本發(fā)明涉及藥物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是苯并吲唑類衍生物(tcd-1)的前藥及其制備方法、應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腫瘤，特別是惡性腫瘤，已嚴(yán)重威脅人類的健康。世界衛(wèi)生組織(who)的發(fā)布的《全球癌癥報(bào)告2014》顯示，非洲、亞洲和中南美洲的發(fā)展中國家癌癥發(fā)病形勢最為嚴(yán)峻。2012年全世界共新增1400萬癌癥病例并有820萬人死亡。其中，中國新增307萬癌癥患者并造成約220萬人死亡，分別占全球總量的21.9％和26.8％。該報(bào)告預(yù)測全球癌癥病例將呈現(xiàn)迅猛增長態(tài)勢，由2012年的1400萬人，逐年遞增至2025年的1900萬人，到2035年將達(dá)到2400萬人。盡管抗腫瘤藥物為延長患者的生存時(shí)間以及改善其生命質(zhì)量做出了很大貢獻(xiàn)，但大多數(shù)藥物均為細(xì)胞毒藥物，其缺乏選擇性會傷害大量的正常細(xì)胞，并且容易出現(xiàn)耐藥性，所以，腫瘤血管靶向藥物成為了研究熱點(diǎn)。

微管由微管蛋白和微管結(jié)合蛋白構(gòu)成，是構(gòu)成細(xì)胞骨架的主要成分。微管有聚合和解聚的動(dòng)力學(xué)特性，在保持細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞的分裂增殖、細(xì)胞器的組成與運(yùn)輸及信號物質(zhì)的傳導(dǎo)方面發(fā)揮重要作用。以微管為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物就是利用其動(dòng)力學(xué)特性，或促進(jìn)其解聚或抑制其聚合，從而達(dá)到直接影響細(xì)胞的有絲分裂，影響細(xì)胞的諸多正常生理功能，使細(xì)胞分裂停止于m期。研究表明微管存在3個(gè)不同的藥物結(jié)合位點(diǎn)：紫杉醇位點(diǎn)、長春新堿位點(diǎn)和秋水仙堿位點(diǎn)。由于秋水仙堿位點(diǎn)空腔體積較小且相應(yīng)抑制劑的結(jié)構(gòu)較為簡單，因而近年來關(guān)于其抑制劑的研究也備受關(guān)注。

該位點(diǎn)最初發(fā)現(xiàn)的抑制劑秋水仙堿治療窗較窄，限制了其臨床應(yīng)用。而二苯乙烯類天然產(chǎn)物抑制劑combretastatins的發(fā)現(xiàn)引起了研究者的極大關(guān)注，代表化合物combretastatina-4(ca-4)，表現(xiàn)出很高的微管聚合抑制作用和抗腫瘤活性，還表現(xiàn)出腫瘤血管阻斷作用。研究者對ca-4進(jìn)行了大量的結(jié)構(gòu)改造，目前有多個(gè)類似物進(jìn)入臨床研究，顯示出良好的發(fā)展前景。其中ca-4p在2013年7月歐洲藥品管理局授予其治療卵巢癌的孤兒藥地位，目前ca-4p在未分化甲狀腺癌、神經(jīng)內(nèi)分泌瘤和卵巢癌上開展了臨床研究。

中國專利申請201510740269.8，申請日為2015年11月4日，公開日晚于本發(fā)明專利申請的申請日，涉及到一種苯并吲唑類衍生物，其中包括化合物tcd-1。但是關(guān)于本發(fā)明的苯并吲唑類衍生物(tcd-1)的前藥及其制備方法、應(yīng)用目前還未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種苯并吲唑類衍生物(tcd-1)的前藥。

本發(fā)明的再一的目的是，提供一種苯并吲唑類衍生物(tcd-1)的前藥的制備方法。

本發(fā)明的另一的目的是，提供一種苯并吲唑類衍生物(tcd-1)的前藥的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：式(i)所示的化合物，

