本發(fā)明涉及微生物及生物降解領(lǐng)域，具體地，涉及一種赤紅球菌(rhodococcusruber)yc-yt1及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

鄰苯二甲酸酯(phthalateacidesters，簡(jiǎn)稱(chēng)paes)，又稱(chēng)酞酸酯，是鄰苯二甲酸形成的酯類(lèi)統(tǒng)稱(chēng)。鄰苯二甲酸酯是一類(lèi)以人工合成為主要來(lái)源的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，主要用于制備聚氯乙烯材料，起到增塑劑的作用。作為增塑劑，paes在塑料制品中的含量占20％～30％左右，甚至高達(dá)50％。自上世紀(jì)50年代聚氯乙烯(pvc)面世以來(lái)，paes就得到大規(guī)模的生產(chǎn)。目前，它占據(jù)全球增塑劑市場(chǎng)80％份額以上。除了作為增塑劑外，paes還廣泛用于油漆、粘合劑、驅(qū)蟲(chóng)劑、化妝品、香料和潤(rùn)滑劑的生產(chǎn)原料。在德國(guó)，每年paes的消耗達(dá)到四十萬(wàn)噸，全球每年paes的使用量在820萬(wàn)噸以上，其中1％以上通過(guò)滲漏進(jìn)入環(huán)境。目前，paes在全球主要工業(yè)國(guó)的生態(tài)環(huán)境中已普遍檢出。paes已成為全球最常見(jiàn)的污染物之一。因此，如何實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)境中鄰苯二甲酸酯類(lèi)污染物的高效降解，成為亟待解決的問(wèn)題。

鄰苯二甲酸酯共有30多種，大多是無(wú)色透明的油狀液體,一般難溶于水,易溶于有機(jī)溶劑,屬中等極性物質(zhì),可通過(guò)呼吸、飲食和皮膚接觸進(jìn)入人和動(dòng)物體內(nèi)。鄰苯二甲酸酯對(duì)人體健康的影響是一個(gè)慢性的過(guò)程,需要較長(zhǎng)的時(shí)間才會(huì)出現(xiàn),而且可能通過(guò)胎盤(pán)和授乳產(chǎn)生跨代影響,所以目前主要通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)其毒性進(jìn)行研究。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,鄰苯二甲酸酯急性毒性不大,對(duì)ames試驗(yàn)(污染物致突變性檢測(cè))呈陰性反應(yīng),但在大劑量情況下,對(duì)動(dòng)物有致畸、致癌和致突變作用。其亞急性毒性主要表現(xiàn)為損害肝、腎、睪丸,抑制精子形成,影響生殖機(jī)能等。鄰苯二甲酸酯含有較弱的雌性荷爾蒙活性成分。近來(lái)的研究指出，paes主要的危害在于環(huán)境激素作用，可在極低的濃度下干擾人和動(dòng)物的內(nèi)分泌系統(tǒng)。其對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)的擾亂是通過(guò)雌激素受體(estrogenreceptor)介導(dǎo)的反應(yīng)，通過(guò)與雌激素受體結(jié)合，作用于dna中雌激素反應(yīng)元件(estrogenrespoponsiveelement)激活基因的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生雌激素效應(yīng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，作為內(nèi)分泌干擾物，paes的生化效應(yīng)表現(xiàn)為過(guò)氧化酶體增生、足細(xì)胞毒性、肝臟促進(jìn)作用、抗雄激素、體外雌激素活性等。對(duì)動(dòng)物生殖方面的擾亂主要是使精囊萎縮、精子數(shù)量減少以至于精子形成中止、生殖能力下降、后代數(shù)量減少、體重下降、子宮粘膜組織增生等。具有環(huán)境激素作用的鄰苯二甲酸酯類(lèi)物質(zhì)有十幾種，其中鄰苯二甲酸二甲酯(dmp)、鄰苯二甲酸二乙酯(dep)、鄰苯二甲酸二丙酯(dipropylphtalate，dpp)、鄰苯二甲酸二正丁酯(dbp)、鄰苯二甲酸二辛酯(dioctylphthalate，dop)和鄰苯二甲酸二(2-乙基已基)酯(dehp)屬于美國(guó)環(huán)保局認(rèn)定的優(yōu)先污染物。

