本發(fā)明涉及鴨抗原轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白tap2單克隆抗體以及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，本發(fā)明進(jìn)一步涉及它們?cè)诿庖呓M化中的應(yīng)用，屬于tap2單克隆抗體領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

抗原處理相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體(transporterassociatedwithantigenprocessing,tap)是一種異二聚體跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，tap1/tap2跨越內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜6次形成“匙孔”樣結(jié)構(gòu)。腫瘤抗原和病毒編碼蛋白等內(nèi)源性抗原，被抗原遞呈細(xì)胞(apc)內(nèi)的蛋白酶復(fù)合物水解成8-10個(gè)氨基酸的短肽。肽首先與“匙孔”的胞漿區(qū)結(jié)合，atp結(jié)合在tap1/tap2的羧基端，水解導(dǎo)致異二聚體構(gòu)型改變，開放跨膜通道，暴露膜內(nèi)區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)，肽段被轉(zhuǎn)運(yùn)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)。在tapasin、鈣連蛋白和鈣網(wǎng)蛋白等分子伴侶的協(xié)同作用下與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中新合成組裝完整的mhciα/β2m分子上的肽結(jié)合槽結(jié)合，形成穩(wěn)定的mhci-抗原肽復(fù)合物。分泌至apc細(xì)胞表面，被cd8+t細(xì)胞識(shí)別并引起免疫應(yīng)答。tap蛋白對(duì)mhci類分子在細(xì)胞膜上表達(dá)的密度和穩(wěn)定性起重要作用：tap分子缺陷或表達(dá)降低，可導(dǎo)致mhci類分子因沒有荷載抗原肽而無法在細(xì)胞表面穩(wěn)定表達(dá)。

不同種屬動(dòng)物的tap基因均位于mhc核心區(qū)域，但大小和基因組位置各不相同。火雞的tap基因還沒有明確鑒定，但是已通過序列分析獲得了功能和序列類似的mdr/tap基因。雞tap2基因與優(yōu)勢(shì)表達(dá)的mhc經(jīng)典i類分子a鏈編碼基因bf2緊密相連。鵪鶉tap基因結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，與經(jīng)典i類分子4個(gè)拷貝基因相鄰。鴨有tap1和tap2兩個(gè)反向轉(zhuǎn)錄的拷貝基因，其中tap2與mhci類分子5個(gè)拷貝基因中的優(yōu)勢(shì)表達(dá)基因uaa毗鄰。

在機(jī)體被致病性病毒侵襲或有應(yīng)激的情況下，如果tap基因組序列發(fā)生突變或其調(diào)節(jié)機(jī)制出現(xiàn)缺陷，均可以導(dǎo)致tap蛋白的活性下降和表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致腫瘤抗原不能被有效地轉(zhuǎn)運(yùn)，使腫瘤逃逸免疫監(jiān)視，最終引起病毒性感染或發(fā)生腫瘤。

tap基因的多態(tài)性與多種疫病的種族敏感性有關(guān)，相關(guān)度較高的有鼻咽癌(黃種人較白種人患病多)、原發(fā)性黑色素瘤、乳腺癌、漢族食管癌以及人乳頭瘤病毒導(dǎo)致的宮頸癌等，但免疫遺傳學(xué)分子機(jī)制尚未闡明。鴨的人工馴化時(shí)間較短，家鴨的遺傳資源豐富度遠(yuǎn)大于家雞，是良好的免疫遺傳研究的模式動(dòng)物。利用tap基因純合的無特定病原體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化鴨群感染鴨瘟或禽流感后，不同單倍型鴨的血清抗體效價(jià)或致病性不同，表明鴨tap基因有可能作為病毒病免疫遺傳機(jī)制研究的候選靶基因。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供一株穩(wěn)定分泌鴨抗原轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白tap2單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；

本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是將所述雜交瘤細(xì)胞株分泌的鴨抗原轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白tap2單克隆抗體應(yīng)用于檢測(cè)在動(dòng)物組織或細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的tap2蛋白。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