其中，r選自氨基酸、糖類和其他帶堿性基團(tuán)的基團(tuán)。

所述的堿性基團(tuán)為氨基。

所述的化合物的結(jié)構(gòu)式為：

所述的化合物的藥學(xué)上可接受的鹽。

所述的鹽為鹽酸鹽。

所述的鹽的結(jié)構(gòu)式為：

為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：

合成路線為：

為實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：在制備微管蛋白聚合抑制劑中的應(yīng)用。

在制備治療腫瘤疾病的藥物中的應(yīng)用。

所述的腫瘤疾病為白血病、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、黑色素瘤、卵巢癌、腎癌、前列腺癌或乳腺癌。

本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：

1、本發(fā)明的苯并吲唑衍生物前藥及其鹽結(jié)構(gòu)解決了之前專利中化合物水溶性極差的問題，可用于靜脈注射使用。

2、本發(fā)明的苯并吲唑類衍生物前藥可抑制微管蛋白聚合，對白血病、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、黑色素瘤、卵巢癌、腎癌、前列腺癌以及乳腺癌等具備抗腫瘤活性。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式作詳細(xì)說明。

本發(fā)明的化合物的具體合成路線如下：

試劑和條件：(a)boc-l-絲氨酸，丙基磷酸酐(t3p)，三乙胺，無水二氯甲烷，回流；(b)鹽酸甲醇溶液，甲醇。

實(shí)施例1：(s)-3-羥基-2-((叔丁氧羰基)氨基)-n-(2-甲氧基-5-(6,7,8-三甲氧基-4,5-二氫-2h-苯并[e]吲唑-1-位)苯基)丙酰胺(tcd-1-pb)

將原料6,7,8-三甲氧基-1-(3-氨基-4-甲氧基苯基)-2-苯基-4,5-二氫-2h-苯并[e]吲唑(tcd-1)(10mmol,1.0equiv)和boc-l-絲氨酸(12mmol,1.2equiv)溶入100ml無水二氯甲烷中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，加入三乙胺(27mmol，2.7equiv)。隨后冰浴條件下緩慢加入丙基磷酸酐(t3p)(17mmol,1.7equiv)，攪拌10分鐘。隨后升溫至回流攪拌6小時(shí)，tlc監(jiān)測。反應(yīng)完畢后冷卻至室溫，加入100ml水。攪拌5分鐘后倒出，分層，有機(jī)相用水和飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮后用硅膠柱層析純化(二氯甲烷/甲醇洗脫)得產(chǎn)物為白色固體，產(chǎn)率39％。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.08(s,1h),8.56(s,1h),7.34(dd,j＝8.5,2.0hz,1h),6.82(d,j＝8.3hz,1h),6.75(s,1h),6.01(d,j＝7.6hz,1h),4.38(s,1h),4.30(dd,j＝11.5,2.6hz,1h),3.86(s,3h),3.85(s,3h),3.83(s,2h),3.75(dd,j＝11.9,4.6hz,1h),3.52(s,3h),2.95(t,j＝7.1hz,2h),2.78(t,j＝7.3hz,2h),1.49(s,9h)。esi-msm/z＝569.3[m+1]⁺。

實(shí)施例2：(s)-3-羥基-2-氨基-n-(2-甲氧基-5-(6,7,8-三甲氧基-4,5-二氫-2h-苯并[e]吲唑-1-位)苯基)丙酰胺鹽酸鹽(tcd-1-ph)