paes在環(huán)境中的水解、光解的速率十分緩慢，微生物降解是其礦化的主要途徑。近年來(lái)，paes的細(xì)菌降解已經(jīng)得到廣泛的研究，大量高效降解paes的菌株已經(jīng)從各類(lèi)環(huán)境中分離得到。同時(shí)，細(xì)菌對(duì)paes的代謝途徑和鄰苯二甲酸降解的遺傳機(jī)制也得到深入的研究。但是對(duì)其降解的遺傳機(jī)制的研究主要集中在對(duì)參與從鄰苯二甲酸到原兒茶酚降解的酶基因進(jìn)行克隆和鑒定，尚未深入到蛋白方面的研究；并且對(duì)于從鄰苯二甲酸酯到鄰苯二甲酸兩步脫酯過(guò)程中涉及到的酶基因研究較少。而且目前缺少在實(shí)際環(huán)境中應(yīng)用的報(bào)道，例如工業(yè)廢水的環(huán)境條件比較苛刻，高鹽，極端ph，污染物種類(lèi)豐富等，這些都對(duì)微生物的耐受性提出了更高的要求。因此，尋找在高鹽濃度下依然保持對(duì)多種鄰苯二甲酸酯類(lèi)污染物的降解能力的菌株對(duì)于治理環(huán)境污染具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一株能夠降解鄰苯二甲酸酯的赤紅球菌yc-yt1及其在鄰苯二甲酸酯類(lèi)物質(zhì)降解中的應(yīng)用。

本發(fā)明的菌株yc-yt1是從廣東省深圳市南山區(qū)西麗鎮(zhèn)新圍村旺棠工業(yè)區(qū)附近水渠中分離到一株能夠降解鄰苯二甲酸二(2-乙基已基)酯(dehp)、鄰苯二甲酸二環(huán)己酯(dchp)、鄰苯二甲酸二甲酯(dmp)、鄰苯二甲酸二正丁酯(dbp)、鄰苯二甲酸二乙酯(dep)等多種鄰苯二甲酸酯的細(xì)菌。

在電鏡下觀(guān)察(圖1)，該菌形態(tài)細(xì)胞多樣，從圓球狀萌芽成短桿狀，無(wú)鞭毛，無(wú)芽孢。菌落呈圓形，邊緣光滑，粘質(zhì)色素為橙黃色素(圖2)。菌株革蘭氏染色、過(guò)氧化氫酶活性及脲酶反應(yīng)均為陽(yáng)性；氧化酶活性和吲哚反應(yīng)為陰性。基于形態(tài)特征、生理生化特征，將該菌株鑒定為赤紅球菌rhodococcusruber，命名為yc-yt1。該菌株于2017年3月31日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)cgmcc，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號(hào)為cgmccno.13959，分類(lèi)名為赤紅球菌rhodococcusruber。

本發(fā)明提供了含有赤紅球菌yc-yt1的菌劑。

本發(fā)明提供了含有赤紅球菌yc-yt1的生物清潔劑。

本發(fā)明提供了赤紅球菌yc-yt1或含有其的菌劑或含有其的生物清潔劑在清潔環(huán)境中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，本發(fā)明提供了赤紅球菌yc-yt1或含有其的菌劑或含有其的生物清潔劑在降解污染物中的應(yīng)用。

其中，所述的有機(jī)污染物為鄰苯二甲酸酯類(lèi)物質(zhì)。所述鄰苯二甲酸酯類(lèi)物質(zhì)包括鄰苯二甲酸二(2-乙基已基)酯(dehp)、鄰苯二甲酸二環(huán)己酯(dchp)、鄰苯二甲酸二甲酯(dmp)、鄰苯二甲酸二乙酯(dep)、鄰苯二甲酸二丁酯(dbp)、鄰苯二甲酸二丙酯(dprp)、鄰苯二甲酸丁基芐基酯(bbp)、鄰苯二甲酸二戊酯(dap)、鄰苯二甲酸二已酯(dhp)、鄰苯二甲酸二庚酯(dhpp)、鄰苯二甲酸二辛酯(dop)、鄰苯二甲酸二壬酯(dnp)、鄰苯二甲酸二癸酯(ddp)。

