本發(fā)明屬于生物病毒構(gòu)建領(lǐng)域，具體涉及一種重組大鼠磷脂酶cγ2腺病毒、構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

肝臟是機(jī)體的重要器官，有外分泌、內(nèi)分泌、代謝、生物轉(zhuǎn)化等功能，參與糖、脂肪、維生素等營養(yǎng)物代謝、儲存和重新分配，對維持機(jī)體的代謝平衡有重要作用。肝臟還是機(jī)體的主要解毒器官，通過生物轉(zhuǎn)化和膽汁排泄等方式去除代謝廢物和外源物。由于肝臟有諸多重要生理功能，因此當(dāng)肝臟功能失調(diào)時就會產(chǎn)生各種肝病。相關(guān)的疾病達(dá)數(shù)百種之多，常見的有肝腫瘤、脂肪肝、肝纖維化、急性肝壞死、中毒性肝病等。我國每年因肝病死亡的人數(shù)超過50萬，每年治療肝病的費(fèi)用高達(dá)50-100億元人民幣。在各種肝病中，肝腫瘤有“癌癥之王”之稱，以高發(fā)病率和高死亡率威脅人類的健康，是各種肝病(脂肪肝、肝硬化、病毒性肝炎等)的終末期表現(xiàn)。

由于肝腫瘤發(fā)病前期病癥不明顯，致使其不能夠較早預(yù)防與治療，故肝臟腫瘤疾病的檢測、預(yù)防與治療一直是全球范圍的難點(diǎn)課題。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，新的治療方法不斷出現(xiàn)。其中基因治療由于其成本低、藥效高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，成為治療肝臟瘤的最佳途徑。具體說，基因治療藥物是具有治療作用的基因及其載體，可通過直接把含治療基因的載體注入患者體內(nèi)而根治疾病。因此，從生物學(xué)角度尋找治療肝腫瘤的新基因已成為新的研究方向。

磷脂酶cγ2屬于plcγ亞家族成員之一，廣泛存在于哺乳類各種細(xì)胞的漿膜中。它能被細(xì)胞外因子，細(xì)胞表面抗原、生長因子等激活后水解pip2產(chǎn)生ip3和dag。ip3促使胞內(nèi)ca²⁺釋放，誘發(fā)ca²⁺信號途徑；dag激活pkc，誘發(fā)下游信號通路，最后通過影響轉(zhuǎn)錄因子活性或引起基因表達(dá)扳動一系列生理生化活動。近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，plcγ2在細(xì)胞凋亡中起重要作用。然而，plcγ2是否能夠誘導(dǎo)肝腫瘤細(xì)胞的凋亡目前尚無報(bào)道。

腺病毒作為一種基因搭載體，其感染效率高，宿主細(xì)胞范圍廣，可感染分裂或非分裂細(xì)胞，且對宿主無致病性。與逆轉(zhuǎn)錄病毒等其他病毒載體不同，腺病毒載體不整合到宿主細(xì)胞染色體中，無插入致突變性，在一定時間內(nèi)能持續(xù)高表達(dá)導(dǎo)入的目的基因，腺病毒載體可承載較長外源基因片段，易通過體外擴(kuò)增獲得高的病毒滴度等特點(diǎn)，這使得它與其它轉(zhuǎn)基因載體相比具有獨(dú)特的優(yōu)勢，因而被廣泛用于靶向基因轉(zhuǎn)移等相關(guān)研究。

目前，肝癌的基因診斷和治療在臨床應(yīng)用仍存在著以下問題：1)反映肝癌生物學(xué)行為的目的基因特異性弱，需要尋找新的目的基因，以提高在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)陽性率；2)基因治療中引入體內(nèi)的外源基因不能在細(xì)胞內(nèi)長期穩(wěn)定表達(dá)，不能得到有效調(diào)控，需要尋找高效、安全和特異性好的基因治療載體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種重組大鼠磷脂酶cγ2腺病毒、構(gòu)建方法及其應(yīng)用，解決了現(xiàn)有肝癌的基因診斷和治療在臨床應(yīng)用中，目的基因特異性弱、在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)陽性率低，基因治療中引入體內(nèi)的外源基因不能在細(xì)胞內(nèi)長期穩(wěn)定表達(dá)，不能得到有效調(diào)控的問題。

本發(fā)明提供了一種重組大鼠磷脂酶cγ2腺病毒，通過將大鼠磷脂酶cγ2基因插入含有腺病毒基因組的腺病毒穿梭質(zhì)粒phbad-mcmv-gfp中獲得，所述大鼠磷脂酶cγ2基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。

本發(fā)明還提供了上述重組大鼠磷脂酶cγ2腺病毒的構(gòu)建方法，具體包括以下步驟：

步驟1，重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建

步驟1.1，采用無縫克隆技術(shù)將seqidno.1所示的大鼠磷脂酶cγ2基因插入puc57載體中，得到克隆載體puc57-plcγ2；

步驟1.2，以克隆載體puc57-plcγ2為模板，以forwardprimer和rewardprimer為引物，pcr擴(kuò)增，凝膠回收擴(kuò)增產(chǎn)物plcγ2，并利用smai將擴(kuò)增產(chǎn)物plcγ2酶切，凝膠回收得到plcγ2酶切產(chǎn)物；