將原料(s)-3-羥基-2-((叔丁氧羰基)氨基)-n-(2-甲氧基-5-(6,7,8-三甲氧基-4,5-二氫-2h-苯并[e]吲唑-1-位)苯基)丙酰胺(tcd-1-pb)(1.7g,3mmol)溶于30ml甲醇中，冰浴下，滴加鹽酸甲醇溶液(2.5m,40ml)，隨后室溫下攪拌過夜。反應(yīng)完畢后減壓除去大部分溶液，倒入50ml冰水中，用飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)ph至中性，有白色絮狀物析出。過濾得游離堿，將游離堿干燥后溶于無水二氯甲烷中(40ml)，緩慢滴加4m鹽酸，有白色固體析出。肉眼觀察加入鹽酸無明顯固體析出現(xiàn)象時(shí)，停止滴加。過濾得米白色產(chǎn)物，產(chǎn)率72％。¹hnmr(400mhz,dmso)δ9.92(s,1h),8.35(s,1h),8.34(s,1h),8.28(d,j＝1.6hz,1h),7.36(d,j＝8.4hz,1h),7.23(d,j＝8.5hz,1h),6.70(s,1h),6.17(s,1h),4.23(dd,j＝9.7,5.0hz,1h),3.91(s,3h),3.82(d,j＝4.6hz,2h),3.75(s,3h),3.71(s,3h),3.45(s,3h),2.89(t,j＝7.0hz,2h),2.74(t,j＝6.9hz,2h).esi-msm/z＝469.3[m+1]⁺。

實(shí)施例3:原藥tcd-1和前藥鹽酸鹽tcd-1-ph溶解度的測定

采用hplc方法來測試樣品溶解度。通過準(zhǔn)確稱量適量樣品，逐步加入生理鹽水，在振蕩器振搖至充分溶解，并通過hplc進(jìn)行檢測，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后采用類似方法配置樣品飽和溶液，采用hplc方法進(jìn)行測試。結(jié)果表明化合物tcd-1在生理鹽水中的溶解度遠(yuǎn)小于0.001g/ml，而前藥鹽酸鹽tcd-1-ph的溶解度大于0.945g/ml，與原藥相比提高超過945倍。

實(shí)施例4:前藥鹽酸鹽tcd-1-ph體內(nèi)活性測試

選用移植于裸鼠的人體腸癌colo205模型評價(jià)樣品的抗腫瘤作用。樣品20mg/kg尾靜脈注射4次，每4天給藥1次。與對照組相比，樣品對人體腸癌colo205裸鼠移植瘤的抑瘤率>50％，具有明顯的抗腫瘤活性。實(shí)驗(yàn)組裸鼠體重與對照組相比差異不明顯，樣品沒有顯示明顯的毒性。

實(shí)施例5：相關(guān)化合物的合成方法及活性實(shí)驗(yàn)

原料6,7,8-三甲氧基-1-(3-氨基-4-甲氧基苯基)-2-苯基-4,5-二氫-2h-苯并[e]吲唑(tcd-1)的合成參見專利《苯并吲唑類衍生物及其制備方法、應(yīng)用》(申請?zhí)?01510740269.8)。

原料6-甲氧基-3,4-二氫萘-2(1h)-酮(1)的合成參見文獻(xiàn)jmedchem2012,55,5720-5733.。

原料5,6,7-三甲氧基-3,4-二氫萘-2-酮(2)的合成參見專利《取代苯亞甲基四氫萘酮類衍生物及制備方法、應(yīng)用》(申請?zhí)枺?01510064131.0)。

6-甲氧基-1-(3,4,5-三甲氧基苯基)-3,4-二氫萘-2(1h)-酮(s-dk)

將原料6-甲氧基-3,4-二氫萘-2(1h)-酮(1)(5.68mmol，1.0equiv)溶入20ml無水thf中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，加冰鹽浴，緩慢滴加lda(6.24mmol，1.1equiv)，攪拌4小時(shí)后加入3,4,5-三甲氧基苯甲酰氯的thf溶液(6.24mmol，1.1equiv)，緩慢升至室溫?cái)嚢?，tlc監(jiān)測。反應(yīng)完畢后冰浴下加入飽和氯化銨水溶液淬滅。反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取(2×100ml)，合并有機(jī)相，用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮后用硅膠柱層析純化(乙酸乙酯/石油醚洗脫)得產(chǎn)物為黃色固體，產(chǎn)率61％。¹hnmr(600mhz,cdcl3)δ6.77(s,2h),6.72(d,j＝2.3hz,1h),6.66(d,j＝8.6hz,1h),6.47(dd,j＝8.6,2.5hz,1h),3.92(d,j＝6.2hz,1h),3.88(s,3h),3.75(s,3h),3.69(s,6h),2.93(t,j＝6.8hz,2h),2.68–2.52(m,2h).hrms(es+)m/zfound371.1486(m+h⁺)；c21h23o6(m+h⁺)requires371.1489.

