本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于制備l-丙氨酸的方法。

背景技術(shù)：

l-丙氨酸是人體血液中含量最高的氨基酸，具有廣泛的用途。l-丙氨酸具有獨特的改善風(fēng)味的效果，食品和飲料中添加l-丙氨酸可以明顯提高食品和飲料中蛋白質(zhì)的利用率，從而改善有機酸的酸味；l-丙氨酸是一種很好的利尿藥，是生產(chǎn)維生素b6及l(fā)-氨基丙醇的主要原料；另外添加l-丙氨酸還可以提高聚乳酸的性能。

目前，工業(yè)上大多采用酶法生產(chǎn)l-丙氨酸，即通過富含l-天冬氨酸-β-脫羧酶活力的微生物細(xì)胞催化l-天冬氨酸而得到。酶法轉(zhuǎn)化工藝的特點是酶活力高，設(shè)備投資小，提取工藝簡單，但主要原料l-天冬氨酸價格波動太大，不能保證常年穩(wěn)定生產(chǎn)。近年來，出現(xiàn)了以葡萄糖為主要原料、厭氧直接發(fā)酵生產(chǎn)l-丙酸的方法，隨著l-丙氨酸含量的不斷積累，殘?zhí)呛恐饾u降低，但是當(dāng)殘?zhí)墙档偷揭欢ǔ潭葧r，菌種的代謝能力下降，致使發(fā)酵周期延長，殘?zhí)遣荒苓M(jìn)一步消耗，發(fā)酵轉(zhuǎn)化率難以進(jìn)一步提高，造成后提取困難，生產(chǎn)成本增加。因此開發(fā)出一種能夠有效提高l-丙氨酸發(fā)酵水平的方法具有現(xiàn)實意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種制備l-丙氨酸的方法，其為：在利用葡萄糖濃度為110-125g/l的葡萄糖培養(yǎng)基對德氏乳桿菌突變菌株lds.0108進(jìn)行培養(yǎng)的過程中，當(dāng)發(fā)酵液中殘?zhí)呛康陀?0g/l時，向發(fā)酵液中補加與種子液濃度相同的新鮮種子液，繼續(xù)培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束。

考慮到微生物培養(yǎng)的特殊性和實驗誤差，上述與種子液相同的新鮮種子液是指二者的制備方法相同，且二者的od值的大小差別在0.5以內(nèi)。

本發(fā)明所用的菌種為：lds.0108，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號：cctccno：m2013361。

當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到后期時，營養(yǎng)成分大大消耗，各種次級代謝產(chǎn)物逐漸積累，對參與反應(yīng)的各種酶的活力產(chǎn)生了不利影響，菌種的代謝活力降低，發(fā)酵液中的營養(yǎng)成分減少，此時，向處于發(fā)酵后期的發(fā)酵液中加入新鮮的種子液，由于新鮮種子液中菌種處于對數(shù)生長期，菌種的代謝活力強，營養(yǎng)成分高，參與代謝反應(yīng)的酶活力較高，因此在其它發(fā)酵條件不變的情況下，l-丙氨酸的發(fā)酵水平得到提高，殘?zhí)墙档?，轉(zhuǎn)化率提高，發(fā)酵周期縮短，從而降低了生成成本。

優(yōu)選的，當(dāng)發(fā)酵液中殘?zhí)呛繛?0-45g/l時，向發(fā)酵液中補加與種子液濃度相同的新鮮種子液。當(dāng)殘?zhí)呛吭谶@個范圍內(nèi)時，發(fā)酵液中的營養(yǎng)成分逐漸減少，菌種的代謝活力逐漸降低，及時補加新鮮種子液，可以最大限度地提高轉(zhuǎn)化率。

優(yōu)選的，補加的新鮮種子液的體積占補加后發(fā)酵液總體積的1.5％-3.0％。若補加的新鮮種子液太少，則菌種數(shù)量較少，酶活力不夠，達(dá)不到預(yù)期效果；若補加的新鮮種子液太多，則占用較多發(fā)酵罐體積，同時造成不必要的浪費。

優(yōu)選的，所述新鮮種子液od值為4.0-8.0。此時新鮮種子液中菌種處于對數(shù)生長期，菌種的代謝活力強，營養(yǎng)成分高，參與代謝反應(yīng)的酶活力較高。

優(yōu)選的，每升所述葡萄糖培養(yǎng)基中，包括葡萄糖110-125g，na2hpo4·12h2o20g，kh2po42.0g，nacl0.5g，mgso4·7h2o0.2g，微量無機鹽溶液10ml/l，余量為純化水；