所述forwardprimer的序列為：

5’-ctgcaggtcggatccagacccgggatgaccaccatggtcaacgtgga-3’，

rewardprimer的序列為：

5’-tctgtagaattcggtcccgggggagtagaacctgctgttactca-3’；

步驟1.3，以smai酶切腺病毒穿梭質(zhì)粒phbad-mcmv-gfp，對酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收和純化，得到mcmv酶切產(chǎn)物；

步驟1.4，利用dnat4連接酶將plcγ2酶切產(chǎn)物和mcmv酶切產(chǎn)物連接，得到重組穿梭質(zhì)粒phbad-mcmv-gfp-plcγ2；

步驟2，重組大鼠磷脂酶cγ2腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建

步驟2.1，將hek293細(xì)胞接種于含10％fbs的dmem完全培養(yǎng)液中，于5％co2、37℃環(huán)境中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70-80％時，將重組穿梭質(zhì)粒phbad-mcmv-gfp-plcγ2和腺病毒骨架載體phbad-bhg經(jīng)轉(zhuǎn)染試劑lipofitertm介導(dǎo)，共轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞，得到細(xì)胞混合物；

步驟2.2，將所述細(xì)胞混合物接種于含10％fbs的dmem完全培養(yǎng)液中，按“8”字形晃動，5％co2、37℃條件下培養(yǎng)，6h后更換新鮮的dmem完全培養(yǎng)液，觀察細(xì)胞出毒情況，當(dāng)細(xì)胞漸成葡萄狀并出現(xiàn)噬斑時，將從培養(yǎng)皿底部脫落的細(xì)胞收集至離心管中，離心管交替置于液氮和37℃水浴條件下進(jìn)行凍融，然后離心，收集上清毒液，即得到第一代毒種p1；

步驟2.3，用第一代毒種p1感染密度為90％的hek293細(xì)胞，收集第二代毒種p2；

步驟2.4，用第二代毒種p2感染密度為90％的hek293細(xì)胞，收集第三代毒種p3，所述第三代毒種p3即為重組大鼠磷脂酶cγ2腺病毒。

本發(fā)明還提供了上述重組大鼠磷脂酶cγ2腺病毒在抑制肝腫瘤細(xì)胞增殖中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了上述重組大鼠磷脂酶cγ2腺病毒在預(yù)防和治療肝腫瘤中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的一種重組大鼠磷脂酶cγ2腺病毒、構(gòu)建方法及其應(yīng)用，具有以下有益效果：

1、本發(fā)明針對plcγ2在癌細(xì)胞凋亡中的促進(jìn)作用，構(gòu)建plcγ2重組腺病毒以代替基因的模式，可以針對性對細(xì)胞生長情況進(jìn)行調(diào)控，本發(fā)明的重組大鼠磷脂酶cγ2腺病毒，對大鼠肝癌細(xì)胞凋亡中有著顯著促進(jìn)作用，為肝腫瘤的預(yù)防和治療提供新的治療思路。

2、本發(fā)明是利用缺陷型腺病毒將大鼠磷脂酶cγ2(plcγ2)基因引入大鼠肝癌細(xì)胞中，使病毒能在宿主細(xì)胞中自主表達(dá)磷脂酶cγ2，提高細(xì)胞中該酶的水平，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到預(yù)防和治療肝臟腫瘤的目的。另一方面，該方法還克服了外源蛋白不穩(wěn)定、活性低、成本高等缺點(diǎn)。

3、利用缺陷型腺病毒作為載體，具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)腺病毒載體工藝流程簡單，病毒滴度高；

(2)腺病毒載體轉(zhuǎn)染率高，可操作性好；

(3)腺病毒載體宿主范圍廣，安全性好，致病性弱；

(4)腺病毒載體免疫原性弱，外源基因表達(dá)穩(wěn)定；

(5)由mcmv啟動子控制的大鼠磷脂酶cγ2(plcγ2)能高效表達(dá)，可有效調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞增殖；

