本發(fā)明屬于遺傳工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種煙草抗旱基因ntsap5及其克隆方法與應用。

背景技術(shù)：

干旱嚴重影響作物的生長發(fā)育、產(chǎn)量及品質(zhì)。提高植物的抗旱能力已經(jīng)成為現(xiàn)代植物研究工作中的關(guān)鍵問題之一?？购禉C理的研究是抗旱育種的基礎(chǔ)，也是育種的關(guān)鍵因素之一。經(jīng)歷了幾十年的努力，對植物抗旱的研究已從抗旱指標的表觀因素分析，進入到分子及基因水平的探索。

近年來，隨著全球氣候變暖，干旱已成為我國作物生產(chǎn)中頻繁發(fā)生的自然災害。煙草作為中國重要的經(jīng)濟作物，在整個生育期對水分的要求很高。中國大部分煙區(qū)處于干旱、半干旱環(huán)境中，而且優(yōu)質(zhì)煙區(qū)多位于丘陵山區(qū)，常因土壤干旱而影響煙株的生長發(fā)育，導致煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)降低，干旱已成為制約我國煙葉產(chǎn)量與品質(zhì)提高的主要限制因子之一。因此，加強煙草抗旱基因資源的挖掘和利用，對于煙草抗旱新品種培育，實現(xiàn)煙草農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重大意義。

自20世紀80年代以來，國內(nèi)外學者在干旱對煙草生長、發(fā)育、代謝的影響等方面做了大量研究，取得了一些重要進展。歸納起來主要有以下幾個方面:第一，干旱對煙草生理的影響，主要表現(xiàn)在:(1)干旱脅迫影響了葉綠素的合成，促進了葉綠素的分解，從而影響了葉片的光合效率(plantmolecularbiology，1979，20:37-44)；(2)干旱脅迫導致植株氮素代謝關(guān)鍵酶-硝酸還原酶(nr)的活性降低，而蛋白水解酶活性增強引起脯氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和纈氨酸等大量積累；(3)干旱脅迫導致葉片膜脂過氧化作用增強，膜透性增加，丙二醛(mda)含量升高，出現(xiàn)電解質(zhì)外滲?？寡趸Ｗo酶s0d、p0d、cat等酶活性顯著下降。第二，干旱對煙草生長發(fā)育的影響，主要表現(xiàn)在:(i)干旱脅迫降低了種子的萌發(fā)和幼苗的成活；(2)抑制了根系的生長，從而影響了礦質(zhì)營養(yǎng)的吸收；(3)干旱脅迫導致植株矮小，節(jié)間短，葉片小，易早衰。這些研究較好地闡明了干旱對煙草生長、發(fā)育及代謝影響的生理生化基礎(chǔ)，但缺乏對煙草抗旱分子遺傳機理的研究。

近年來，隨著分子生物學和基因組學研究的深入，抗旱基因的發(fā)掘成為目前作物抗逆遺傳資源與品種改良研究的熱點，越來越多的抗旱相關(guān)基因相繼被克隆和鑒定。按照抗旱基因的功能，可以把植物抗旱相關(guān)基因分為兩大類:第一類基因為功能基因，主要在植物抗性中起保護作用。這一類基因主要包括滲透調(diào)芐基因如:海藻糖合成酶基因tpsljf氨酸合成酶基因p5cs、甘露醇合成基因mtld、甜菜堿合成酶級以內(nèi)badh、及多按合成基因odc等；保護生物大分子的活性基因如:脫水蛋白基因bdn1、水通道蛋白基因aqp和晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白lea等。第二類基因為調(diào)芐基因，主要在信號傳導和逆境基因表達過程中起調(diào)節(jié)作用，主要包括一些轉(zhuǎn)錄因子基因如:dreb、myb、bzip、wrky、nac等。這些基因已在植物基因工程中得到應用。

泛素化生物體表觀遺傳修飾的一種重要形式，該過程能夠使生物體內(nèi)蛋白發(fā)生泛素化，泛素化的蛋白能夠被降解。泛素連接酶e3是泛素化過程中的關(guān)鍵酶類，決定了那些蛋白能夠被泛素化。泛素化在植物激素調(diào)控、花發(fā)育和病原菌防衛(wèi)反應中起著重要的作用(plantj,2010,61:1029-1040；jexpbot，2007，58:221-227)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的在于提供一種煙草抗旱基因ntsap5；第二目的在于提供所述的煙草抗旱基因ntsap5的克隆方法，第三目的在于提供所述的煙草抗旱基因ntsap5的應用。