本發(fā)明首先構(gòu)建表達(dá)tap2的原核表達(dá)質(zhì)粒pet-a2tap2pbd；采用iptg誘導(dǎo)pet-a2tap2pbd原核表達(dá)質(zhì)粒，菌體超聲破碎后，離心棄上清，沉淀用含尿素的結(jié)合緩沖液重懸，過鎳柱；用含有不同濃度的咪唑洗脫液洗脫目的蛋白，sds-page結(jié)果顯示主要在100mm咪唑濃度時(shí)，a2tap2pbd蛋白被洗脫下來。進(jìn)一步利用表達(dá)純化的重組a2tap2pbd蛋白免疫balb/c雌小鼠，將免疫脾細(xì)胞與sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，最初獲得6a、4f、3a、10d、9c、6f、10h、6h和7h共9孔陽性細(xì)胞孔。但經(jīng)過連續(xù)4次擴(kuò)大培養(yǎng)并檢測(cè)，結(jié)果表明，只有6a和4f的衍生細(xì)胞仍保持陽性，其它7株逐漸失去分泌特異性抗體的能力，且6a始終表現(xiàn)為強(qiáng)陽性，4f的eilsaod450值較低；因此，本發(fā)明保留6a進(jìn)一步作亞克隆化。經(jīng)過4次亞克隆，篩選獲得特異性抗體分泌最高的單克隆株，命名為1a6，進(jìn)一步制備了腹水。

本發(fā)明進(jìn)一步對(duì)16a進(jìn)行亞類鑒定，鑒定結(jié)果為：其單抗重鏈類型為igm，輕鏈為kappa鏈。

通過截短表達(dá)的方式，確定了1a6針對(duì)的tap蛋白表位：先后設(shè)計(jì)并合成兩對(duì)引物，鑒定1a6的表位，確定1a6針對(duì)的段肽的氨基酸序列為narhqmlqqavldatagtgmvaqeai。blast分析表明，與ncbi登錄的鴨tap蛋白序列同源性為96％(aaq62605.1)-88％(aaz30019.1)。

本發(fā)明將穩(wěn)定分泌鴨抗原轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白tap2抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞株1a6提交專利認(rèn)可的機(jī)構(gòu)進(jìn)行保藏，其微生物保藏編號(hào)為：cgmccno.12997；分類命名為：balb/c小鼠雜交瘤細(xì)胞。保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏時(shí)間是2016年10月26日；保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。

為了確證本發(fā)明制備的單克隆抗體1a6是否具有特異性生物學(xué)功能，本發(fā)明將鴨瘟強(qiáng)毒株感染雛鴨的大腸、腎臟、盲腸扁桃體和法氏囊組織，-20度凍存后制備冰凍切片。將1a6用pbs稀釋10倍，hrp標(biāo)記鼠igg為二抗，進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明，在腸粘膜、腎小球、法氏囊生發(fā)中心等部位，檢測(cè)到特異性很強(qiáng)的陽性信號(hào)，而在氣管、心臟和小腸組織，未檢測(cè)到特異性顯色，特異性顯色部位與鴨瘟主要引起消化道癥狀相符合，這是首次利用tap特異性單抗檢測(cè)到鴨瘟感染組織中tap蛋白的表達(dá)部位。

為了確證本發(fā)明制備的鴨tap蛋白特異性單抗是否能夠檢測(cè)到tap蛋白在亞細(xì)胞水平的表達(dá)，本發(fā)明采集3周齡商品化鴨瘟疫苗免疫后攻擊鴨腸炎病毒(dev)強(qiáng)毒株csc后的鴨大腸組織，2.5％戊二醛固定2h，用0.1mpbs漂洗3次，每次15min。再加入1％鋨酸4℃固定1-2h，用0.1mpbs漂洗3次，每次15min；用50％、70％、90％、100％丙酮逐級(jí)脫水。加入epon812樹脂，室溫浸透過夜。將樣品塊挑出放在包埋模具中80℃聚合48h，修塊、切片，切片、染色。冷凍電鏡檢測(cè)結(jié)果表明，在腸粘膜細(xì)胞的細(xì)胞核核膜上，可清晰看到特異性的標(biāo)記(圖6)，這說明利用本發(fā)明制備鴨tap蛋白特異性單抗能夠檢測(cè)到tap蛋白在亞細(xì)胞水平的表達(dá)。

附圖說明

圖1為a2tap2pbd原核表達(dá)蛋白純化sds-page結(jié)果；m:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.過鎳柱前；2流穿(1)；3.流穿(2)；4.流穿(3)；5.洗脫液；6.100mm(1)；7.100mm(2)；8.250mm(1)；9.250mm(2)；10.250mm(3)；11.250mm(4)；12.500mm(1)；13.500mm(2)；14.500mm(3)；15.800mm(1)；16.800mm(2)；17.1m(1)；18.1m(2)。