4、由于在真核細(xì)胞中自主目的蛋白，其產(chǎn)物與天然蛋白構(gòu)象與活性一致。

附圖說明

圖1是重組穿梭載體phbad-mcmv-gfp-plcγ2單克隆的pcr鑒定結(jié)果；

圖2是感染重組腺病毒后hek293細(xì)胞出毒情況；

其中，圖2a是感染重組腺病毒后hek293細(xì)胞后第一代毒種p1，圖2b是第二代毒種p2，圖2c是第三代毒種p3；

圖3是重組腺病毒對肝癌cbrh-7919細(xì)胞感染情況；

其中，圖3a是熒光下重組腺病毒組的顯微視圖，圖3b是熒光下空載腺病毒組的顯微視圖，圖3c是白光下重組腺病毒組的顯微視圖，圖3d為白光下空載腺病毒組的顯微視圖；

圖4是感染重組腺病毒后cbrh-7919細(xì)胞plcγ2蛋白表達(dá)情況的電泳圖；

圖5重組腺病毒對cbrh-7919細(xì)胞周期影響的流式細(xì)胞檢測情況；

其中，圖5a是對照組的pi的面積信號，圖5b是空載腺病毒組的pi的面積信號，圖5c是重組腺病毒組的pi的面積信號；

圖6是重組腺病毒促cbrh-7919細(xì)胞凋亡情況；

其中圖6a為對照組檢測結(jié)果，圖6b為空載腺病毒組檢測結(jié)果，圖6c為重組腺病毒組檢測結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受具體實(shí)施方式的限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件操作，由于不涉及發(fā)明點(diǎn)，故不對其步驟進(jìn)行詳細(xì)描述。

當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端點(diǎn)以及兩個端點(diǎn)之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。

下述實(shí)施例中puc57載體、腺病毒骨架載體phbad-bhg、腺病毒穿梭載體phbad-mcmv-gfp、無外源基因表達(dá)的空載野生型腺病毒以及hek293細(xì)胞購自上海漢恒生物科技有限公司。大鼠cbrh-7919肝癌細(xì)胞和大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞由河南師范大學(xué)省部共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈。轉(zhuǎn)染試劑lipofitertm購自上海漢恒生物科技有限公司；dmem、胎牛血清(fbs)、胰酶購自hyclone公司；青霉素、鏈霉素購自invitrogen公司；兔抗大鼠β-actin一抗和plcγ2一抗分別購自武漢博士德生物公司和abcam公司；hrp標(biāo)記山羊抗兔二抗igg購自上海康成生物公司；質(zhì)粒dna大、小量抽提試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；凝膠回收試劑盒為美國axygen公司生產(chǎn)；pi細(xì)胞周期流式檢測試劑盒和annexinv-apc/7-aad細(xì)胞凋亡檢測試劑盒均購自南京凱基生物。

本發(fā)明提供了一種用于抗肝腫瘤細(xì)胞增生的重組大鼠磷脂酶cγ2腺病毒，其是通過將大鼠磷脂酶cγ2基因插入含有腺病毒基因組的腺病毒穿梭質(zhì)粒phbad-mcmv-gfp中獲得，所述大鼠磷脂酶cγ2基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。具體按照以下步驟構(gòu)建：

步驟1，重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建

步驟1.1，采用gbclonart無縫克隆試劑盒(購自上海諾晶生物科技有限公司)的無縫克隆技術(shù)將seqidno.1所示的大鼠磷脂酶cγ2基因插入puc57載體中，得到克隆載體puc57-plcγ2。

其中seqidno.1所示的大鼠磷脂酶cγ2基因插入puc57載體時，不受酶切位點(diǎn)的限制。

步驟1.2，以克隆載體puc57-plcγ2為模板，以forwardprimer和rewardprimer為引物，利用表1所示的pcr體系pcr擴(kuò)增，凝膠回收擴(kuò)增產(chǎn)物plcγ2(擴(kuò)增產(chǎn)物plcγ2中含有plcγ2基因片段)，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物plcγ2按照表2所示的酶切體系、于30℃酶切反應(yīng)2h，酶切反應(yīng)后凝膠回收，得到plcγ2酶切產(chǎn)物。

表1plcγ2的pcr擴(kuò)增體系

pcr程序如下：

其中，forwardprimer的序列為：

5’-ctgcaggtcggatccagacccgggatgaccaccatggtcaacgtgga-3’，如seqidno.2所示；

rewardprimer的序列為：

5’-tctgtagaattcggtcccgggggagtagaacctgctgttactca-3’，如seqidno.3所示。

表2plcγ2擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切體系

步驟1.3，以smai酶切腺病毒穿梭質(zhì)粒phbad-mcmv-gfp，其酶切體系如表3所示，其酶切反應(yīng)條件為37℃反應(yīng)3h，凝膠回收純化酶切后的產(chǎn)物，得到mcmv酶切產(chǎn)物。

表3phbad-mcmv-gfp的酶切體系

步驟1.4，利用dnat4連接酶將產(chǎn)物plcγ2酶切產(chǎn)物和mcmv酶切產(chǎn)物連接，得到重組穿梭質(zhì)粒，連接體系如表4所示，連接反應(yīng)條件為：16℃下孵育過夜(12h以上)。

將所述重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中，37℃、250r/min搖菌14h，以培養(yǎng)得到的菌液為模板進(jìn)行菌液pcr和測序鑒定。測序正確的質(zhì)粒命名為重組穿梭質(zhì)粒phbad-mcmv-gfp-plcγ2。