本發(fā)明的第一目的是這樣實現(xiàn)的，所述的煙草抗旱基因ntsap5的核苷酸序列如seqidno：1所示。

本發(fā)明的第二目的是這樣實現(xiàn)的，包括以下步驟：

a、煙草葉片cdna合成：提取煙草葉片總rna，反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cdna；

b、ntsap5基因的pcr擴增：以煙草葉片cdna為模板，根據(jù)ntsap5基因序列設(shè)計引物，進行pcr擴增，回收和純化pcr擴增產(chǎn)物，并測序。

本發(fā)明的第三目的是這樣實現(xiàn)的，所述的煙草抗旱基因ntsap5在獲得抗干旱轉(zhuǎn)基因煙草植株中的應用。

本發(fā)明提供了一種新的植物抗旱相關(guān)蛋白及其編碼基因。

本發(fā)明所提供的植物抗旱相關(guān)蛋白，名稱為ntsap5，其來源于云煙87栽培煙草，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)：

1)序列表中的seqidno：2；

2)將序列表中seqidno：2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗旱相關(guān)的蛋白質(zhì)。

序列表中的序列2由154個氨基酸組成。

所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。

ntsap5的編碼基因(ntsap5)也屬于本發(fā)明的保護范圍。

ntsap5的編碼基因，可具有下述核苷酸序列之一：1)序列表中seqidno：1的dna序列；2)編碼序列表中seqidno：2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴謹條件下可與序列表中seqidno：1限定的dna序列雜交的核苷酸序列；4)與序列表中seqidno：1限定的dna序列具有70％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的dna序列。

含有本發(fā)明ntsap5的表達載體，細胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。擴增ntsap5中任一片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明還提供了利用該基因增強植物抗旱性的方法，是在植物中過量表達上述植物抗旱性相關(guān)蛋白編碼基因。

過量表達上述植物抗旱性相關(guān)蛋白編碼基因ntsap5可通過多種方法實現(xiàn)，如植物病毒載體介導基因過表達的方法，農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化過表達載體，對基因編碼匡進行優(yōu)化修改，對該基因啟動子進行優(yōu)化以達到過表達效果等方法實現(xiàn)。本發(fā)明過量表達基因的方法并不限于上述幾種方法，只要能過量表達ntsap5即可。

利用任何基因過表達或者基因修飾方法該ntsap5使植物表現(xiàn)為抗旱；利用任何一種可以引導外源基因在植物中表達的載體，將本發(fā)明所提供的ntsap5轉(zhuǎn)入植物中，植物就表現(xiàn)出干旱不敏感。

本發(fā)明的ntsap5基因在構(gòu)建到植物表達載體中時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強啟動子或誘導型啟動子。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所使用的載體進行加工，如加入植物可選擇性標記(gus基因、螢光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素，卡那霉素等)。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如：煙草、水稻、小麥、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草或苜宿等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以植物苗期葉片失水程度來篩選轉(zhuǎn)化植株。攜帶有本發(fā)明ntsap5基因的表達載體可通過使用ti質(zhì)粒、ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接dna轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導、農(nóng)桿菌介導等常規(guī)生物學方法轉(zhuǎn)化植物細胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物經(jīng)組織培育成植株。

本發(fā)明的植物抗旱相關(guān)蛋白及其編碼基因為農(nóng)作物尤其是煙草抗旱育種提供基因與技術(shù)的支持。

本發(fā)明中，干旱處理的煙草幼苗葉片中，所述的泛素e3連接酶編碼基因ntsap5被誘導表達。本發(fā)明所述的蛋白ntsap5是植物泛素化蛋白降解途徑中的關(guān)鍵酶類，所以調(diào)控ntsap5的表達能夠調(diào)節(jié)植物對干旱的抗性。因此所述的干旱響應的基因ntsap5在植物抗旱領(lǐng)域具有廣闊的應用前景，其經(jīng)濟效益潛力巨大。

附圖說明

圖1為本發(fā)明煙草葉片中ntsap5基因響應干旱脅迫柱狀圖；

圖2為ntsap5的pcr產(chǎn)物電泳圖；

圖3為pdonr-zeo載體圖；

圖4為ntsap5基因植物表達載體pb2gw7圖；

圖5為轉(zhuǎn)ntsap5基因的煙草株系表達水平柱狀圖；

圖6為ntsap5基因過量表達的煙草植株對干旱脅迫處理的生長表型照片。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步的說明，但不以任何方式對本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明所述的煙草抗旱基因ntsap5的核苷酸序列如seqidno：1所示。