本發(fā)明進(jìn)一步提供所述赤紅球菌yc-yt1在制備鄰苯二甲酸酯類(lèi)物質(zhì)的生物降解劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了赤紅球菌yc-yt1在制備生物清潔劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明的赤紅球菌yc-yt1在模擬廢水處理中，可將無(wú)機(jī)鹽離子培養(yǎng)基(含70g/lnacl)中同時(shí)含有的dehp、dchp、dmp、dbp和dep高效降解，7天內(nèi)降解率均在90％以上。

本發(fā)明的赤紅球菌yc-yt1可將無(wú)機(jī)鹽離子培養(yǎng)基中各100mg/l的dehp、dprp和bbp完全降解，對(duì)菌株進(jìn)行連續(xù)轉(zhuǎn)接測(cè)定降解能力，表明該菌降解能力穩(wěn)定。該菌對(duì)于鹽離子濃度、ph和溫度具有較寬的耐受范圍，能分別在nacl濃度為0-70g/l，80-120g/l的無(wú)機(jī)鹽離子培養(yǎng)基中含有的100mg/l的dehp在3天內(nèi)的降解率大于98％和85％；在ph4-10的范圍內(nèi)能夠高效降解dehp，當(dāng)ph5.0-10.0時(shí)，對(duì)無(wú)機(jī)鹽離子培養(yǎng)基中100mg/l的dehp在3天內(nèi)的降解率為100％，能在10～50℃溫度范圍內(nèi)高效降解dehp，16℃和30℃條件下，60h內(nèi)可完全降解無(wú)機(jī)鹽離子培養(yǎng)基中100mg/l的dehp。當(dāng)nacl濃度大于120g/l，或溫度高于50℃，或ph大于11或小于4時(shí)，dehp降解被顯著抑制。

本發(fā)明提供的赤紅球菌yc-yt1及其菌劑在使用過(guò)程中無(wú)污染，無(wú)公害，能夠應(yīng)用于多種鄰苯二甲酸酯類(lèi)環(huán)境污染的生物修復(fù)及具有較高濃度鄰苯二甲酸酯生產(chǎn)廢水的處理，降解譜廣，可在較低和較高溫度下進(jìn)行生物修復(fù)，可廣泛應(yīng)用于環(huán)境土壤清潔領(lǐng)域及工業(yè)廢水的清潔處理，具有較好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明赤紅球菌yc-yt1在電鏡下的形態(tài)結(jié)構(gòu)圖。

圖2為本發(fā)明赤紅球菌yc-yt1在lb固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)。

圖3為本發(fā)明赤紅球菌yc-yt1的16srrna基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖。

圖4為本發(fā)明赤紅球菌yc-yt1在含不同鄰苯二甲酸酯底物的無(wú)機(jī)鹽離子培養(yǎng)基中對(duì)100mg/ldehp的降解率。

圖5為本發(fā)明實(shí)例2中的gc法檢測(cè)赤紅球菌yc-yt1對(duì)濃度分別100mg/l的ddp、dnp、dop、dchp、dehp、bbp、dhpp、dhp、dap、dbp、dprp、dep、dmp的降解能力。

圖6a為本發(fā)明實(shí)施例2中的ddp、dop、dbp、dpep和dhp濃度與302nm處吸收峰面積關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖；圖6b為本發(fā)明實(shí)施例2中的dmp、dep、dprp和dnp濃度與302nm處吸收峰面積關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖；圖6c為本發(fā)明實(shí)施例2中的bbp、dehp、dchp和dhpp濃度與302nm處吸收峰面積關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖。

圖7為本發(fā)明赤紅球菌yc-yt1在不同ph的無(wú)機(jī)鹽離子培養(yǎng)基中對(duì)100mg/ldehp的降解率。

圖8a和圖8b為本發(fā)明實(shí)施例2中赤紅球菌yc-yt1在不同氯化鈉濃度的無(wú)機(jī)鹽離子培養(yǎng)基中對(duì)100mg/ldehp的降解率。

圖9為本發(fā)明實(shí)施例2中赤紅球菌yc-yt1在不同溫度濃度的無(wú)機(jī)鹽離子培養(yǎng)基中對(duì)100mg/ldehp的降解率。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，實(shí)施例中所用的化學(xué)試劑均為常規(guī)市售試劑，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