重組穿梭載體phbad-mcmv-gfp-plcγ2單克隆的pcr鑒定結(jié)果如圖1所示，結(jié)果顯示，重組穿梭質(zhì)粒phbad-mcmv-gfp-plcγ2的片段大小接近5000bp，為3798bp，比腺病毒穿梭載體phbad-mcmv-gfp大300bp左右，對重組穿梭質(zhì)粒phbad-mcmv-gfp-plcγ2進(jìn)行測序鑒定，得到的plcγ2的核苷酸序列如seqidno.1所示，與ncbi數(shù)據(jù)庫公布的序列一致。

表4plcγ2酶切產(chǎn)物和mcmv酶切產(chǎn)物的連接體系

步驟2，重組大鼠磷脂酶cγ2腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建

步驟2.1，將hek293細(xì)胞接種于含10％fbs的dmem完全培養(yǎng)液中，于5％co2、37℃環(huán)境中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70-80％時，將重組穿梭質(zhì)粒phbad-mcmv-gfp-plcγ2和腺病毒骨架載體phbad-bhg經(jīng)轉(zhuǎn)染試劑lipofitertm介導(dǎo)共轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞，得到細(xì)胞混合物。

當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70-80％時，具體共轉(zhuǎn)染的步驟如下：

a.共轉(zhuǎn)染前2h更換新鮮的dmem完全培養(yǎng)液。取2μg重組穿梭質(zhì)粒phbad-mcmv-gfp-plcγ2和4μg腺病毒骨架載體phbad-bhg，用300μldmem完全培養(yǎng)液稀釋，室溫下放置5min，得到質(zhì)?；旌弦骸?/p>

b.取15μllipofitertm，用300μldmem完全培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，室溫放置5min，得到試劑溶液。

c.將細(xì)胞混合液和試劑溶液混合，室溫下避光孵育20min，得到細(xì)胞混合物。

步驟2.2，將所述細(xì)胞混合物接種于裝有含10％fbs的dmem完全培養(yǎng)液的60mm培養(yǎng)皿中，按“8”字形晃動，5％co2(體積分?jǐn)?shù))、37℃條件下培養(yǎng)，6h后更換新鮮的dmem完全培養(yǎng)液。觀察細(xì)胞出毒情況，當(dāng)細(xì)胞漸成葡萄狀并出現(xiàn)噬斑時(10天左右)，表明重組腺病毒包裝成功。將從培養(yǎng)皿底部脫落的細(xì)胞收集至離心管中，離心管交替置于液氮和37℃水浴條件下進(jìn)行凍融，其中，液氮和37℃分別放置3次，3000rpm室溫離心5min，收集上清毒液，即得到第一代毒種p1(參見圖2a)。

步驟2.3，用第一代毒種p1感染密度為90％的hek293細(xì)胞，收集第二代毒種p2，具體操作為：

取2ml第一代毒種p1感染密度至少為90％的hek293細(xì)胞，培養(yǎng)兩天后待染毒細(xì)胞脫落，將脫落的細(xì)胞置于新的離心管中，并將離心管交替置于液氮和37℃水浴條件下進(jìn)行凍融，其中液氮和37℃分別放置3次，3000rpm離心5min，收集上清毒液，收集第二代毒種p2(參見圖2b)。

步驟2.4，用第二代毒種p2感染密度為90％的hek293細(xì)胞，收集第三代毒種p3，具體操作為：

取2ml第二代毒種p2感染密度至少為90％的hek293細(xì)胞，培養(yǎng)兩天后待染毒細(xì)胞脫落，將脫落的細(xì)胞置于新的離心管中，并將離心管交替置于液氮和37℃水浴條件下進(jìn)行凍融，其中，液氮和37℃分別放置3次，3000rpm離心5min，收集上清毒液，獲得第三代毒種p3(參見圖2c)，所述第三代毒種p3即為重組大鼠磷脂酶cγ2腺病毒。

下面，我們通過一些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，來驗(yàn)證本發(fā)明重組大鼠磷脂酶cγ2腺病毒的效果：

一、滴度檢測

對上述方法制備而成的重組大鼠磷脂酶cγ2腺病毒的滴度進(jìn)行檢測，第三代毒種p3樣品滴度用改進(jìn)的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(50％tissuecultureinfectivedose，tcid50)法測定。對于100μl樣品，滴度的計(jì)算方法如下：t＝10^1+d(s-0.5)，其中d＝log10稀釋度＝1(對10倍稀釋度而言)，s＝陽性比率之和(自第一個10倍稀釋度算起)；再根據(jù)公式t＝a×10^btcid50/ml＝a×10^b-0.7pfu/ml，將tcid50/ml轉(zhuǎn)換成pfu/ml。注：兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到的滴度值相差應(yīng)<100.7