圖2鼠抗a2tap2pbd蛋白多克隆抗體的westernblot檢測(cè)結(jié)果；m：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：誘導(dǎo)前菌體蛋白；2：誘導(dǎo)后菌體蛋白；a為sds-page結(jié)果，b的一抗為鼠多抗血清，c的一抗為陰性鼠血清。

圖34f的westernblot檢測(cè)結(jié)果；m:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1:誘導(dǎo)前a2tap2pbd；2：誘導(dǎo)后a2tap2pbd。

圖41a6的westernblot檢測(cè)結(jié)果；m:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1:誘導(dǎo)前a2tap2pbd；2：誘導(dǎo)后a2tap2pbd。

圖5為1a6與鴨瘟感染雛鴨組織的免疫組織化學(xué)反應(yīng)性結(jié)果。

圖6為1a6與鴨腸粘膜細(xì)胞的冷凍電鏡檢測(cè)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1重組tap2蛋白的制備

1.鴨tap基因的擴(kuò)增與原核表達(dá)

提取hbk-spf鴨a2單倍型鴨脾臟總rna，反轉(zhuǎn)錄成cdna，作為pcr反應(yīng)模板，擴(kuò)增鴨a2tap2pbd基因片段?？寺∪朐吮磉_(dá)載體pet-30a載體，構(gòu)建成功pet-a2tap2pbd原核表達(dá)質(zhì)粒。

2.目的蛋白純化條件的優(yōu)化

iptg誘導(dǎo)pet-30aa2tap2pbd原核表達(dá)質(zhì)粒，菌體超聲破碎后，離心棄上清，沉淀用含尿素的結(jié)合緩沖液重懸，過鎳柱。用含有不同濃度的咪唑洗脫液洗脫目的蛋白，sds-page結(jié)果顯示主要在100mm咪唑濃度時(shí)，a2tap2pbd蛋白被洗脫下來，100mm(1)為第一次洗脫后洗脫液制樣，100mm(2)為第二次洗脫后洗脫制樣。在250mm(1)洗脫濃度時(shí)條帶也較明顯，但鑒于250mm(2)和250mm(3)隨著洗脫次數(shù)增大蛋白降低，所以250mm咪唑濃度不是最佳洗脫濃度。500、800和1000mm咪唑濃度時(shí)，只有少量蛋白被洗脫下來，因此，最終確定咪唑的最佳洗脫濃度為100mm。

實(shí)施例2鴨抗原轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白tap2單克隆抗體的制備及鑒定

1動(dòng)物免疫及細(xì)胞融合

取7周齡的balb/c雌性小鼠，用純化的a2tap2pbd蛋白進(jìn)行免疫，50μg/小鼠,腹腔注射。每隔2周免疫一次，第3次免疫后一周對(duì)免疫鼠斷尾采血，37℃放置1h，4℃離心10min分離血清。將血清倍比稀釋，用間接elisa檢測(cè)血清效價(jià)，選擇血清效價(jià)最高的小鼠于融合前3天加強(qiáng)免疫。

用純化后的a2tap2pbd蛋白免疫小鼠后獲得的陽性鼠多抗血清作為一抗，檢測(cè)純化前后的a2tap2pbd重組菌，在22kd位置出現(xiàn)目的條帶(圖2)。陰性鼠血清不能檢測(cè)出條帶。

2間接elisa方法的建立及陽性雜交瘤株的篩選

根據(jù)棋盤法，確定間接elisa的包被濃度為1.25ug/ml。a2tap2pbd蛋白用碳酸鹽緩沖液稀釋成10μg/ml，2倍倍比稀釋，6個(gè)稀釋度，每孔100μl分別包被酶標(biāo)板中，設(shè)置2個(gè)重復(fù)。封口膜密封后4℃包被過夜。pbst洗板3次，每次浸泡5min，拍干。用pbs配制5％的脫脂乳封閉酶標(biāo)板，250μl/孔，37℃作用3h封閉非結(jié)合位點(diǎn)，之后用pbst洗板3次，每次浸泡5min，拍干。從1：800的稀釋度開始，加入2×系列pbs稀釋后的血清，100μl/孔，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照和陰性對(duì)照，封口膜封閉后37℃作用1h，之后用pbst洗板3次，每次浸泡5min，拍干。加入1：8000稀釋的hrp標(biāo)記的山羊抗鼠igg，100μl/孔，封口膜封閉后37℃作用1h，之后用pbst洗板3次，每次浸泡5min，拍干。加入tmb基質(zhì)顯色液，75μl/孔，37℃，避光反應(yīng)3min，加入等體積的2m硫酸終止液，用酶標(biāo)儀測(cè)定od450nm的吸光值。