7-甲氧基-1-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4,5-二氫-2h-苯并[e]吲唑(sc1)

在100ml燒瓶中依次加入乙醇、中間體s-dk和等當(dāng)量的水合肼，攪拌過夜，濃縮后分離純化得sc1為白色固體。熔點(diǎn)172–173℃，¹hnmr(600mhz,cdcl3)δ7.35(d,j＝8.5hz,1h),6.84(s,2h),6.82(d,j＝2.5hz,1h),6.64(dd,j＝8.5,2.7hz,1h),3.92(s,3h),3.83(s,6h),3.79(s,3h),2.99(t,j＝7.2hz,2h),2.83(t,j＝7.2hz,2h)，¹³cnmr(150mhz,cdcl3)δ157.92,153.57,148.74,140.29,138.47,136.92,126.69,124.28,123.15,114.38,113.61,111.66,105.49,61.01,56.28,55.28,30.46,21.81.hrms(es+)m/zfound367.1653(m+h⁺)；c21h23n2o4(m+h⁺)requires367.1652.

7-甲氧基-2-甲基-1-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4,5-二氫-2h-苯并[e]吲唑(sc2)

參照sc1的合成，將中間體s-dk和甲基肼反應(yīng)得sc2為白色固體。熔點(diǎn)157–158℃，¹hnmr(600mhz,cdcl3)δ7.33(d,j＝8.5hz,1h),6.89(s,2h),6.81(d,j＝2.4hz,1h),6.55(dd,j＝8.5,2.6hz,1h),3.95(s,3h),3.90(s,3h),3.84(s,6h),3.78(s,3h),3.03(t,j＝7.5hz,2h),2.89(t,j＝7.3hz,2h).¹³cnmr(151mhz,cdcl3)δ157.84,153.78,138.74,136.76,125.73,123.66,114.42,111.74,106.95,61.05,56.37,55.26,36.66,30.34,21.92.hrms(es+)m/zfound381.1821(m+h⁺)；c22h25n2o4(m+h⁺)requires381.1809.

7-甲氧基-2-羥基乙基-1-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4,5-二氫-2h-苯并[e]吲唑(sc3)

參照sc1的合成，將中間體s-dk和羥基乙基肼反應(yīng)得sc3為白色固體。熔點(diǎn)143–144℃，¹hnmr(600mhz,cdcl3)δ6.86(d,j＝8.5hz,1h),6.78(d,j＝2.6hz,1h),6.63(s,2h),6.55(dd,j＝8.5,2.7hz,1h),4.07–4.04(m,2h),3.97(d,j＝5.1hz,2h),3.95(s,3h),3.84(s,6h),3.77(s,3h),3.01(t,j＝7.2hz,2h),2.89(t,j＝7.2hz,2h).¹³cnmr(150mhz,cdcl3)δ157.72,153.73,149.38,138.61,138.08,136.80,125.94,123.71,123.16,114.81,114.39,111.69,107.20,62.17,61.03,56.34,55.24,50.31,30.46,22.19.hrms(es+)m/zfound411.1910(m+h⁺)；c23h27n2o5(m+h⁺)requires411.1914.

7-甲氧基-2-苯基-1-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4,5-二氫-2h-苯并[e]吲唑(sc4)

參照sc1的合成，將中間體s-dk和苯基肼反應(yīng)得sc4為灰色固體。熔點(diǎn)142–143℃，¹hnmr(600mhz,cdcl3)δ7.30–7.20(m,5h),7.08(d,j＝8.5hz,1h),6.83(d,j＝2.6hz,1h),6.60(dd,j＝8.6,2.7hz,1h),6.52(s,2h),3.92(s,3h),3.79(s,3h),3.66(s,6h),3.06(t,j＝7.1hz,2h),3.00–2.94(m,2h).hrms(es+)m/zfound443.1969(m+h⁺)；c27h27n2o4(m+h⁺)requires443.1965.