利用上述方法測得的重組大鼠磷脂酶cγ2腺病毒的滴度如表5所示，檢測總滴度＝1×10¹⁰pfu/ml，t＝10^{1+(10.2－0.5)}＝10^10.7tcid50/ml，將tcid50/ml換算成pfu/ml，t＝10^10.7－0.7＝10¹⁰＝1.0×10¹⁰pfu/ml，病毒滴度高。

表5病毒滴度稀釋結(jié)果

二、重組大鼠磷脂酶cγ2腺病毒的抗肝腫瘤細(xì)胞增殖的效果。

1、重組大鼠磷脂酶cγ2腺病毒對大鼠cbrh-7919肝癌細(xì)胞感染情況及過表達(dá)效率檢測

(1)熒光顯微鏡觀察感染情況

將大鼠cbrh-7919肝癌細(xì)胞放置于含10％(體積分?jǐn)?shù))fbs的dmem培養(yǎng)基，37℃、5％(體積分?jǐn)?shù))co2環(huán)境下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70-80％融合時，用胰酶消化并制成細(xì)胞懸液。以2×10^5個細(xì)胞/孔的密度接種至12孔板中，分別設(shè)計(jì)重組腺病毒組、空載腺病毒組和空白對照組3個組，每組3個重復(fù)孔。重組腺病毒組滴加感染復(fù)數(shù)(multiplicityofinfection，moi)為400的重組大鼠磷脂酶cγ2腺病毒，空載腺病毒組滴加感染復(fù)數(shù)(multiplicityofinfection，moi)為400的腺病毒穿梭載體phbad-mcmv-gfp，空白對照組則無病毒感染，在dmem完全培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后熒光顯微鏡觀察感染效果并拍照。

結(jié)果如圖3所示，圖3a為熒光下重組腺病毒組的顯微視圖，圖3b為熒光下空載腺病毒組的顯微視圖，圖3c為白光下重組腺病毒組的顯微視圖，圖3d為白光下空載腺病毒組的顯微視圖，結(jié)果表明，重組腺病毒組較其他兩組的熒光強(qiáng)度更強(qiáng)，轉(zhuǎn)染效果明顯。

(2)熒光實(shí)時定量pcr(qrt-pcr)檢測過表達(dá)效率

按密度1×10⁵細(xì)胞/孔接種cbrh-7919細(xì)胞至12孔板中，分別設(shè)計(jì)重組腺病毒組、空載腺病毒組和空白對照組3個組，每組3個重復(fù)孔。重組腺病毒組滴加感染復(fù)數(shù)(multiplicityofinfection，moi)為400的重組大鼠磷脂酶cγ2腺病毒，空載腺病毒組滴加感染復(fù)數(shù)(multiplicityofinfection，moi)為400的腺病毒穿梭載體phbad-mcmv-gfp，空白對照組則無病毒感染，于含10％(體積分?jǐn)?shù))fbs的dmem完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞，按invitrogen公司的trizol試劑盒提取總rna，在260/280nm波長下測定總rna濃度。實(shí)驗(yàn)用rna質(zhì)量濃度均為1μg/l。取5μg總rna，按rna反轉(zhuǎn)錄試劑盒指南合成cdna。取合成的cdna2μl、sybrgreenimix10μl、5’端和3’端引物各0.2μl、無核酸酶純水7.6μl，形成20μl體系，置rotorgene3000pcr儀中(corbettresearch公司，australia)進(jìn)行pcr。pcr反應(yīng)條件如下：95℃1min，95℃15s，相應(yīng)的退火溫度下反應(yīng)15s，72℃30s，45個循環(huán)。其中，目的基因rplcγ2和內(nèi)參基因gapdh的引物序列用primerexpress2.0軟件，根據(jù)基因序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，由上?；瞪锕竞铣桑蛄腥缦隆?/p>

重組腺病毒組細(xì)胞pcr擴(kuò)增使用的引物為：

5’端引物：5’-ctggcaaccgactcaaagga-3’

3’端引物：5’-gctgatgctgtttcttcggg-3’

空載腺病毒組cpr擴(kuò)增使用的引物為：

5’端引物：5’-ttcctacccccaatgtgtcc-3’

3’端引物：5’-ggtcctcagtgtagcccaag-3’

最后，以本領(lǐng)域常用的gapdh(即甘油醛-3-磷酸脫氫酶，glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)為內(nèi)參基因，根據(jù)公式：相對含量＝2-^δδct計(jì)算plcγ2表達(dá)量，通過pcr擴(kuò)增循環(huán)數(shù)及熒光信號強(qiáng)度對結(jié)果進(jìn)行分析。

用real-timeqpcr方法檢測cbrh-7919細(xì)胞中plcγ2mrna表達(dá)量，結(jié)果如表6所示，相比空白對照組和重組腺病毒組，重組腺病毒組中plcγ2mrna表達(dá)豐度至少增加16000倍之多，說明經(jīng)腺病毒載體介導(dǎo)后cbrh-7919細(xì)胞可高表達(dá)plcγ2基因。

