之前全部去除，而無需擔(dān)心其殘留對(duì)下游工作的影響。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種去除rna樣本中非目標(biāo)rna的方法，該方法可徹底去除的非目標(biāo)rna，避免其對(duì)下游試驗(yàn)的影響。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種去除rna樣本中非目標(biāo)rna的方法，包括以下步驟：(1)反轉(zhuǎn)錄引物對(duì)rna樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，去除rna模板，得到非目標(biāo)第一鏈cdna和目標(biāo)第一鏈cdna；(2)非目標(biāo)第一鏈cdna與特異性探針雜交，得到非目標(biāo)第一鏈cdna-探針復(fù)合物；(3)雙鏈特異性核酸酶消化非目標(biāo)第一鏈cdna-探針復(fù)合物，得到目標(biāo)第一鏈cdna。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，將步驟(2)中得到的非目標(biāo)第一鏈cdna-探針復(fù)合物進(jìn)一步延伸，獲得能完全被雙鏈特異性核酸酶(dsn酶)消化的足夠長度的完全互補(bǔ)的非目標(biāo)第一鏈cdna-探針復(fù)合物，再利用雙鏈特異性核酸酶消化(見圖1)。

進(jìn)一步，本發(fā)明中合成第一鏈cdna時(shí)使用的反轉(zhuǎn)錄引物為5’端帶有或不帶有第一接頭序列的隨機(jī)引物，所述隨機(jī)引物可與rna樣本中任意rna組分結(jié)合啟動(dòng)反轉(zhuǎn)錄。

本發(fā)明中當(dāng)使用5’端帶有第一接頭序列的隨機(jī)引物時(shí)，可在合成的第一鏈cdna的5’端引入第一接頭，用rnaseh去除rna模板后，用rna連接酶在第一鏈cdna3’端加上第二接頭，具體包括以下步驟：(1)5’端帶有第一接頭的隨機(jī)引物對(duì)rna樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，去除rna模板，在第一鏈cdna的3’端加第二接頭，得到兩端帶有接頭序列的非目標(biāo)和目標(biāo)第一鏈cdna；(2)兩端帶有接頭序列的非目標(biāo)第一鏈cdna與特異性探針雜交，得到兩端帶有接頭序列的非目標(biāo)第一鏈cdna-探針復(fù)合物；(3)雙鏈特異性核酸酶消化非目標(biāo)第一鏈cdna-探針復(fù)合物，得到兩端帶有接頭序列的目標(biāo)第一鏈cdna。

進(jìn)一步，也可以先用rna連接酶在第一鏈cdna3’端加上第二接頭后，再用rnaseh去除rna模板，具體包括以下步驟：(1)5’端帶有第一接頭的隨機(jī)引物對(duì)rna樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，在第一鏈cdna的3’端加第二接頭，去除rna模板，得到兩端帶有接頭序列的非目標(biāo)和目標(biāo)第一鏈cdna；(2)兩端帶有接頭序列的非目標(biāo)第一鏈cdna與特異性探針雜交，得到兩端帶有接頭序列的非目標(biāo)第一鏈cdna-探針復(fù)合物；(3)雙鏈特異性核酸酶消化非目標(biāo)第一鏈cdna-探針復(fù)合物，得到兩端帶有接頭序列的目標(biāo)第一鏈cdna。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，將步驟(2)中得到的兩端帶有接頭序列的非目標(biāo)第一鏈cdna-探針復(fù)合物進(jìn)一步延伸，獲得能完全被雙鏈特異性核酸酶(dsn酶)消化的足夠長度的完全互補(bǔ)的兩端帶有接頭序列的非目標(biāo)第一鏈cdna-探針復(fù)合物，再利用雙鏈特異性核酸酶消化。