2-(7-甲氧基-1-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4,5-二氫-2h-苯并[e]吲唑-2-)乙酸乙酯(sc5)

參照sc1的合成，將中間體s-dk和2-肼基乙酸乙酯反應(yīng)得sc4為灰色固體。熔點(diǎn)118–119℃，¹hnmr(600mhz,cdcl3)δ6.90(d,j＝8.5hz,1h),6.79(d,j＝2.6hz,1h),6.66(s,2h),6.56(dd,j＝8.5,2.7hz,1h),4.70(s,2h),4.20(q,j＝7.1hz,2h),3.95(s,3h),3.81(s,6h),3.77(s,3h),3.02(t,j＝7.2hz,2h),2.91(t,j＝7.2hz,2h),1.26(t,j＝7.1hz,3h).¹³cnmr(151mhz,cdcl3)δ168.71,157.77,153.67,150.06,138.62,138.38,136.94,125.80,123.78,123.19,115.21,114.33,111.72,106.98,102.71,61.68,61.01,56.25,55.24,50.62,42.65,30.44,25.62,23.07,22.21,14.16,14.02.hrms(es+)m/zfound453.2023(m+h⁺)；c25h29n2o6(m+h⁺)requires453.2020.

2-(7-甲氧基-1-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4,5-二氫-2h-苯并[e]吲唑-2-)乙酸(sc6)

將2-(7-甲氧基-1-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4,5-二氫-2h-苯并[e]吲唑-2-)乙酸乙酯(sc5)溶于乙醇中，加入5倍當(dāng)量的naoh水溶液，攪拌過夜，稀鹽酸中和至ph<7后用二氯甲烷萃取，有機(jī)層濃縮后薄層色譜制備得sc6為白色固體。¹hnmr(600mhz,cdcl3)δ6.90(d,j＝8.5hz,1h),6.78(d,j＝2.6hz,1h),6.63(s,2h),6.57(dd,j＝8.5,2.7hz,1h),4.74(s,2h),3.95(s,3h),3.82(s,6h),3.77(s,3h),3.12(m,2h),2.96(m,2h).hrms(es+)m/zfound425.1699(m+h+)；c23h25n2o6(m+h+)requires425.1707.

5,6,7-三甲氧基-1-(4-甲氧基苯基)-3,4-二氫萘-2(1h)-酮(t-dk-a)

參照s-dk的合成，以原料5,6,7-三甲氧基-3,4-二氫萘-2-酮(2)和4-甲氧基苯甲酰氯反應(yīng)制備得t-dk-a為黃色固體。熔點(diǎn)86–87℃，¹hnmr(600mhz,cdcl3)δ7.51(d,j＝8.8hz,2h),6.85(d,j＝8.8hz,2h),6.06(s,1h),3.88(s,3h),3.88(s,1h),3.85(s,3h),3.83(s,3h),3.29(s,3h),2.92(t,j＝6.9hz,2h),2.61–2.53(m,2h).hrms(es+)m/zfound371.1481(m+h⁺)；c21h23o6(m+h⁺)requires371.1489.

5,6,7-三甲氧基-1-(3-氟-4-甲氧基苯基)-3,4-二氫萘-2(1h)-酮(t-dk-b)

參照s-dk的合成，以原料5,6,7-三甲氧基-3,4-二氫萘-2-酮(2)和3-氟-4-甲氧基苯甲酰氯反應(yīng)制備得t-dk-b為黃色固體。¹hnmr(600mhz,cdcl3)δ7.32(dd,j＝11.7,1.9hz,1h),7.30(d,j＝9.2hz,1h),6.89(t,j＝8.4hz,1h),6.05(s,1h),3.91(s,3h),3.89(s,3h),3.85(s,3h),3.33(s,3h),2.93(t,j＝6.9hz,2h),2.61–2.52(m,2h).¹³cnmr(150mhz,cdcl3)δ197.21,180.59,152.02,150.51,150.38,149.72,149.65,139.64,128.69,128.66,127.86,125.91,120.28,116.75,116.62,111.92,108.89,107.78,60.72,60.52,55.86,55.09,33.81,19.47.