表6qrt-pcr檢測感染重組腺病毒后cbrh-7919細(xì)胞plcγ2mrna水平

注：ct指的是在pcr擴(kuò)增時，每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)

(3)westernblot檢測過表達(dá)效率

設(shè)計(jì)重組腺病毒組、空載腺病毒組和空白對照組，每組3個重復(fù)孔，重組腺病毒組滴加感染復(fù)數(shù)(multiplicityofinfection，moi)為400的重組大鼠磷脂酶cγ2腺病毒，空載腺病毒組滴加感染復(fù)數(shù)(multiplicityofinfection，moi)為400的腺病毒穿梭載體phbad-mcmv-gfp，空白對照組則無病毒感染，培養(yǎng)36h后，棄掉培養(yǎng)基，用pbsbuffer清洗cbrh-7919細(xì)胞3次，并收集各組細(xì)胞至離心管內(nèi)。向各離心管加入含0.1mmol/lpmsf的ripa裂解液(1％tritonx-100、50mmol/ltris·hclph8.0、150mmol/lnacl、0.5％sds)，吹打均勻后4℃靜置20min；超聲波破碎10s后，冰置30min。12000g離心2次，10min/次，棄沉淀，留上清。取5μl上清液用bca方法測定蛋白濃度，結(jié)果確定上樣量為60μg。將蛋白樣品進(jìn)行6％sds-page凝膠電泳，結(jié)束后將凝膠電轉(zhuǎn)移(4℃，70v，2.5h)至pvdf膜上，電轉(zhuǎn)后將膜放入5％(即5g/l)脫脂奶粉中室溫輕搖封閉2h，加兔抗大鼠plcγ2一抗的稀釋液(體積稀釋100倍)，4℃孵育過夜，tbst洗膜3次，10min/次；加入hrp標(biāo)記山羊抗兔二抗igg的稀釋液(體積稀釋5000倍)室溫振蕩孵育1h，tbst洗膜3次，10min/次。經(jīng)ecl發(fā)光試劑盒顯色后，用x-膠片曝光顯影并拍照分析。

同時，為確保每組樣品中蛋白總量的一致，本研究選用兔抗大鼠β-actin一抗做內(nèi)標(biāo)，將不同組的蛋白質(zhì)總量調(diào)整至相同，操作步驟同上。

本研究用免疫印跡方法檢測重組腺病毒感染后cbrh-7919細(xì)胞中plcγ2蛋白表達(dá)量，結(jié)果如圖4所示，圖4中，1號泳道為空白對照組，2號泳道為空載腺病毒組，3號泳道為重組腺病毒組?？瞻讓φ战M和空載腺病毒組細(xì)胞中幾乎無plcγ2蛋白的表達(dá)，而重組腺病毒組感染細(xì)胞后該蛋白表達(dá)水平明顯增加，說明被重組腺病毒轉(zhuǎn)染的cbrh-7919細(xì)胞能高表達(dá)plcγ2蛋白(圖4)。

三、重組大鼠磷脂酶cγ2腺病毒對cbrh-7919細(xì)胞生長的影響

(1)pi單染流式檢測細(xì)胞周期

取處于對數(shù)生長期，生長狀態(tài)良好的cbrh-7919細(xì)胞，以每孔2×10⁵個細(xì)胞的密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)6孔板中，37℃、5％(v/v)co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。吸棄6孔板內(nèi)的含10％fbs、1％雙抗(青霉素-鏈霉素混合溶液)的dmem完全培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基終體積為1ml，然后分別加入重組大鼠磷脂酶cγ2腺病毒和空載腺病毒。侵染6h后，將培養(yǎng)基補(bǔ)足至2ml。繼續(xù)培養(yǎng)48h。用不含edta的0.25％胰酶消化細(xì)胞，消化終止后收集細(xì)胞，1000rpm、離心5min，去上清，pbs重懸潤洗2次。去上清(1000rpm，5min)后用pbs重懸細(xì)胞，緩慢加入預(yù)冷的80％乙醇，4℃固定4h后棄離心上清(1000rpm，5min)，用預(yù)冷pbs洗2次。加入100μlrnase，37℃水浴30min；再加入400μlpi染液，4℃避光反應(yīng)30min。最后用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的細(xì)胞周期。以無病毒感染的cbrh-7919細(xì)胞為對照組。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

細(xì)胞周期的流式細(xì)胞檢測結(jié)果如圖5顯示，圖5a是對照組的細(xì)胞周期的流式細(xì)胞檢測結(jié)果的pi的面積信號，圖5b是空載腺病毒組的細(xì)胞周期的流式細(xì)胞檢測結(jié)果的pi的面積信號，圖5c是重組腺病毒組的細(xì)胞周期的流式細(xì)胞檢測結(jié)果的pi的面積信號。