本發(fā)明上述通過使用5’端帶有第一接頭序列的隨機(jī)引物得到兩端帶有接頭序列的目標(biāo)第一鏈cdna序列，無需pcr，直接將兩端帶接頭的cdna用作rna二代測序的文庫。也可使用pcr方法合成第二鏈cdna，此時(shí)所用pcr引物與第一鏈cdna兩端的第一、第二接頭互補(bǔ)。還可在pcr引物5’端帶有其它序列，以便在pcr擴(kuò)增之后在cdna兩端加上所需的序列，滿足下游實(shí)驗(yàn)需求，如用于rna測序的文庫構(gòu)建(見圖2)。

本發(fā)明中所述cdna兩端的接頭序列可以相同也可以不同，具體根據(jù)下游試驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行選擇。

進(jìn)一步，本發(fā)明中降解非目標(biāo)第一鏈cdna后，也可用pcr方法擴(kuò)增剩余的目標(biāo)第一鏈cdna，進(jìn)行下游試驗(yàn)，pcr引物可以是根據(jù)下游試驗(yàn)需求設(shè)計(jì)的待擴(kuò)增基因的特異引物。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述特異性探針是根據(jù)非目標(biāo)rna序列設(shè)計(jì)的特異性探針，可以通過化學(xué)合成或其它分子生物學(xué)方法獲得。特異性探針既可以是與非目標(biāo)rna反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cdna序列100％互補(bǔ)的，也可以是部分互補(bǔ)的簡并堿基，只要這些堿基能夠作為雙鏈cdna合成的引物就能夠滿足要求。具體的，本發(fā)明中特異性探針與非目標(biāo)rna反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cdna序列互補(bǔ)堿基的比例由dsn酶決定，不同dsn酶要求的長度不一樣，只要能與非目標(biāo)rna反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cdna序列雜交的特異性探針均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

進(jìn)一步，本發(fā)明中所述rna樣本可以是任意rna樣本，包括但不限于直接提取后的rna、片段化打斷處理之后的rna、使用現(xiàn)有技術(shù)富集的mrna、使用現(xiàn)有技術(shù)去除rrna之后的rna，等等。

其中，所述非目標(biāo)rna可以是rna樣本中的任意rna組分，包括但不限于rrna、trna、mrna，等等；優(yōu)選的，非目標(biāo)rna為rrna；所述目標(biāo)rna可以是rna樣本中的任意rna組分，包括但不限于編碼rna、非編碼rna，等等。

進(jìn)一步，本發(fā)明所述非目標(biāo)第一鏈cdna是通過非目標(biāo)rna反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cdna；所述目標(biāo)第一鏈cdna是通過目標(biāo)rna反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cdna。

進(jìn)一步，本發(fā)明所述的雙鏈特異性核酸酶，可以是任何能夠特異性降解雙鏈dna，而不會(huì)降解單鏈dna的核酸酶。

傳統(tǒng)任何一種rna去除方法，無論步驟是在cdna合成之前、之中還是之后，都有自身的局限性，無法實(shí)現(xiàn)對(duì)非目標(biāo)rna的100％去除，且在去除過程中存在不同程度的偏愛性。且這些方法多針對(duì)rrna、trna而設(shè)計(jì)，對(duì)于某些情況下需要去除其它rna則無能為力。商品化rrna去除試劑盒，往往只針對(duì)特定物種的部分樣品，對(duì)樣本量也有較高要求，且未除凈的rna或其降解產(chǎn)物依然會(huì)對(duì)下游實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生影響，可以被擴(kuò)增放大，污染后續(xù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。本發(fā)明是一種利用特異性探針與非目標(biāo)rna合成的第一鏈cdna相結(jié)合形成非目標(biāo)第一鏈cdna-探針復(fù)合物，并用雙鏈特異性核酸酶酶解該復(fù)合物，使得非目標(biāo)第一鏈cdna無法被作為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，從而從總rna樣本中去除這部分非目標(biāo)rna對(duì)下游實(shí)驗(yàn)所產(chǎn)生影響的技術(shù)。通過生物信息學(xué)手段合理設(shè)計(jì)探針的序列、長度與數(shù)量，在了解待處理rna樣本信息的前提下，可以針對(duì)任意rna樣本，從中有選擇地去除任何非目標(biāo)rna，保留所需研究的rna。