本申請(qǐng)使用的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基具有以下組成：1.0g/lnh4no3,0.5g/lnacl,0.5g/l(nh4)2so4,0.5g/lkh2po4,1.5g/lk2hpo4和0.005g/l酵母提取物，ph＝7.0±0.2。

斜面培養(yǎng)基：10.0g/l蛋白胨，5.0g/lnacl，10.0g/l酵母提取物，ph＝7.0±0.2。

平板培養(yǎng)基為相應(yīng)的培養(yǎng)基中加入1.5％的瓊脂。

實(shí)施例1赤紅球菌yc-yt1的分離和鑒定

1、菌株的分離

活性污泥樣品采集于廣東省深圳市南山區(qū)西麗鎮(zhèn)新圍村旺棠工業(yè)區(qū)附近水渠。在無(wú)菌操作條件下，將10g活性污泥樣品接種到用100ml含100mg/ldehp的無(wú)機(jī)鹽離子培養(yǎng)基中，在30℃，180rpm條件下培養(yǎng)。每培養(yǎng)7天后，取培養(yǎng)體積的5％轉(zhuǎn)接至新鮮無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，且每次將dehp的濃度提高100mg/l，連續(xù)轉(zhuǎn)接3次，直至無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中dehp濃度提高到300mg/l。

將馴化后的菌液劃線(xiàn)到含有100mg/ldehp的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。挑取在平板上的單菌落進(jìn)行劃線(xiàn)后培養(yǎng)，重復(fù)三次，直至分離獲得純化的菌株。挑取純化后的單菌落轉(zhuǎn)接到含濃度為100mg/ldehp的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天，將生長(zhǎng)好、傳代穩(wěn)定且降解能力較好的菌株進(jìn)行斜面保存。菌株命名為yc-yt1。

2、菌株的形態(tài)學(xué)特征

該菌為革蘭氏染色陽(yáng)性，圓形萌芽成短桿菌，形態(tài)多樣，無(wú)鞭毛，無(wú)芽孢(見(jiàn)圖1)；在lb培養(yǎng)基上菌落為橙黃色，濕軟，圓形凸起，邊緣規(guī)整，不透明，表面光滑(見(jiàn)圖2)。

3、16srdna鑒定

將菌株yc-yt1接種到lb培養(yǎng)基中，30℃、180rpm條件下過(guò)夜培養(yǎng)，取3ml菌液，離心收集菌體，用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取基因組dna，得到的基因dna用0.8％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增16srdna序列的一對(duì)通用引物：27f5'-agagtttgatcctggctcag-3'和1492r5'-ggttaccttgttacgactt-3'，用基因組dna作為模板，加入premixtaq^tm，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr產(chǎn)物用0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用dna純化回收試劑盒純化，連接到pgm-t載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布到含有氨芐青霉素的lb固體培養(yǎng)基平板上，在37℃下培養(yǎng)12h，挑取白色菌落至液體lb培養(yǎng)基中，37℃、180rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，送上海生工生物公司進(jìn)行測(cè)序。將該序列在ncbi網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上進(jìn)行blast比對(duì)分析，并利用mega6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)可知，菌株yc-yt1為紅球菌，與目前已發(fā)表的赤紅球菌序列具有較高相似性。

4、biolog鑒定

將菌株yc-yt1接種到lb培養(yǎng)基平板中，30℃條件下倒置培養(yǎng)5天，挑單菌落到biologa液和b液中，分別使液體的透光率由100％降至98％和95％，然后按照每孔100μl將a液、b液分別加入biolog培養(yǎng)板中，30℃培養(yǎng)33h，用biolog微生物鑒定儀進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果顯示yc-yt1為赤紅球菌(rhodococcusruber)。

綜合菌體形態(tài)、16srdna基因序列以及biolog結(jié)果，菌株yc-yt1被鑒定赤紅球菌(rhodococcusruber)。

綜合菌體形態(tài)、生理生化特性和16srdna基因序列，菌株yc-yt1被鑒定為赤紅球菌(rhodococcusruber)。該菌株yc-yt1于2017年03月31日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)cgmcc，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號(hào)為cgmccno.13959，分類(lèi)名為赤紅球菌rhodococcusruber。

實(shí)施例2赤紅球菌yc-yt1的降解性能試驗(yàn)