所述微量無機鹽溶液中：fecl3·6h2o2.5g/l，cocl2·6h2o0.2g/l，cucl2·2h2o0.1g/l，zncl20.2g/l，na2moo4·2h2o0.3g/l，h3bo30.1g/l，mncl2·4h2o0.5g/l，純化水余量。

優(yōu)選的，所述培養(yǎng)條件為：溫度：30℃；通風(fēng)量：0m³/h，壓力：0.04mpa-0.06mpa；ph：6.5-7.0。在實際生產(chǎn)中一般都是用液氨來調(diào)節(jié)ph，一方面控制ph，另一方面可以補充無機氮源。

上述的優(yōu)選方案中的一個或多個，均可與總的培養(yǎng)方案：在利用葡萄糖濃度為110-125g/l的葡萄糖培養(yǎng)基對德氏乳桿菌突變菌株lds.0108進(jìn)行培養(yǎng)的過程中，當(dāng)發(fā)酵液中殘?zhí)呛康陀?0g/l時，向發(fā)酵液中補加與種子液濃度相同的新鮮種子液，繼續(xù)培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束；進(jìn)行組合使用，組合后所得的任何一個方案均在本申請要保護(hù)的范圍內(nèi)。

進(jìn)一步優(yōu)選的，本發(fā)明所述的方法，包括如下步驟：

1)制備德氏乳桿菌突變菌株lds.0108種子液；

2)向所述葡萄糖培養(yǎng)基中接種體積分?jǐn)?shù)為5-10％的所述種子液進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；

3)當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖的濃度小于50g/l時，向發(fā)酵液中補加與種子液濃度相同的新鮮種子液，繼續(xù)培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束。

優(yōu)選的，所述種子液的制備包括如下步驟：

1)在無菌條件下，將菌種接種到lb斜面培養(yǎng)基上，在30℃條件下恒溫培養(yǎng)18h；

2)在無菌條件下，用無菌生理鹽水將斜面上的菌體洗下，制成菌懸液；

3)將菌懸液接種到滅菌后的液體lb培養(yǎng)基中，發(fā)酵條件為：溫度：30℃；空氣流量：2l/min，罐壓0.04-0.06mpa；培養(yǎng)至od值為4.0-8.0。

更優(yōu)選的，本發(fā)明所述的方法，包括如下步驟：

1、制備德氏乳桿菌突變菌株lds.0108種子液；

1)在無菌條件下，將菌種接種到lb斜面培養(yǎng)基上，在30℃條件下恒溫培養(yǎng)18h；

2)在無菌條件下，用無菌生理鹽水將斜面上的菌體洗下，制成菌懸液；

3)將菌懸液接種到滅菌后的液體lb培養(yǎng)基中，發(fā)酵條件為：溫度：30℃；空氣流量：2l/min，罐壓0.04-0.06mpa；培養(yǎng)至od值為4.0-8.0；

2、德氏乳桿菌突變菌株lds.0108的培養(yǎng)

向葡萄糖培養(yǎng)基中接種6％的所述種子液，在溫度：30℃；通風(fēng)量：0m³/h，壓力：0.04mpa-0.06mpa；液氨控制ph：6.5-7.0的條件下進(jìn)行發(fā)酵；

所述新鮮培養(yǎng)基的組成為每升所述葡萄糖培養(yǎng)基中，包括葡萄糖110-125g，na2hpo4·12h2o20g，kh2po42.0g，nacl0.5g，mgso4·7h2o0.2g，微量無機鹽溶液10ml，余量為純化水；

所述微量無機鹽溶液中：fecl3·6h2o2.5g/l，cocl2·6h2o0.2g/l，cucl2·2h2o0.1g/l，zncl20.2g/l，na2moo4·2h2o0.3g/l，h3bo30.1g/l，mncl2·4h2o0.5g/l，純化水余量。

3、補充新鮮種子液

當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖的濃度為30-45g/l時，向發(fā)酵液中補加與種子液濃度相同的新鮮種子液，至補加的新鮮種子液的體積占補加后發(fā)酵液總體積的1.5％-3.0％，繼續(xù)培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束。

本發(fā)明所述的方法包括如下有益效果：

本發(fā)明的方法在培養(yǎng)的后期添加新鮮種子液，由于酶活力的提高，可提高對培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的利用率，進(jìn)而提高l-丙氨酸的產(chǎn)量，還可縮短發(fā)酵的周期。放罐后發(fā)酵液中l(wèi)-丙氨酸的濃度由不補加種子液的80-90g/l提高到100-110g/l，殘?zhí)呛坑稍瓉淼?.3-2.1g/l降低到0.5-0.8g/l，發(fā)酵周期由原來的42h縮短到36h，發(fā)酵轉(zhuǎn)化率由原來的約80％提高到約90％。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