本發(fā)明的有益效果如下：

本發(fā)明利用特異性探針與非目標(biāo)rna合成的第一鏈cdna相結(jié)合，形成局部的雙鏈dna區(qū)域；再用雙鏈特異性核酸酶(dsn)對(duì)cdna進(jìn)行直接消化或延伸后再消化，使這些cdna斷裂，無法作為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，從而徹底去除非目標(biāo)rna對(duì)下游實(shí)驗(yàn)所產(chǎn)生的影響。與傳統(tǒng)方法相比，本發(fā)明無需完全降解非目標(biāo)rna或其產(chǎn)生的第一鏈cdna，只要使cdna發(fā)生斷裂，則其無法作為模板被擴(kuò)增，因此可以實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)超任何現(xiàn)有方法的特異性去除效率，并且去除能力更加強(qiáng)大，對(duì)所需序列的保真性更高，且不受物種或樣品的制約，可針對(duì)任何rna樣品中的任何組分加以特異性去除或保留。

本發(fā)明方法還可在第一鏈cdna合成時(shí)，在第一鏈cdna兩端引入接頭序列，可直接在cdna的末端靈活添加任何所需序列，或是利用pcr方法合成第二鏈cdna時(shí)在cdna的末端靈活添加任何所需序列，便于實(shí)現(xiàn)不同的下游實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，如用于rna二代測序的文庫構(gòu)建等。

本發(fā)明方法操作簡便、靈活、成本低廉，對(duì)轉(zhuǎn)錄組學(xué)、rna測序領(lǐng)域研究具有重大而深遠(yuǎn)的意義。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。

圖1示出本發(fā)明的原理示意圖。

圖2示出利用本發(fā)明構(gòu)建rna二代測序文庫示意圖。

圖3示出實(shí)施例1中不同處理后rna的qpcr驗(yàn)證結(jié)果。

圖4示出實(shí)施例2中不同處理后rna的qpcr驗(yàn)證結(jié)果。

具體實(shí)施方式

為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。附圖中相似的部件以相同的附圖標(biāo)記進(jìn)行表示。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說明性的而非限制性的，不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例中所用的材料及來源：

rnakit、first-strandcdnasynthesissupermix、tipgreenqpcrsupermix、dnapolymerase，北京全式金生物技術(shù)有限公司。

rnaseh、t4rnaligasei，neb公司。

dsdnase，thermofisherscientific公司。

引物合成，lifetechnologies公司。

實(shí)施例1驗(yàn)證本發(fā)明可有效去除總rna中的18srrna并保留所需的mrna

1.制備人總rna

以hela細(xì)胞為材料，用rnakit提取人總rna。

2.合成引物、探針

根據(jù)人18srrna、gapdh基因序列，設(shè)計(jì)如下引物、探針：

18srrnaf：

5’-ggccctgtaattggaatgagtc-3’(見序列表seqidno.1)

18srrnar：

5’-ccaagatccaactacgagctt-3’(見序列表seqidno.2)

gapdhf：

5’-tcctgcaccaccaactgctta-3’(見序列表seqidno.3)

gapdhr：

5’-aggggccatccacagtcttct-3’(見序列表seqidno.4)

以上4條引物均用ddh2o溶解至10μm。

18srrnaprobe1：

5’-taatgatccttccgcaggttcacctacggaaaccttgttacgacttttac-3’(見序列表seqidno.5)

18srrnaprobe2：

5’-ttcctctagatagtcaagttcgaccgtcttctcagcgctccgccagggcc-3’(見序列表seqidno.6)