轉(zhuǎn)染24h后，對照組cbrh-7919細(xì)胞在g1期、s期和g2/m期含量分別為64.26％、21.17％和14.57％(參見圖5a)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，空載腺病毒組細(xì)胞在g1期、s期和g2/m期含量無明顯變化，分別為64.47％、24.18％和11.36％(參見圖5b)。與對照組和空載腺病毒組相比，重組腺病毒組細(xì)胞在g1期的比例極顯著增加(p＜0.01)，為71.88％；而s期和g2/m期細(xì)胞含量則顯著降低(p<0.01)，分別降至10.01％和18.1％(參見圖5c)。結(jié)果表明，重組腺病毒中含有的大鼠plcγ2基因可使cbrh-7919細(xì)胞周期阻滯在g1期。

(2)annexinv-apc/7-aad雙染流式檢測細(xì)胞凋亡

取處于對數(shù)生長期，生長狀態(tài)良好的cbrh-7919細(xì)胞，以每孔2×10⁵個細(xì)胞的密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)6孔板中，37℃、5％(v/v)co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。吸棄6孔板內(nèi)的培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基終體積為1ml，然后分別加入重組腺病毒和空載腺病毒。侵染6h后，將培養(yǎng)基補(bǔ)足至2ml。繼續(xù)培養(yǎng)48h。用不含edta的0.25％胰酶消化細(xì)胞，消化終止后收集細(xì)胞，1000rpm、離心5min，去上清，pbs重懸潤洗2次，收集細(xì)胞沉淀。

將細(xì)胞沉淀重懸于50μlbindingbuffer中，加入5μl7-aad染液，混勻，室溫下避光反應(yīng)15min。反應(yīng)后加入450μlbindingbuffer，再加入1μlannexinv-apc，混勻，室溫下避光反應(yīng)15min。最后，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測各組細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞檢測結(jié)果如圖6所示，其中圖6a為對照組檢測結(jié)果，圖6b為空載腺病毒組檢測結(jié)果，圖6c為重組腺病毒組檢測結(jié)果，圖6a、6b、6c中與縱軸平行的線為界限，左側(cè)為annexinv-apc(即熒光素apc標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白v)陰性，線右側(cè)為annexinv-apc陽性，左下象限(ll)為annexinv、7-aad雙陰性，代表正?；罴?xì)胞；右下象限(lr)為annexinv單陽性，代表早期凋亡細(xì)胞；右上(ur)象限為annexinv、7-aad雙陽性，代表晚期凋亡細(xì)胞。

轉(zhuǎn)染24h后，對照組、空載腺病毒組和重組腺病毒組細(xì)胞凋亡率分別為0.56％、0.84％和22.62％。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，重組腺病毒組細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組和空載腺病毒組(p＜0.01)，而對照組與空載腺病毒組之間的凋亡率無顯著差異(p>0.05)。說明過表達(dá)重組腺病毒ad-plcγ2能顯著促進(jìn)肝腫瘤細(xì)胞凋亡。

盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對這些實(shí)施例作出另外的變更和修改。所以，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實(shí)施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。

顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明進(jìn)行各種改動和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動和變型在內(nèi)。

序列表

<110>河南科技大學(xué)

