本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種sirna雙鏈的分子結(jié)構(gòu)及其在醫(yī)藥制備上的用途。

背景技術(shù)：

在基因dna雙鏈中，轉(zhuǎn)錄時(shí)作為mrna（信使rna，攜帶遺傳信息，在蛋白質(zhì)合成時(shí)充當(dāng)模板的rna）合成模板的那條單鏈叫做模板鏈或反義鏈，而轉(zhuǎn)錄時(shí)不能作為mrna合成模板的那條單鏈叫有義鏈或正義鏈。

核苷酸是由堿基、核糖（或脫氧核糖）和磷酸構(gòu)成的。核糖（或脫氧核糖）是五碳糖，根據(jù)國際命名法，將連接堿基的碳命名為1號碳，以下順次命名直至5號碳。其中，3號碳上連接的為羥基，5號碳上連接的為磷酸基團(tuán)。相鄰核苷酸通過磷酸二酯鍵連接，就是前一個(gè)核苷酸的3號碳上的羥基與下一個(gè)核苷酸5號碳上的磷酸脫水形成酯鍵。這樣順次連接形成一條dna或rna鏈。這條鏈的兩個(gè)端點(diǎn)的兩個(gè)核苷酸，其中一個(gè)的5號碳上的磷酸未成鍵，這一端稱5'端；另一個(gè)的3號碳上的羥基未成鍵，這一端稱3‘端。正義鏈中的5′端稱之為上游；反義鏈中的3′’端稱之為上游，5′端稱之為下游。

nature,1998,391(6669):806-11介紹了一種rnai效應(yīng)（rnainterference，rna干擾)，它是哺乳動(dòng)物細(xì)胞漿內(nèi)存在的一種自然現(xiàn)象。rnai效應(yīng)的分子為含21-23個(gè)核苷的雙鏈小干擾rna（sirna）分子，在多蛋白核苷酶復(fù)合體(rna-inducedsilencingcomplex,risc)介導(dǎo)下,靶向與其反義鏈序列互補(bǔ)的mrna，形成新的較長的雙鏈rna，然后被一種蛋白降解為新的sirna片段，靶向的mrna即被降解或沉默（silence）。一方面，rnai效應(yīng)技術(shù)可用作基因表達(dá)沉默的強(qiáng)有力工具，通過基因沉默技術(shù)研究疾病發(fā)生機(jī)理、鑒定疾病治療靶點(diǎn)。另一方面，natrevgenet，2007，8(3):173-84介紹了sirna分子本身也可直接作為藥物分子用于人體治療疾病。治療用sirna分子的長度必須為21-23個(gè)核苷，（過大數(shù)量的核苷酸有可能引起炎癥反應(yīng)和全身范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)表達(dá)關(guān)閉等副作用），其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，無須像反義核苷酸那樣進(jìn)行廣泛的化學(xué)修飾以提高其半衰期，并能在低于反義核苷酸幾個(gè)數(shù)量級的濃度下，把靶基因降至極低的水平甚至完全“敲除”，從而產(chǎn)生缺失突變表型。

rnai效應(yīng)的關(guān)鍵取決于靶基因序列的選擇，任一錯(cuò)誤均會(huì)導(dǎo)致rnai效應(yīng)的喪失，這種高度特異性使其對點(diǎn)突變、序列插入和缺失的選擇性基因沉默有很重要的藥理作用，對治療某些因基因突變或過度表達(dá)引起的疾病具有良好的應(yīng)用前景。

人體血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2（vegfr-2），又名激酶插入?yún)^(qū)受體(kinasedo2mainreceptor,kdr),是一個(gè)分子量為230kd的跨膜糖蛋白，由一個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域，一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域組成。其與vegf的信號通路在血管的形成過程中起重要作用，參與由vegf介導(dǎo)的血管通透性改變。腫瘤中的實(shí)體瘤，其發(fā)生發(fā)展與腫瘤血管生成有著密切的聯(lián)系。

申請?zhí)枮?012102135023的發(fā)明公開了一種抑制bcl2基因表達(dá)的sirna雙鏈及其應(yīng)用，sirna雙鏈具有如下的核苷酸序列：

正義鏈：5′-gccuugacauugauggaautt-3′；

反義鏈：3′-ttcggaacuuuguaacuaccuua-5′。

該發(fā)明依據(jù)一種在線設(shè)計(jì)軟件分析，采用在絕大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的抵抗凋亡的bcl2為靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)靶向bcl2的sirna序列，在一些肺癌和宮頸癌細(xì)胞內(nèi)有效抑制bcl2基因的表達(dá)；該發(fā)明是針對淋巴細(xì)胞的處理，對其它一些腫瘤細(xì)胞的影響有限，不具有針對腫瘤治療的普適性意義。