18srrnaprobe3：

5’-gtgggccgaccccggcggggccgatccgagggcctcactaaaccatccaa-3’(見序列表seqidno.7)

18srrnaprobe4：

5’-tcggtagtagcgacgggcggtgtgtacaaagggcagggacttaatcaacg-3’(見序列表seqidno.8)

18srrnaprobe5：

5’-caagcttatgacccgcacttactcgggaattccctcgttcatggggaata-3’(見序列表seqidno.9)

18srrnaprobe6：

5’-attgcaatccccgatccccatcacgaatggggttcaacgggttacccgcg-3’(見序列表seqidno.10)

以上6條探針均用ddh2o溶解至1μg/μl，然后配制探針組合1/2/3：

探針組合1：即18srrnaprobe1

探針組合2：將18srrnaprobe2、18srrnaprobe3等比例混合

探針組合3：將18srrnaprobe4、18srrnaprobe5、18srrnaprobe6等比例混合。

adapter1-randomprimer：

5’-gtctcgtgggctcggnnnnnn-3’(見序列表seqidno.11)

這條引物用ddh2o溶解至0.1μg/μl。

3.合成第一鏈cdna

用adapter1-randomprimer，使用first-strandcdnasynthesissupermix反轉(zhuǎn)錄步驟1中提取的總rna。反應(yīng)體系如下：

反應(yīng)條件為：25℃孵育10分鐘，42℃孵育30分鐘，85℃加熱5秒鐘失活rt/ri。

4.消化rna模板

用rnaseh消化與第一鏈cdna結(jié)合的rna模板。反應(yīng)體系如下：

反應(yīng)條件為：37℃孵育30分鐘，65℃孵育20分鐘失活e.colirnaseh。

5.探針雜交

配制3個(gè)探針雜交體系與一個(gè)對(duì)照反應(yīng)體系(用ddh2o代替探針)：

反應(yīng)條件為：

95℃變性2分鐘

95℃→22℃雜交0.1℃/秒，約12分鐘

22℃孵育5分鐘。

6.雙鏈特異性核酸酶消化

對(duì)上一步驟中的4個(gè)雜交反應(yīng)體系均用dsdnase消化，反應(yīng)體系如下：

雜交反應(yīng)體系8μl

10×dsdnasebuffer1μl

dsdnase1μl

反應(yīng)條件為：

37℃孵育2分鐘，然后向體系中加入0.1μl的1mdtt，55℃孵育5分鐘以失活dsdnase。

7.qpcr檢測18srrna去除效率

以上一步驟中的4個(gè)消化反應(yīng)體系為模板，并以步驟4得到的等量第一鏈cdna為對(duì)照模板，用18srrnaf/r、gapdhf/r兩對(duì)引物擴(kuò)增，設(shè)置qpcr反應(yīng)體系如下：

qpcr反應(yīng)條件為：

溶解曲線階段

qpcr全ct值數(shù)據(jù)詳見下方表1，步驟5～6中不同方法處理的模板與未處理模板ct值之差如圖3所示。從表1與圖3中可以看出：

用3種探針組合雜交并用dsdnase消化后的cdna擴(kuò)增18srrna基因時(shí)，相對(duì)未做任何處理的cdna模板，其ct值均滯后10個(gè)循環(huán)以上，即超過99.9％的18srrna未被擴(kuò)增；而擴(kuò)增gapdh基因時(shí)，相對(duì)未做處理的cdna模板，ct值變化均極微小。同時(shí)，用水代替探針與cdna模板雜交并消化后，無論是18srrna還是gapdh基因，其ct值相對(duì)未做處理的cdna模板而言變化均極微小。因此，證明了本發(fā)明有效地對(duì)總rna中非目標(biāo)18srrna進(jìn)行了成功去除。