5,6,7-三甲氧基-1-(3-硝基-4-甲氧基苯基)-3,4-二氫萘-2(1h)-酮(t-dk-c)

參照s-dk的合成，以原料5,6,7-三甲氧基-3,4-二氫萘-2-酮(2)和3-硝基-4-甲氧基苯甲酰氯反應(yīng)制備得t-dk-c為黃色固體。¹hnmr(600mhz,cdcl3)δ8.10(d,j＝2.2hz,1h),7.71(dd,j＝8.8,2.2hz,1h),7.02(d,j＝8.8hz,1h),6.04(s,1h),3.99(s,3h),3.90(s,3h),3.86(s,3h),3.36(s,3h),3.00–2.89(m,2h),2.64–2.54(m,2h).

6,7,8-三甲氧基-1-(4-甲氧基苯基)-4,5-二氫-2h-苯并[e]吲唑(tca-1)

參照sc1的合成，將中間體t-dk-a和水合肼反應(yīng)得tca-1為棕色固體。熔點(diǎn)105–106℃，¹hnmr(600mhz,cdcl3)δ7.55(d,j＝8.5hz,2h),6.99(d,j＝8.5hz,2h),6.70(s,1h),3.88(s,3h),3.86(s,6h),3.54(s,3h),3.00(t,j＝7.2hz,2h),2.82(t,j＝7.2hz,2h)；¹³cnmr(150mhz,cdcl3)δ160.13,151.63,151.43,140.45,129.88,126.55,123.49,121.13,114.20,113.39,103.08,60.98,60.95,55.75,55.41,22.10,21.73.hrms(es+)m/zfound367.1652(m+h⁺)；c21h23o6(m+h⁺)requires367.1662.

6,7,8-三甲氧基-1-(4-甲氧基苯基)-2-甲基-4,5-二氫-2h-苯并[e]吲唑(tca-2)

參照sc1的合成，將中間體t-dk-a和甲基肼反應(yīng)得tca-2為棕色固體。熔點(diǎn)126–127℃，¹hnmr(600mhz,cdcl3)δ7.37(d,j＝8.5hz,2h),7.05(d,j＝8.5hz,2h),6.30(s,1h),3.88(s,3h),3.86(s,4h),3.83(s,3h),3.70(s,3h),3.42(s,3h),3.00(t,j＝7.4hz,2h),2.85(t,j＝7.4hz,2h).¹³cnmr(151mhz,cdcl3)δ160.18,151.51,151.39,149.28,140.16,138.11,131.43,130.14,126.65,123.03,120.90,114.81,114.37,113.71,102.43,60.94,60.88,55.43,36.47,29.70,22.14,21.74.hrms(es+)m/zfound381.1805(m+h⁺)；c21h23o6(m+h⁺)requires381.1809.

6,7,8-三甲氧基-1-(3-氟-4-甲氧基苯基)-4,5-二氫-2h-苯并[e]吲唑(tcb-1)

參照sc1的合成，將中間體t-dk-b和水合肼反應(yīng)得tcb-1為紫色固體。熔點(diǎn)147–148℃，¹hnmr(600mhz,cdcl3)δ7.38(dd,j＝11.8,2.0hz,1h),7.35–7.30(m,1h),6.97(t,j＝8.5hz,1h),6.70(s,1h),3.93(s,3h),3.88(s,3h),3.87(s,3h),3.57(s,3h),3.01–2.92(m,2h),2.79–2.70(m,2h)；¹³cnmr(150mhz,cdcl3)δ152.93,151.67,151.44,151.30,147.98,147.91,140.48,126.34,124.70,120.92,116.47,116.34,113.56,113.28,103.11,61.00,60.98,56.28,55.77,21.98,21.28.hrms(es+)m/zfound385.1564(m+h⁺)；c21h23o6(m+h⁺)requires385.1558.