1、赤紅球菌yc-yt1對(duì)濃度為100mg/l的鄰苯二甲酸二(2-乙基已基)酯(dehp)、鄰苯二甲酸二丙酯(dprp)、鄰苯二甲酸丁基芐基酯(bbp)、鄰苯二甲酸二甲酯(dmp)、鄰苯二甲酸二乙酯(dep)、鄰苯二甲酸二丁酯(dbp)、鄰苯二甲酸二戊酯(dap)、鄰苯二甲酸二已酯(dhp)、鄰苯二甲酸二庚酯(dhpp)、鄰苯二甲酸二環(huán)已酯(dchp)、鄰苯二甲酸二辛酯(dop)、鄰苯二甲酸二壬酯(dnp)、鄰苯二甲酸二癸酯(ddp)的降解能力見(jiàn)圖4。

高效氣相色譜法檢測(cè)赤紅球菌yc-yt1對(duì)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中鄰苯二甲酸二(2-乙基已基)酯(dehp)、鄰苯二甲酸二丙酯(dprp)、鄰苯二甲酸丁基芐基酯(bbp)、鄰苯二甲酸二甲酯(dmp)、鄰苯二甲酸二乙酯(dep)、鄰苯二甲酸二丁酯(dbp)、鄰苯二甲酸二戊酯(dap)、鄰苯二甲酸二已酯(dhp)、鄰苯二甲酸二庚酯(dhpp)、鄰苯二甲酸二環(huán)已酯(dchp)、鄰苯二甲酸二辛酯(dop)、鄰苯二甲酸二壬酯(dnp)、鄰苯二甲酸二癸酯(ddp)具有同時(shí)降解作用。

將菌株yc-yt1接種到液體lb培養(yǎng)基中活化，培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期od600＝0.8，按照體積比5％的接種量接種到同時(shí)含鄰苯二甲酸二(2-乙基已基)酯(dehp)、鄰苯二甲酸二丙酯(dprp)、鄰苯二甲酸丁基芐基酯(bbp)鄰苯二甲酸二甲酯(dmp)、鄰苯二甲酸二乙酯(dep)、鄰苯二甲酸二丁酯(dbp)、鄰苯二甲酸二戊酯(dap)、鄰苯二甲酸二已酯(dhp)、鄰苯二甲酸二庚酯(dhpp)、、鄰苯二甲酸二環(huán)已酯(dchp)、鄰苯二甲酸二辛酯(dop)、鄰苯二甲酸二壬酯(dnp)、鄰苯二甲酸二癸酯(ddp)各100mg/l混合物的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，作為處理組，以未接種菌株的含鄰苯二甲酸二(2-乙基已基)酯(dehp)、鄰苯二甲酸二丙酯(dprp)、鄰苯二甲酸丁基芐基酯(bbp)、鄰苯二甲酸二甲酯(dmp)、鄰苯二甲酸二乙酯(dep)、鄰苯二甲酸二丁酯(dbp)、鄰苯二甲酸二戊酯(dap)、鄰苯二甲酸二已酯(dhp)、鄰苯二甲酸二庚酯(dhpp)、鄰苯二甲酸二環(huán)已酯(dchp)、鄰苯二甲酸二辛酯(dop)、鄰苯二甲酸二壬酯(dnp)、鄰苯二甲酸二癸酯(ddp)各100mg/l混合物的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基作為對(duì)照組，對(duì)照組與處理組各設(shè)三個(gè)重復(fù)。將對(duì)照組與處理組在30℃條件下，180rpm搖床振蕩避光培養(yǎng)，在培養(yǎng)的第7天停止培養(yǎng)并測(cè)定每種物質(zhì)的濃度。

向取得的樣品中加入等體積的正已烷超聲波充分振蕩抽提10分鐘，靜置1小時(shí)，取上層有機(jī)溶劑，將有機(jī)溶劑揮發(fā)干后，用等體積的甲醇重溶，然后用0.22μm的有機(jī)系濾膜過(guò)濾，進(jìn)行g(shù)c分析。