另外，3種不同的探針組合去除效果相當(dāng)，結(jié)果均十分理想，說明設(shè)計(jì)雜交探針時(shí)，探針的序列、長度與數(shù)量十分靈活，只要能夠與非目標(biāo)第一鏈cdna結(jié)合使之隨后發(fā)生酶解斷裂，即可成功實(shí)現(xiàn)去除目的。

表1實(shí)施例1中qpcr全ct值

實(shí)施例2驗(yàn)證雜交后形成的完全匹配雙鏈dna區(qū)域的有效長度對(duì)dsn降解效率的影響。

1.制備人總rna

以hela細(xì)胞為材料，用rnakit提取人總rna。

2.合成引物、探針

設(shè)計(jì)如下引物、探針：

18srrnaprobe7：

5’-ggttcacc-3’(見序列表seqidno.12)

18srrnaprobe8：

5’-ggttcgtctacg-3’(見序列表seqidno.13)

18srrnaprobe9：

5’-ggttcacctacg-3’(見序列表seqidno.14)

以上3條探針均用ddh2o溶解至1μg/μl。這3條探針的區(qū)別與聯(lián)系如下：

探針7：長度8nt，與18srrna完全互補(bǔ)。

探針8：長度12nt，與18srrna不完全互補(bǔ)，有兩個(gè)堿基的錯(cuò)配。

探針9：長度12nt，與18srrna完全互補(bǔ)。

3.合成第一鏈cdna

同實(shí)施例1中步驟3。

4.消化rna模板

同實(shí)施例1中步驟4。

5.探針雜交

配制3個(gè)探針雜交體系與一個(gè)對(duì)照反應(yīng)體系(用ddh2o代替探針)：

反應(yīng)條件為：

95℃變性2分鐘

95℃→22℃雜交0.1℃/秒，約12分鐘

22℃孵育5分鐘。

6.探針延伸

將步驟5中獲得的4個(gè)雜交反應(yīng)體系均一分為二，一半直接用于后續(xù)步驟7的消化反應(yīng)，另一半按照如下反應(yīng)體系進(jìn)行探針延伸：

雜交反應(yīng)體系5μl

dnapolymerase0.1μl

反應(yīng)條件為：

72℃孵育1分鐘。

7.雙鏈特異性核酸酶消化

對(duì)步驟5中獲得的4個(gè)雜交反應(yīng)體系與步驟6中獲得的4個(gè)對(duì)應(yīng)的延伸反應(yīng)體系均用dsdnase消化，反應(yīng)體系如下：

反應(yīng)條件為：

37℃孵育2分鐘，然后向體系中加入0.1μl的1mdtt，55℃孵育5分鐘以失活dsdnase。

8.qpcr檢測18srrna去除效率

以上一步驟中的8個(gè)消化反應(yīng)體系為模板，并以步驟4得到的等量第一鏈cdna為對(duì)照模板，用18srrnaf/r、gapdhf/r兩對(duì)引物擴(kuò)增，設(shè)置qpcr反應(yīng)體系如下：

qpcr反應(yīng)條件為：

溶解曲線階段

qpcr全ct值數(shù)據(jù)詳見下方表2、表3，步驟5～7中不同方法處理的模板與未處理模板ct值之差如圖4所示。從表2、表3與圖4中我們可以看出：

雜交產(chǎn)物直接用dsdnase消化時(shí)，對(duì)于18srrna基因的擴(kuò)增，探針7、探針8雜交產(chǎn)物相對(duì)未做任何處理的cdna模板，其ct值變化不大，僅與陰性對(duì)照相當(dāng)或稍滯后；而探針9雜交產(chǎn)物的ct值有明顯滯后，即絕大部分18srrna未被擴(kuò)增。而對(duì)于gapdh基因的擴(kuò)增，無論不同的探針雜交還是陰性對(duì)照，ct值相對(duì)未做處理的cdna模板而言均無明顯變化。