申請?zhí)枮?015101721384的發(fā)明公開了vegfr2基因val297ile位點(diǎn)的應(yīng)用方法，具體是用于制備檢測帕金森患者對于采用左旋多巴治療時(shí)的藥物敏感性的試劑盒。該試劑盒中含有檢測vegfr2基因val297ile位點(diǎn)的探針和引物，所述探針和引物能與vegfr2基因val297ile位點(diǎn)前后的基因序列特異性結(jié)合并擴(kuò)增出包含vegfr2基因val297ile位點(diǎn)的基因序列。該發(fā)明只能檢測vegfr2基因的有關(guān)數(shù)據(jù)，如何抑制其生長以及能帶來的有益作用沒有任何介紹。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：

提供一種能夠在mrna水平上高效而穩(wěn)定地抑制人源基因vegfr2（人體血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2）表達(dá)、并進(jìn)而可抑制腫瘤細(xì)胞生長的高效sirna雙鏈。

技術(shù)方案：

為達(dá)上述目的，本發(fā)明采用sirna設(shè)計(jì)法則并結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)軟件獲得抑制人體血管中內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2（vegfr2）基因表達(dá)的幾種具有不同核苷酸序列的sirna雙鏈，并通過實(shí)驗(yàn)篩選一條高效沉默vegfr2表達(dá)的sirna雙鏈，所述sirna靶基因、正義鏈和反義鏈中含有的核苷酸序列分別如下：

靶基因：ggtaaagattgatgaagaa；

正義鏈：5'-gguaaagauugaugaagaadn-3'；

反義鏈：3'-ndccauuucuaacuacuucuu-5'；

正義鏈的5'端之后的19個(gè)核苷酸序列與反義鏈的5'端之前的19個(gè)核苷酸序列互補(bǔ)。

其中，n為a、g、c、u、t、da、dc、dg、dt中的一種,d為a、g、u、t、da、dg、dt中的一種。這19個(gè)核苷酸序列的排列順序，使得其沉默人源基因vegfr2的表達(dá)效果比已知的其它核苷酸序列的sirna靶基因效果更低，抑制作用明顯，尤其采用的核苷酸d指代的a或g或t/u，而非與人源基因vegfr2較親善或抑制不明顯的胞嘧啶c，對翻譯多肽鏈以及合成蛋白質(zhì)的過程抑制調(diào)節(jié)更有效。

在此基礎(chǔ)上，經(jīng)過多種試驗(yàn)和分析，優(yōu)選dn為兩個(gè)游離且連續(xù)的脫氧核苷酸dtdt(dt:胸腺嘧啶脫氧核苷酸)，這樣的sirna沉默人源基因vegfr2的表達(dá)效果，在已知的實(shí)驗(yàn)中抑制作用最顯著。此時(shí)，

正義鏈：5'-gguaaagauugaugaagaadtdt-3'；

反義鏈：3'-dtdtccauuucuaacuacuucuu-5'。

由于腫瘤特有的微環(huán)境刺激，使人體腫瘤中vegfr2的表達(dá)水平較正常組織中明顯增加。因此，通過阻斷vegf/vegfr2信號通路來抑制腫瘤內(nèi)部新生血管的生成，是一種有效的抗腫瘤方案。sirna是rnai的效應(yīng)分子，能高效特異性地抑制靶基因的表達(dá)，通過本發(fā)明上述設(shè)計(jì)的抗vegfr2基因的sirna分子來沉默vegfr2的表達(dá)，能夠阻斷vegf／vegfr2信號通路，尤其在治療實(shí)體瘤中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

本發(fā)明的另一目的：是將上述抑制vegfr2基因表達(dá)的sirna雙鏈，用于設(shè)計(jì)和制備因人體人體病變組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2過度表達(dá)、導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞過度生長而引起的相關(guān)疾病的藥物（尤其是抑制腫瘤內(nèi)血管生成的抗腫瘤藥物）。

所述的相關(guān)腫瘤疾病為肺癌、肝癌、食管癌、宮頸癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、腎癌膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、口腔上皮癌、卵巢癌、頭頸癌、腦瘤、膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的任一種或多種。當(dāng)然，該藥物也可以用于預(yù)防或治療其它血管增生性疾病如血管瘤、老年眼睛黃斑病變等疾病。

本發(fā)明的試驗(yàn)方法簡介如下：

（一）sirna的設(shè)計(jì)和合成：利用設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)并分別合成了兩個(gè)對照序列。

其中有一個(gè)序列（編號：sirna1）如下：

靶序列：ggtaaagattgatgaagaatt(nm_002253.2:3626-3646)

正義鏈：5'-gguaaagauugaugaagaadtdt-3'

反義鏈：3'-dtdtccauuucuaacuacuucuu-5'