gc分析條件為：shimadzugc-2010高效氣相色譜儀，儀器配置為：rtx-1301毛細(xì)管柱(30.0m×0.25mm×0.25μm)與離子捕獲檢測(cè)器(ecd)，檢測(cè)條件：樣品進(jìn)口溫度300℃，檢測(cè)器溫度300℃，柱箱溫度280℃，載氣為氮?dú)?純度≥99.999％，流速為30ml/min)，＝進(jìn)樣體積1.0μl，使用軟件gcsolution(v2.32.00,shimadzu)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，確定ddp、dnp、dop、dchp、dehp、bbp、dhpp、dhp、dap、dbp、dprp、dep、dmp的保留時(shí)間分別為：16.358min、14.173min、12.296min、9.995min、9.608min、8.161min、7.732min、6.393min、5.377min、4.575min、3.970min、3.624min、3.515min；(圖5)；鄰苯二甲酸酯標(biāo)準(zhǔn)品繪制濃度與302nm處吸收峰面積之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(圖6a-圖6c)。

降解率的計(jì)算：根據(jù)不同底物的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算每種底物在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中每天的殘留濃度，再根據(jù)降解率計(jì)算公式得到菌株yc-yt1對(duì)底物的降解率(表1)。

降解率％＝(對(duì)照組中底物的終濃度-處理組中底物的終濃度)/對(duì)照組中底物的終濃度×100％

自然降解率％＝(底物初始濃度-對(duì)照組中底物濃度)/底物初始濃度×100％

表1各菌株yc-yt1對(duì)種底物的降解率與底物的自然降解率

2、赤紅球菌yc-yt1對(duì)ph的耐受

分別配制不同ph值(4、5、6、7、8、9、10)的無(wú)機(jī)鹽離子培養(yǎng)基，滅菌備用。向配制的無(wú)機(jī)鹽離子培養(yǎng)基中分別加入dehp至底物濃度100mg/l。將菌株yc-yt1接種到液體lb培養(yǎng)基中活化，培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期od600＝0.8，按照體積比5％的接種量接種到上述培養(yǎng)基中，作為處理組，30℃，180rpm搖床振蕩避光培養(yǎng)。

以未接種菌株不同ph的同時(shí)加入dehp至濃度為100mg/l的相同培養(yǎng)基作為對(duì)照組，同樣在30℃，180rpm搖床振蕩避光培養(yǎng)，培養(yǎng)3天后測(cè)定溶液中dehp濃度并計(jì)算降解率。

圖7為3天內(nèi)不同ph條件下赤紅球菌yc-yt1對(duì)dehp降解率。當(dāng)ph值從4.0增加到5.0，dehp的降解率逐漸由40％增加到99％以上。當(dāng)ph值由7.0升高到8.0時(shí)，yc-yt1對(duì)dehp的降解效率由100％逐漸降低至90％。當(dāng)ph值大于8，ph＝9或10.0時(shí)，yc-yt1對(duì)dehp的降解率又回升至最高值100％。

3、赤紅球菌yc-yt1對(duì)鹽濃度耐受能力

分別配制不同nacl濃度(1、3、5、7、10、15、20、25、40、50、60、70、80、90、100、110和120g/l)的無(wú)機(jī)鹽離子培養(yǎng)基，滅菌備用。向配制的無(wú)機(jī)鹽離子培養(yǎng)基分別加入dehp至底物濃度100mg/l。將菌株yc-yt1接種到液體lb培養(yǎng)基中活化，培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期od600＝0.8，按照體積比5％的接種量接種到上述培養(yǎng)基中，作為處理組，30℃，180rpm搖床振蕩避光培養(yǎng)。

以未接種菌株的含有不同nacl濃度同時(shí)加入dehp至濃度為100mg/l的相同無(wú)機(jī)鹽離子培養(yǎng)基作為對(duì)照組，同樣在30℃下，180rpm搖床振蕩避光培養(yǎng)。培養(yǎng)60小時(shí)后測(cè)定溶液中dehp濃度，并計(jì)算降解率。

圖8a和圖8b為60小時(shí)內(nèi)不同鹽濃度條件下，赤紅球菌yc-yt1對(duì)dehp的降解率。結(jié)果顯示，當(dāng)nacl濃度在1～100g/l之間時(shí)，60小時(shí)內(nèi)菌株對(duì)dehp的降解率在90-98％，當(dāng)nacl濃度為110g/l時(shí)，底物降解率下降至60％；當(dāng)nacl濃度提高至120g/l時(shí)，底物降解率又回升至85％以上。由此說(shuō)明，菌株yc-yt1具有較好的耐鹽能力，能在較高鹽濃度(≤100g/l)條件下高效降解dehp。當(dāng)nacl濃度達(dá)到一定濃度時(shí)，菌株自身代謝調(diào)控系統(tǒng)做出一定的調(diào)整，以便適應(yīng)更極端的環(huán)境條件。