如對(duì)雜交產(chǎn)物先進(jìn)行延伸再消化，則對(duì)于18srrna基因的擴(kuò)增，3種探針的雜交，延伸產(chǎn)物相對(duì)未做任何處理的cdna模板，其ct值均滯后10個(gè)循環(huán)以上，即超過99.9％的18srrna未被擴(kuò)增。而對(duì)于gapdh基因的擴(kuò)增，相對(duì)未做處理的cdna模板，ct值變化均極微小。

因此，以上結(jié)論證明了，雙鏈特異性核酸酶的有效消化，需要足夠長度的完全互補(bǔ)的雙鏈dna區(qū)域。本實(shí)施例中的探針7，其長度太短；探針8，雖然比探針7長，但與cdna序列不完全互補(bǔ)，因此雜交后直接消化的效果均不理想。唯有探針9，擁有足夠長度且與cdna完全互補(bǔ)，因此其雜交產(chǎn)物可直接被dsdnase有效降解。

然而，以上3條探針經(jīng)過一步合成延伸后，均產(chǎn)生了足夠長度的完全互補(bǔ)的雙鏈dna，因此延伸后的雜交產(chǎn)物，均被dsdnase有效降解。因此，本實(shí)施例證明了發(fā)明可使用較短的或與待去除rna的序列部分匹配的探針進(jìn)行雜交，再輔以延伸步驟后，同樣可用dsn實(shí)現(xiàn)對(duì)非目標(biāo)rna的成功去除。該結(jié)論進(jìn)一步證實(shí)并增強(qiáng)了雜交探針設(shè)計(jì)時(shí)的靈活性，使得本發(fā)明更為實(shí)用，應(yīng)用范圍更加寬廣。

表2實(shí)施例2中探針雜交后直接消化的模板qpcr全ct值

表3實(shí)施例2中探針雜交后先延伸再消化的模板qpcr全ct值

顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式的限定，對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)，這里無法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。

sequencelisting

<110>北京全式金生物技術(shù)有限公司

<120>一種去除rna樣本中非目標(biāo)rna的方法

<130>jlc17i0176e

<160>14

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工合成18srrnaf

<400>1

ggccctgtaattggaatgagtc22

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工合成18srrnar

<400>2

ccaagatccaactacgagctt21

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工合成gapdhf

<400>3

tcctgcaccaccaactgctta21

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>人工合成gapdhr

<400>4

aggggccatccacagtcttct21

<210>5

<211>50

<212>dna

<213>人工合成18srrnaprobe1

<400>5

taatgatccttccgcaggttcacctacggaaaccttgttacgacttttac50

<210>6

<211>50

<212>dna

<213>人工合成18srrnaprobe2

<400>6

ttcctctagatagtcaagttcgaccgtcttctcagcgctccgccagggcc50

<210>7

<211>50

<212>dna

<213>人工合成18srrnaprobe3

<400>7

gtgggccgaccccggcggggccgatccgagggcctcactaaaccatccaa50

<210>8

<211>50

<212>dna

<213>人工合成18srrnaprobe4

<400>8

tcggtagtagcgacgggcggtgtgtacaaagggcagggacttaatcaacg50

<210>9

<211>50

<212>dna

<213>人工合成18srrnaprobe5

<400>9

caagcttatgacccgcacttactcgggaattccctcgttcatggggaata50

<210>10

<211>50

<212>dna

<213>人工合成18srrnaprobe6

<400>10

attgcaatccccgatccccatcacgaatggggttcaacgggttacccgcg50

<210>11

<211>21

<212>dna

<213>人工合成adapter1-randomprimer

<400>11

gtctcgtgggctcggnnnnnn21

<210>12

<211>8

<212>dna

<213>人工合成18srrnaprobe7

<400>12

ggttcacc8

<210>13

<211>12

<212>dna

<213>人工合成18srrnaprobe8

<400>13

ggttcgtctacg12

<210>14

<211>12

<212>dna

<213>人工合成18srrnaprobe9

<400>14

ggttcacctacg12