<120>一種重組大鼠磷脂酶cγ2腺病毒、構(gòu)建方法及其應(yīng)用

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>3798

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

atgaccaccatggtcaacgtggacacccttccagaatatgagaagagtcagatcaagaga60

gccctggagctagggacggtgatgaccgtattcagtgcccgcaaatccaccccagagcgg120

aggacagtacagatgatcatggagacccggcaggtggcatggagcaagacagcagataag180

atcgaaggcttcttggacatcatggaaataaaggaaatccggccagggaagaactccaag240

gactttgagcgagccaaggctgtccgtcacaaggcagactgctgcttcaccatcttctac300

ggcacccagttcgtgctcagcactctcagtctggcaaccgactcaaaggaggatgcagtg360

aagtggctctctggcttgaagatcttacaccaggaagcgatgaacgcatccactcccaca420

atgattgagagttggctgcggaaacagatttattcagtagatcaaacccgaagaaacagc480

atcagcctccgggagctgaagaccatcttgcccctggtcaacttcaaagtgagcggcatc540

aagttcctcaaggacaagctggtggaaattggcgcccagaaagatgagctcagttttgaa600

cagttccatctcttctataaaaaactcatgtttgagcagcagaagtcgatacttgacgaa660

ttcaaaaaagactcctccgtgttcatcctagggaacacagaccggcctgatgcctcagcc720

gtctacctgcaagacttccagaggtttcttttacatgaacagcaggagctatgggctcag780

gatctgaacaaagtccgggagcggatgaccaagtttatcgatgacacaatgagggagacc840

gcagagcccttcttgtttgtggatgagttcctcacgtatctgttctcacgggagaacagc900

atctgggacgagaagtacgatgccgtggacatgcaggacatgaacaaccccttgtcccat960

tactggatctcctcttcccacaacacgtacctcactggagaccagctgcgtagcgagtcc1020

tccacggaagcgtatatccgctgtctgcgtgctggttgtcgctgcatcgagttggattgc1080

tgggatgggcctgacgggaaacccataatctatcacggttggacacggaccaccaagatc1140

aagtttgatgatgttgttcaggccatccgggatcatgcctttgttacctccagctttccc1200

gtgattctgtctatcgaggagcactgcagtgtggagcagcaacgtcacatggccaaggtc1260

ttcaaggaagtgttaggagacctgctgttgacgaagcccacggaggccagtgctgaccag1320

ctgccctcacccagccagcttcgtgagaagatcattatcaagcataagaagctgggcccc1380

cgaggtgatgtcgatgtcaatgtggaggacaagaaagatgagcacaagacccagggcgag1440

ctgtatatgtgggactccatcgaccagaaatggactcgccactactgtgctattgcggac1500

gccaagctgtccttcagtgacgacattgaacagactgtggaagaggatccggtccaggac1560

actccccccacggagctacattttggggagaaatggttccataagaaggtggagagcagg1620

accagtgcggagaagctgctgcaggagtactgtgccgagactggggccaaggatggcacc1680

ttcctggtgcgggagagcgagaccttccccaacgactacacactctccttctggcggtct1740

ggccgggtgcagcactgccgaatccggtctaccatggagggtggggtcatgaagtactac1800

ctgactgacaacctcacgttcaacagcatctacgccctcatccagcactaccgggaggca1860

cacctgcgctgtgcggagttcgagctgcggctcacagacccggtgcccaaccccaaccca1920

catgagtccaagccgtggtactatgacaggctgagcaggggggaagcagaggacatgttg1980

atgcggattccccgagatggagccttcctcattcggaagcgggaggggaccgactcttac2040

gccatcaccttcagggccaggggcaaggtgaaacattgccgtatcaaccgggacggacgt2100

cactttgtgctggggacctctgcctactttgagagcctggtggagctcgtcagctactat2160

gagaagcacgcactctaccgcaagatgaggcttcgctaccccgtgaccccggagctcctg2220

gaacgatataatatggaaagagacatcaactctctctatgacgtcagcaggatgtatgtg2280

gacccaagtgagatcaacccttccatgcctcagaggactgtgaaagcactctatgactac2340

aaagccaagcgcagcgatgagctgaccttctgccgaggtgccctcatccacaacgtctcc2400

aaggagccgggaggatggtggaaaggggactatgggacccggatccagcagtatttccca2460

tctaactacgttgaagatatctcggcaggcgatgctgaggagatggaaaagcagattatt2520

gaagacaaccccctcgggtctctctgcagaggcatattggatcttaatacctacaatgtg2580

gtgaaggccccccaggggaaaaaccagaaagccttcgtctttatcctggagcctaagaaa2640

cagggggaccctcctgtggagttcgcgactgaccgtgtggaggaactgtttgagtggttt2700

cagagtatacgagagatcacttggaagatcgacaccaaggagaacaacatgaagtactgg2760

gagaggaatcagtccattgctattgagctctctgacttggttgtgtactgcaagccgact2820

agcaaaaccaaggaccatttggaaaatcctgacttccgggaaattcgctcttttgtggag2880

acaaaggcagacagcattgtcaggcaaaagcccgtggatctattgcggtacaaccagaag2940

ggcctgacccgtgtctaccccaagggacagagagttgactcttccaactacgaccccttc3000

cgtctgtggctgtgtggctcccagatggtggcgctcaatttccagactccagacaagtac3060

atgcagatgaaccatgcattgttttcgctcaatgggcggacaggttacgtcctgcagccc3120

gagagcatgcggtctgagaagtatgacccgatgcccccggagtcccagaggaagatcctg3180

atgacactcactgtcaaggttcttggtgcacgccacctccctaaactagggcggagtatc3240

gcctgtccctttgtagaggtggaaatctgtggggccgagtatgacagcaacaaattcaag3300

acgacggttgtgaatgacaacggtctcagccctgtctgggctccaactcaggagaaggtg3360

acatttgaaatttatgacccaaaccttgcgttcctacgctttctggtctacgaagaagac3420

atgttcagtgaccccaacttcctggctcatgccacataccccattaaaggcatcaaatca3480

ggatttagatcagtccctctgaagaacgggtacagtgaagacatcgagctggcatccctc3540

ctggttttctgtgagatgcggccagtcctggagagtgaagaagaactctattcctcctgt3600

cgccagctgcggaggcggcaggaagagctcaacaaccagctcttcctgtatgacacacac3660

cagaacctgcgaggagccaaccgggatgccctggtgaaggagttcaatgttaacgagaat3720

cagctgcggctgtaccaggagaagtgtaaccggaggctgagagagaagagagtgagtaac3780

agcaggttctactcctag3798

<210>2

<211>47

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

ctgcaggtcggatccagacccgggatgaccaccatggtcaacgtgga47

<210>3

<211>44

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

tctgtagaattcggtcccgggggagtagaacctgctgttactca44