4、赤紅球菌yc-yt1對(duì)溫度耐受能力

將菌株yc-yt1接種到液體lb培養(yǎng)基中活化，培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期od600＝0.8，按照體積比5％的接種量接種無(wú)機(jī)鹽離子培養(yǎng)基(dehp濃度為100mg/l)中，分別在10℃、16℃、30℃、40℃、50℃條件下，180rpm搖床振蕩避光培養(yǎng)。

以未接種菌株的含100mg/ldehp的相同無(wú)機(jī)鹽離子培養(yǎng)基作為對(duì)照組，同樣在10℃、16℃、30℃、40℃、50℃條件下，180rpm搖床振蕩避光培養(yǎng)60小時(shí)后測(cè)定溶液中dehp濃度并計(jì)算降解率。

圖9為60小時(shí)內(nèi)赤紅球菌yc-yt1在不同溫度條件下對(duì)dehp的降解率。10℃時(shí)，降解率可達(dá)為90％以上，說(shuō)明菌株可耐受較低的溫度條件，菌株所分泌的降解酶或許是低溫啟動(dòng)溫；隨著溫度升高至30℃，dehp降解率能達(dá)到最大值100％；當(dāng)溫度升高到40-50℃時(shí)，降解率有所下降，但降解率仍可達(dá)到90％以上，由此說(shuō)明，菌株yc-yt1對(duì)溫度的耐受范圍很廣，低溫和高溫條件均有較高降解率。

實(shí)施例3赤紅球菌yc-yt1對(duì)含多種鄰苯二甲酸酯廢水處理中的應(yīng)用

本實(shí)施例中使用含70g/lnacl的無(wú)機(jī)鹽離子培養(yǎng)基(未滅菌)作為模擬廢水(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“廢水”)，利用5.0l的發(fā)酵罐(bioflo115，newbrunswickscientificco.,nj,usa)進(jìn)行模擬廢水處理。將赤紅球菌yc-yt1在lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(od600＝0.8，菌體濃度約為1.6×10⁸cfu/ml)，向廢水中加入制備的菌液至終濃度分別為8×10⁷cfu/l、1.6×10⁸cfu/l、3.2×10⁸cfu/l、4.8×10⁸cfu/l、6.4×10⁸cfu/l和8.0×10⁸cfu/l廢水(每個(gè)處理為2l廢水)，并向廢水中同時(shí)加入dehp、dprp、dbp、dop和bbp至各濃度為100mg/l，作為處理組；同時(shí)，以相同條件下加入相同濃度污染物底物且不接菌的廢水作為對(duì)照組。攪拌轉(zhuǎn)速為150rpm，通氣比為0.8(空氣)，培養(yǎng)溫度為30℃。反應(yīng)液ph值和溶氧量(do)通過(guò)反應(yīng)器的操作系統(tǒng)監(jiān)測(cè)。在處理的第7天取樣測(cè)定各種底物濃度。對(duì)照組與處理組均進(jìn)行3次重復(fù)。

取樣方法：每次處理結(jié)束后，向發(fā)酵罐中加入2l正己烷，利用發(fā)酵罐的馬達(dá)進(jìn)行攪拌，1小時(shí)后靜置30分鐘(整個(gè)過(guò)程中關(guān)閉發(fā)酵罐所有管路)，取20ml上層有機(jī)相用于各底物濃度檢測(cè)。根據(jù)最終測(cè)定處理組與對(duì)照組中底物的濃度計(jì)算菌株yc-yt1對(duì)廢水中各底物的降解率。

赤紅球菌yc-yt1對(duì)廢水中各底物的降解率如表2所示，隨著加入菌體量的增加各種底物的降解率逐漸提高，當(dāng)接菌量達(dá)到4.8×10⁸cfu/l廢水時(shí)，各底物的降解率基本達(dá)到最大值。

表2赤紅球菌yc-yt1對(duì)廢水中各底物的降解率

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

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<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院

<120>一種能夠降解鄰苯二甲酸酯的赤紅球菌及其應(yīng)用

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