6,7,8-三甲氧基-1-(3-氟-4-甲氧基苯基)-2-羥基乙基-4,5-二氫-2h-苯并[e]吲唑(tcb-3)

參照sc1的合成，將中間體t-dk-b和羥基乙基肼反應(yīng)得tcb-3為棕色固體。熔點(diǎn)150–151℃，¹hnmr(600mhz,cdcl3)δ7.22(dd,j＝11.4,2.0hz,1h),7.20–7.16(m,1h),7.11(t,j＝8.4hz,1h),6.25(s,1h),4.06–4.01(m,2h),3.97(s,3h),3.95(dd,j＝9.1,4.5hz,2h),3.86(s,3h),3.84(s,3h),3.45(s,3h),2.99(t,j＝7.4hz,2h),2.84(t,j＝7.4hz,2h).¹³cnmr(151mhz,cdcl3)δ153.17,151.69,151.49,149.42,148.73,148.66,140.75,137.58,126.76,125.39,122.39,122.34,121.07,118.20,118.08,115.35,113.79,102.68,61.77,60.95,60.90,56.42,55.50,50.35,21.77,21.45.hrms(es+)m/zfound429.1830(m+h⁺)；c21h23o6(m+h⁺)requires429.1820.

6,7,8-三甲氧基-1-(3-氟-4-甲氧基苯基)-2-苯基-4,5-二氫-2h-苯并[e]吲唑(tcb-4)

參照sc1的合成，將中間體t-dk-b和苯肼反應(yīng)得tcb-4為棕色固體。熔點(diǎn)159–160℃，¹hnmr(600mhz,cdcl3)δ7.32–7.28(m,2h),7.26–7.22(m,3h),7.13(dd,j＝11.6,2.0hz,1h),7.09–7.05(m,1h),6.98(t,j＝8.5hz,1h),6.40(s,1h),3.92(s,3h),3.89(s,3h),3.87(s,3h),3.48(s,3h),3.05(t,j＝7.3hz,2h),2.93(t,j＝7.2hz,2h).¹³cnmr(151mhz,cdcl3)δ153.04,151.72,151.51,151.39,151.05,148.34,148.27,140.96,138.93,136.30,128.97,127.48,126.88,125.36,125.10,122.98,121.68,120.65,118.21,118.09,116.67,115.32,113.48,103.06,60.98,56.29,55.57,21.84,21.63.hrms(es+)m/zfound461.1870(m+h⁺)；c21h23o6(m+h⁺)requires461.1871.

6,7,8-三甲氧基-1-(3-硝基-4-甲氧基苯基)-2-苯基-4,5-二氫-2h-苯并[e]吲唑(tcc-1)

參照sc1的合成，將中間體t-dk-c和水合肼反應(yīng)得tcc-1為棕色固體。熔點(diǎn)108–109℃，¹hnmr(600mhz,cdcl3)δ8.16(d,j＝2.2hz,1h),7.84(dd,j＝8.6,2.2hz,1h),7.16(d,j＝8.7hz,1h),6.65(s,1h),4.02(s,3h),3.89(s,3h),3.88(s,3h),3.60(s,3h),3.01(t,j＝7.4hz,2h),2.87–2.80(m,2h).¹³cnmr(151mhz,cdcl3)δ152.68,151.90,151.59,140.81,139.68,134.04,125.87,125.43,124.97,120.86,114.05,113.62,102.98,61.00,56.70,55.89,21.89,21.04.