實施例1

本實施例涉及一種制備l-丙氨酸的方法,包括如下步驟:

1、制備種子液

(1)在無菌條件下，將lds.0108接種到lb斜面培養(yǎng)基上，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h。

(2)在無菌條件下，用150ml無菌生理鹽水將斜面上的菌體洗下，制成菌懸液。

(3)將菌懸液接種到滅菌后的液體lb培養(yǎng)基中，10l種子罐按7l配料。溫度：30℃；空氣流量：2l/min，罐壓0.04-0.06mpa；培養(yǎng)時間：5.6h，od(600nm)：4.30，移種到發(fā)酵培養(yǎng)基中。

2、制備葡萄糖培養(yǎng)基

按以下成分含量配制發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖110g/l，na2hpo4·12h2o20g/l，kh2po42.0g/l，nacl0.5g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，微量無機鹽10ml/l，純化水余量；

其中微量無機鹽包括：fecl3·6h2o2.5g/l，cocl2·6h2o0.2g/l，cucl2·2h2o0.1g/l，zncl20.2g/l，na2moo4·2h2o0.3g/l，h3bo30.1g/l，mncl2·4h2o0.5g/l，純化水余量。

121℃滅菌30min，降溫到30℃后，備用。

3、將上述制備得到的種子液按種量6％接種到所述葡萄糖培養(yǎng)基中，100l發(fā)酵罐按70l配料，在發(fā)酵溫度30℃；空氣流量0m³/h，罐壓0.04-0.06mpa的條件下進(jìn)行培養(yǎng)；發(fā)酵過程中采用液氨控制ph為6.5-7.0；

4、當(dāng)發(fā)酵液中殘?zhí)呛繛?3.6g/l時，補加新鮮種子液(新鮮種子液按與種子液相同的方法制備，其od值為4.25)，補加的新鮮種子液的體積占補加后總發(fā)酵液體積的2.0％，繼續(xù)培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束，整個發(fā)酵周期為22h。

發(fā)酵結(jié)束后，取樣進(jìn)行hplc測定，發(fā)酵液中l(wèi)-丙氨酸含量為97g/l，殘葡萄糖濃度為0.5g/l，發(fā)酵轉(zhuǎn)化率為88.2％。

實施例2

本實施例涉及一種制備l-丙氨酸的方法,包括如下步驟:

1、按照與實施例1中相同的方法，制備得到od值為5.24的種子液；

2、制備葡萄糖培養(yǎng)基

按以下成分含量配制發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖120g/l，na2hpo4·12h2o20g/l，kh2po42.0g/l，nacl0.5g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，微量無機鹽10ml/l，純化水余量；

其中微量無機鹽包括：fecl3·6h2o2.5g/l，cocl2·6h2o0.2g/l，cucl2·2h2o0.1g/l，zncl20.2g/l，na2moo4·2h2o0.3g/l，h3bo30.1g/l，mncl2·4h2o0.5g/l，純化水余量。

將上述培養(yǎng)基在121℃滅菌30min，降溫到30℃后，備用。

3、將上述制備得到的種子液按種量6％接種到所述葡萄糖培養(yǎng)基中，100l發(fā)酵罐按70l配料，在發(fā)酵溫度30℃；空氣流量0m³/h，罐壓0.04-0.06mpa的條件下進(jìn)行培養(yǎng)；發(fā)酵過程中采用液氨控制ph為6.5-7.0；

4、當(dāng)發(fā)酵液中殘?zhí)呛繛?8.7g/l時，補加新鮮種子液(新鮮種子液按與種子液相同的方法制備，其od值為5.36)，補加的新鮮種子液的體積占補加后總發(fā)酵液體積的2.5％，繼續(xù)培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束，整個發(fā)酵周期為25h。

發(fā)酵結(jié)束后，取樣進(jìn)行hplc測定，發(fā)酵液中l(wèi)-丙氨酸含量為107g/l，殘葡萄糖濃度為0.6g/l，發(fā)酵轉(zhuǎn)化率為89.2％。

實施例3

本實施例涉及一種制備l-丙氨酸的方法,包括如下步驟：

1、制備種子液

(1)在無菌條件下，將lds.0108接種到lb斜面培養(yǎng)基上，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h。