另一個(gè)對比序列（編號：sirna2）如下：

靶序列：gctgacatgtacggtctat(nm_002253.2:1628-1646)

正義鏈：5'-gcugacauguacggucuaudtdt-3’

反義鏈：3'-dtdtcgacuguacaugccagaua-5'

（二）采用rt-qpcr檢測sirna1和sirna2在huvecs（人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞）中對vegfr2基因的沉默效率：

1.將gapdh（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）基因作為參照基因，其合成的序列（編號為controlsirna）如下：

靶序列：aacggatttggtcgtattgg

正義鏈：5’-gatctcgctcctggaagatg-3’

反義鏈：3’-aacggatttggtcgtattgg-5’

2.將sirna1、sirna2、gapdh細(xì)胞用高糖dmem培養(yǎng)基稀釋傳代，培養(yǎng)基含5-15％牛血清，分別制備lipo2000/sirna1組、lipo2000/sirna2組、lipo2000/controlsirna組。另外，再采用無血清培養(yǎng)基給藥，改組為空白對照組（untreated）。將它們分別經(jīng)過轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，得到如圖1所示的四組樣本的mrna表達(dá)水平分析圖。

3.熒光定量rt-pcr檢測vegfr2和gapdh基因標(biāo)本，采用蛋白質(zhì)印跡法，得到如圖2所示的轉(zhuǎn)染sirna后細(xì)胞中蛋白的表達(dá)效果。

（三）接著，采用western-blot法檢測vegfr2蛋白的表達(dá)，將它們分別經(jīng)過細(xì)胞總rna的提取、逆轉(zhuǎn)錄合成cdna，進(jìn)行pcr檢測沉默效率。采用one-wayanova方法比較轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞vegfr2的mrna和蛋白表達(dá)水平是否有顯著差異，得到如圖3所示的蛋白的表達(dá)水平分析圖。

（四）實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：

實(shí)驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)繪制成3幅附圖，附圖顯示：四種不同的標(biāo)本的mrna和蛋白表達(dá)水平是否有顯著差異，lipo2000/sirna1組、lipo2000/sirna2組相比lipo2000/controlsirna組（用gapdh制備的組）和空白對照組（untreated），表達(dá)水平明顯降低；而且，lipo2000/sirna1組比lipo2000/sirna2組降低更多，即lipo2000/sirna1沉默表達(dá)的效果最為顯著。

有益效果：

本發(fā)明的sirna雙鏈能夠高效抑制人源基因vegfr2的表達(dá)，從而抑制人體病變組織中血管的生成或生長，阻止多種腫瘤等病變組織的生長，能夠預(yù)防和治療多種癌癥。本發(fā)明設(shè)計(jì)合成的抗人vegfr2表達(dá)的sirna分子，研究了未經(jīng)化學(xué)修飾的svegfr2基因的沉默效果，為后續(xù)體內(nèi)應(yīng)用不同的sirna分子，所需要的穩(wěn)定性和靶向性修飾提供了理論依據(jù)。另外，其它疾病如由于眼睛脈絡(luò)膜內(nèi)血管增生而至的老年黃斑病變，利用沉默vegf2基因的sirna分子，具有良好的治療效果。

附圖說明

圖1是采用rt-qpcr檢測中轉(zhuǎn)染sirna后,人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（huvecs）中vegfr2的mrna表達(dá)水平分析圖。

圖2是采用蛋白質(zhì)印跡法（westernblotting）分析轉(zhuǎn)染sirna后細(xì)胞中vegfr2蛋白的表達(dá)效果圖。

其中含有：lipo2000/sirna1組；lipo2000/sirna2組；lipo2000/controlsirna組；空白對照組。

圖3是圖2所述的蛋白表達(dá)水平分析圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：

如圖1、3所示，四組或者三組對照樣本顯示的沉默人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2的表達(dá)水平差異表明，本發(fā)明所述的sirna序列的沉默效果最佳。尤其是：

靶基因?yàn)間gtaaagattgatgaagaa；正義鏈為5'-gguaaagauugaugaagaadtdt-3'；

反義鏈為3'-dtdtccauuucuaacuacuucuu-5'；此時(shí)，沉默人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2表達(dá)的sirna序列表達(dá)更大的抑制效果，可以用于設(shè)計(jì)和制備抑制人體腫瘤中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的抗腫瘤藥物。

如圖2所示的蛋白質(zhì)印跡，進(jìn)一步驗(yàn)證了本發(fā)明的樣本在人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2（vegfr2）中的印跡很淡，抑制腫瘤內(nèi)部新生血管生成的效果很明顯優(yōu)于針對gapdh的效果。

sequencelisting

<110>武漢澤智生物醫(yī)藥有限公司

<120>沉默內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2表達(dá)的sirna及其用途

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