6,7,8-三甲氧基-1-(3-氨基-4-甲氧基苯基)-2-苯基-4,5-二氫-2h-苯并[e]吲唑(tcd-1)

在10ml75％乙醇中加入醋酸，調(diào)至ph＝3～4，攪拌下加入鐵粉(90mg,1.6mmol)，加熱至90℃攪拌一小時(shí)。再加入化合物tcc-1(66mg,0.16mmol)，繼續(xù)攪拌30分鐘，反應(yīng)完畢。反應(yīng)液用無水碳酸鉀中和至ph≈8，硅藻土過濾，用乙酸乙酯洗滌。濾液用乙酸乙酯萃取，食鹽水洗滌，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，濃縮并硅膠柱層析得黃色粉末tcd-1(41mg,67％yield)。¹hnmr(600mhz,cdcl3)δ6.95(t,j＝5.4hz,2h),6.84(s,1h),6.83(d,j＝8.1hz,1h),4.19(s,2h),3.89(s,3h),3.87(s,3h),3.86(s,3h),3.58(s,3h),3.48(s,1h),3.02–2.92(m,2h),2.83–2.73(m,2h).¹³cnmr(150mhz,cdcl3)δ151.56,151.33,150.26,147.71,140.29,140.10,136.49,126.72,123.68,121.09,118.61,114.63,113.04,110.30,103.27,60.99,60.95,55.79,55.61,22.10,21.72.

目標(biāo)物對colo205細(xì)胞株的細(xì)胞毒作用.

一、實(shí)驗(yàn)材料和方法：

1、實(shí)驗(yàn)材料

(一)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株

本實(shí)驗(yàn)采用了人結(jié)腸癌細(xì)胞colo205作為篩選對象，該癌細(xì)胞株均由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院藥理研究室提供。

(二)培養(yǎng)液為dmem+10％fbs+雙抗，所用全自動(dòng)酶標(biāo)儀型號為：varioskanflash，生產(chǎn)廠商：thermoscientific。進(jìn)口96孔培養(yǎng)板等。

2、試驗(yàn)方法

體外抗腫瘤活性采用mtt法。

mtt法。96孔板每孔加入濃度為5×10⁴個(gè)/ml的細(xì)胞懸液100μl，置37℃，5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)。24h后，加入樣品液，10μl/孔，設(shè)三復(fù)孔，37℃，5％co2作用72h。每孔加入5mg/ml的mtt溶液20μl，作用4h后加入溶解液，100μl/孔，置培養(yǎng)箱內(nèi)，溶解后用全波長多功能酶標(biāo)儀測570nmod值。

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

表1目標(biāo)化合物對人結(jié)腸癌細(xì)胞colo205的體外增殖抑制作用

注：該化合物為專利cn103130632a中的化合物1

抑制微管蛋白聚合實(shí)驗(yàn)

一、實(shí)驗(yàn)材料和方法：

1、實(shí)驗(yàn)材料

(一)微管蛋白

本實(shí)驗(yàn)采用了牛微管蛋白作為篩選對象，生產(chǎn)廠家：cytoskeleton。

(二)緩沖液

generaltubulinbuffer:80mmpipesph＝6.9,2mmmgcl2,0.5mmegta,生產(chǎn)廠家:cytoskeleton。

tubulinglycerolbuffer:60％glycerol,生產(chǎn)廠家:cytoskeleton。

gtp：100mm,生產(chǎn)廠家:cytoskeleton

所用全自動(dòng)酶標(biāo)儀型號為：synergy4，生產(chǎn)廠商：biotek。進(jìn)口96孔半面積培養(yǎng)板等。

2、試驗(yàn)方法

采用文獻(xiàn)方法(cellbiochemistryandbiophysics,2003,38:1-21)，及微管蛋白試劑盒方法(cytodynamixscreen03)。

樣品配制：用dmso(merck)溶解后，加入緩沖液配成相應(yīng)濃度的溶液或均勻的混懸液，然后用緩沖液稀釋。

實(shí)驗(yàn)步驟如下：

在96孔培養(yǎng)板中每孔加入相應(yīng)濃度為待測化合物10μl，置37℃酶標(biāo)儀中，2min后，加入3mg/ml的微管蛋白液，100μl/孔，設(shè)雙復(fù)孔，37℃，作用1h，每分鐘測340nmod值。

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2部分化合物抑制微管蛋白聚合的作用

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，tcd-1的微管蛋白抑制聚合活性甚至好于ca-4，值得作為抗腫瘤藥物進(jìn)行深入研究。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。