(2)在無菌條件下，用150ml無菌生理鹽水將斜面上的菌體洗下，制成菌懸液。

(3)將菌懸液接種到滅菌后的液體lb培養(yǎng)基中，100l種子罐按70l配料。溫度：30℃；空氣流量：20l/min，罐壓0.04-0.06mpa；培養(yǎng)時間：5.2h,od(600nm)：3.25，移種到二級種子培養(yǎng)基中。

(4)將一級種子液接種于液體lb培養(yǎng)基中，10t種子罐按7t配料。溫度：30℃；空氣流量：120m³/h，罐壓0.04-0.06mpa；培養(yǎng)時間：6.5h，od(600nm)：7.65，移種到發(fā)酵培養(yǎng)基中。

2、制備培養(yǎng)基

按以下成分含量配制發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖125g/l，na2hpo4·12h2o20g/l，kh2po42.0g/l，nacl0.5g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，微量無機鹽10ml/l，純化水余量；

其中微量無機鹽包括：fecl3·6h2o2.5g/l，cocl2·6h2o0.2g/l，cucl2·2h2o0.1g/l，zncl20.2g/l，na2moo4·2h2o0.3g/l，h3bo30.1g/l，mncl2·4h2o0.5g/l，純化水余量。

121℃滅菌30min，降溫到30℃后，備用。

3、將上述制備得到的種子液按種量6％接種到所述葡萄糖培養(yǎng)基中，100t發(fā)酵罐按70t配料，在發(fā)酵溫度30℃；空氣流量0m³/h，罐壓0.04-0.06mpa的條件下進(jìn)行培養(yǎng)；發(fā)酵過程中采用液氨控制ph為6.5-7.0；

4、當(dāng)發(fā)酵液中殘?zhí)呛繛?1.2g/l時，補加新鮮種子液(新鮮種子液按與種子液相同的方法制備，其od值為7.46)，補加的新鮮種子液的體積占補加后總發(fā)酵液體積的3.0％，繼續(xù)培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束，整個發(fā)酵周期為36h。

發(fā)酵結(jié)束后，取樣進(jìn)行hplc測定，發(fā)酵液中l(wèi)-丙氨酸含量為112g/l，殘葡萄糖濃度為0.8g/l，發(fā)酵轉(zhuǎn)化率為89.6％。

對比例1

與實施例1相比，其區(qū)別在于，不額外添加新鮮種子液，即沒有步驟4的操作，直接利用最初的培養(yǎng)液至發(fā)酵完成，培養(yǎng)周期為30h。

發(fā)酵結(jié)束后，取樣進(jìn)行hplc測定，發(fā)酵液中l(wèi)-丙氨酸含量為88g/l，殘葡萄糖濃度為2.1g/l，發(fā)酵轉(zhuǎn)化率為80％。

對比例2

與實施例1相比，其區(qū)別在于，當(dāng)溶液中殘?zhí)堑臐舛葹?4.8g/l時，補加相同的新鮮種子液，培養(yǎng)周期為25h。

發(fā)酵結(jié)束后，取樣進(jìn)行hplc測定，發(fā)酵液中l(wèi)-丙氨酸含量為93.5g/l，殘葡萄糖濃度為1.0g/l，發(fā)酵轉(zhuǎn)化率為85％。

對比例3

與實施例1相比，其區(qū)別在于，當(dāng)溶液中殘?zhí)堑臐舛葹?3.6g/l時補加相同的新鮮種子液，培養(yǎng)周期為27h。

發(fā)酵結(jié)束后，取樣進(jìn)行hplc測定，發(fā)酵液中l(wèi)-丙氨酸含量為91g/l，殘葡萄糖濃度為1.4g/l，發(fā)酵轉(zhuǎn)化率為82.7％。

對比例4

與實施例1相比，其區(qū)別在于，補加新鮮種子液至新鮮種子液占發(fā)酵液總體積的1.3％，培養(yǎng)周期為28h。

發(fā)酵結(jié)束后，取樣進(jìn)行hplc測定，發(fā)酵液中l(wèi)-丙氨酸含量為90g/l，殘葡萄糖濃度為1.5g/l，發(fā)酵轉(zhuǎn)化率為81.8％。

對比例5

與實施例1相比，其區(qū)別在于，補加新鮮種子液的od值為3.16，培養(yǎng)周期為25h。

發(fā)酵結(jié)束后，取樣進(jìn)行hplc測定，發(fā)酵液中l(wèi)-丙氨酸含量為94.5g/l，殘葡萄糖濃度為0.9g/l，發(fā)酵轉(zhuǎn)化率為85.9％。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明、具體實施方式及試驗，對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。