用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法判定陽性標(biāo)準(zhǔn)：(樣品孔o(hù)d450nm值－空白對(duì)照d450nm值)/(陰性對(duì)照孔o(hù)d450nm值－空白對(duì)照d450nm值)>2.1。

最初獲得6a、4f、3a、10d、9c、6f、10h、6h和7h共9孔陽性細(xì)胞孔。但經(jīng)過連續(xù)4次擴(kuò)大培養(yǎng)并檢測(cè)，結(jié)果表明，只有6a和4f的衍生細(xì)胞仍保持陽性，其它7株逐漸失去分泌特異性抗體的能力，且6a始終表現(xiàn)為強(qiáng)陽性，4f的eilsaod450值較低(表1)。

表16a和4f5次檢測(cè)的od值

分別利用6a和4f擴(kuò)大孔對(duì)a2tap2pbd重組菌進(jìn)行western-blot，結(jié)果表明，在相同稀釋倍數(shù)和反應(yīng)條件下，4f反應(yīng)較弱(圖3)，而6a能清晰檢測(cè)到與分子量符合的特異性條帶(圖4)。表明6a的結(jié)合力強(qiáng)于4f。保留6a，繼續(xù)做亞克隆化。經(jīng)過4次亞克隆，最終篩選獲得特異性抗體分泌最高的單克隆株，命名為1a6。進(jìn)一步制備了腹水。

31a6的亞類

根據(jù)rapidelisamousemabisotypingkit說明書對(duì)6a進(jìn)行亞類鑒定，結(jié)果為1a6單抗蛋白的重鏈亞類類型為igm，輕鏈為kappa鏈。

41a6表位鑒定

通過截短表達(dá)的方式，確定了1a6針對(duì)的tap蛋白表位。先后設(shè)計(jì)并合成兩對(duì)引物，鑒定1a6的表位，最終確定1a6針對(duì)的段肽的氨基酸序列為narhqmlqqavldatagtgmvaqeai。blast分析表明，與ncbi登錄的鴨tap蛋白序列同源性為96％(aaq62605.1)-88％(aaz30019.1)。

實(shí)驗(yàn)例11a6與鴨瘟感染雛鴨組織的免疫組織化學(xué)反應(yīng)性實(shí)驗(yàn)

將鴨瘟強(qiáng)毒株感染雛鴨的大腸、腎臟、盲腸扁桃體和法氏囊組織，-20度凍存后制備冰凍切片。將實(shí)施例制備的1a6用pbs稀釋10倍，hrp標(biāo)記鼠igg為二抗，進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。結(jié)果表明，在大腸的粘膜、腎小球、法氏囊的生發(fā)中心等部位，檢測(cè)到特異性很強(qiáng)的陽性信號(hào)，而在氣管、心臟和小腸組織，未檢測(cè)到特異性顯色(圖5)。特異性顯色部位與鴨瘟主要引起消化道癥狀相符合，表明1a6能特異地檢測(cè)鴨體內(nèi)表達(dá)的tap蛋白。

實(shí)驗(yàn)例21a6與鴨腸粘膜細(xì)胞的冷凍電鏡檢測(cè)結(jié)果

采集3周齡商品化鴨瘟疫苗免疫后攻擊鴨腸炎病毒(dev)強(qiáng)毒株csc后的鴨大腸組織，2.5％戊二醛固定2h，用0.1mpbs漂洗3次，每次15min。再加入1％鋨酸4℃固定1-2h，用0.1mpbs漂洗3次，每次15min；用50％、70％、90％、100％丙酮逐級(jí)脫水。加入epon812樹脂，室溫浸透過夜。將樣品塊挑出放在包埋模具中80℃聚合48h，修塊、切片，切片、染色。結(jié)果表明，在腸粘膜細(xì)胞的細(xì)胞核核膜上，可清晰看到特異性的標(biāo)記(圖6)。這是首次利用鴨tap蛋白特異性單抗檢測(cè)到tap蛋白在亞細(xì)胞水平的表達(dá)。