所述的煙草抗旱基因ntsap5編碼的氨基酸序列如seqidno：2所示。

本發(fā)明所述的煙草抗旱基因ntsap5的克隆方法，包括以下步驟：

a、煙草葉片cdna合成：提取煙草葉片總rna，反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cdna；

b、ntsap5基因的pcr擴增：以煙草葉片cdna為模板，根據(jù)ntsap5基因序列設(shè)計引物，進行pcr擴增，回收和純化pcr擴增產(chǎn)物，并測序。

b步驟中所述的引物為：

正向引物：5’-atggctcagagaacagagaaag-3’

反向引物：5’-tcaaagtttaacgatcttcg-3’。

b步驟中所述的pcr反應體系和擴增條件如下：

b步驟中所述的測序的具體操作為送交invitrogen公司進行測序。

b步驟中所述的回收和純化pcr擴增產(chǎn)物的具體操作如下：

所述的回收和純化pcr擴增產(chǎn)物的具體操作如下：凝膠電泳后，用干凈的刀片將帶有目的片段的膠切割下來，放入到離心管中，膠不要切得過大，以避免回收時dna片段溶液含有大量的雜質(zhì)；向離心管中加入3倍體積的qg溶液后，在50℃條件下溫浴10min，直到膠完全融化；將離心管中的溶液移到2ml的吸附柱中，離心1min，棄去液相；再次向吸附柱中加入0.5ml的qg溶液，離心1min，棄去液相；向吸附柱加入0.75ml的pe溶液，離心1min，棄去液相；再次離心1min后，將吸附柱放置在一個新的離心管上，加入50μl的溶解液，靜置1min，最后離心1min，得到的液相即為回收的dna溶液。

本發(fā)明所述的煙草抗旱基因ntsap5的應用為所述的煙草抗旱基因ntsap5在獲得抗干旱轉(zhuǎn)基因煙草植株中的應用。

下面以具體實施案例對本發(fā)明做進一步說明：

實施例1

云煙87種子播種到花盆中，在溫度為26-28°c、濕度為60%、光暗交替周期為16h/8h的光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)。待幼苗長至約5-6片葉片時，進行干旱處理。處理的時間分別為0.5小時、2小時；以未做脅迫處理的煙草幼苗作為對照組，采取對照及處理的煙草葉片材料進行高通量rna-seq。其中ntsap5作為e3連接酶在干旱處理0.5小時的時候上調(diào)顯著，兩小時后表達量下調(diào)（圖1）。

實施例2

ntsap5基因的克隆

1.煙草葉片cdna合成

采用trizol(invitrogen，usa)試劑提取煙草葉片總rna，將煙草葉片總rna定量1μg于1.5ml離心管中，按照invitrogen公司的rna提取試劑盒產(chǎn)品說明進行反轉(zhuǎn)錄,最終獲得煙草葉片cdna。、

2.ntsap5基因的pcr擴增

以煙草葉片cdna為模板，根據(jù)煙草基因組數(shù)據(jù)庫信息設(shè)計引物，進行ntsap5基因的pcr擴增，得到pcr擴增產(chǎn)物。

引物為

將擴增獲得的pcr產(chǎn)物在0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠電泳結(jié)果為(如圖2所示)，獲得471bp大小的片段。

電泳結(jié)束后，采用qiagen公司pcr產(chǎn)物純化試劑盒，按照產(chǎn)品說明回收純化所述的pcr產(chǎn)物，并送invitrogen測序，驗證序列結(jié)果，結(jié)果表明該序列與基因組數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)完全相同。

實施例3

ntsap5基因轉(zhuǎn)化煙草及轉(zhuǎn)基因植株檢測

1、植物表達載體的構(gòu)建

以實施例2中ntsap5全長片段為模板，用含有g(shù)ateway接頭序列的引物進行pcr擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)pcr產(chǎn)物純化后，經(jīng)過bp反應插入到invitrogen公司pdonr-zeo載體中。將構(gòu)建好的bp反應載體通過lr反應將ntsap5片段置換到pb2gw7載體中。

gateway反應引物序列如下:

2、農(nóng)桿菌介導的煙草轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

將經(jīng)過pcr反應及測序，鑒定正確的重組質(zhì)粒利用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌lba4404，通過菌落pcr確定陽性農(nóng)桿菌菌株，利用農(nóng)桿菌介導的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草品種云煙87。

具體方法如下:

(1)無菌條件下，將煙草種子放入ep管中用無菌水沖洗2-3次；

(2)于75%的酒精中浸泡30-60sec；

(3)再用0.1%的升汞處理5min，最后用無菌水沖洗5次；

(4)播種于ms培養(yǎng)基上，培養(yǎng)在云南煙草農(nóng)業(yè)科學研究院組織培養(yǎng)室中，暗培養(yǎng)4天。25℃光照培養(yǎng)20-30天；

(5)待煙草苗長至3-5cm時（20-30天），取頂芽放于ms+ba0.2mg/l（壯芽，使其快速成長）培養(yǎng)基上，繼代培養(yǎng)；

(6)繼代培養(yǎng)14天后（有小葉片即可），取葉片，大小1cmx1cm，切去葉柄，葉片表面及葉邊緣劃傷，放入ms+ba1.0mg/lph6.0-6.5的預培養(yǎng)培養(yǎng)基上，正面朝下緊貼培養(yǎng)基放置，于黑暗條件下預培養(yǎng)2-3天；

(7)然后取出預培養(yǎng)的葉片或莖段，放入侵染液中進行侵染。侵染前一天晚上，搖菌農(nóng)桿菌2瓶。將2ml離心管裝滿菌液，4000rpm離心5min，用懸菌液清洗兩次。以1:10比例（10ml懸菌液放1管1.5ml菌體）放入懸菌液，加入as25mg/l（40ml中加40ulas）不斷搖晃侵染液，使其與葉片及莖段切口處充分接觸，10min后，取出，放于滅過菌的干燥濾紙上吸干菌液；

(8)將葉片及莖段放回到預培養(yǎng)基上，28℃黑暗條件下共培養(yǎng)2-3天，至葉片切口周圍有微菌斑形成；

(9)洗菌，取出共培養(yǎng)的煙草葉片及莖段，用添加500mg/lcef的無菌水沖洗5次，第一次放置于搖床搖30min，后面每次5min，以洗去外植體表面的農(nóng)桿菌；

(10)取出后，用濾紙吸干，轉(zhuǎn)移到煙草誘芽培養(yǎng)基上，誘芽培養(yǎng)基為ms+ba1.0mg/l+hyg25mg/l+cef500mg/lph5.8；過2周觀察，如果發(fā)現(xiàn)不長菌，則降低cef濃度。如果長菌，則繼續(xù)保持cef濃度；

(11)每兩周更換一次培養(yǎng)基，直至長出不定芽（一般情況為2周）。切下再生的小苗（1cm左右），轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基ms+ba0.2-0.1mg/l+hyg25mg/l+cef500mg/lph5.8；

(12)至小苗長至2cm長時（有小芽即可），轉(zhuǎn)接入生根培養(yǎng)基ms+naa0.2-0.1mg/l上，24士1℃、12h光照、1500lx培養(yǎng)三周左右即可長出粗壯根系；

(13)待根生長至2-3cm。苗高7-10cm左右時，移出三角瓶洗去根部培養(yǎng)基，移栽于花盆中，溫室培養(yǎng)。

采用qiagen公司dna提取試劑盒，提取轉(zhuǎn)基因煙草幼苗的基因組dna，設(shè)計basta抗性基因引物進行pcr擴增，篩選陽性植株,檢測到25株陽性植株；

按照實例2中所述方法提取野生型植株和25株轉(zhuǎn)ntsap5基因t0代植株的總rna,進行realtime-pcr分析，內(nèi)參基因為26s，分析不同株系的表達情況。選取表達量最高的兩株植株（圖5）。單株收取種子分別播種，用basta抗生素篩選t1代植株的分離情況，如此重復直至t3代獲得遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因株系。

ntsap5qrt引物

26s內(nèi)參基因引物

實施例4

ntsap5過量表達煙草植株對干旱脅迫的抗性表型鑒定

1、將野生型煙草云煙87植株和2個轉(zhuǎn)基因系(過表達_1和過表達_2)轉(zhuǎn)基因煙草種子均勻播于含營養(yǎng)土的小盆中，置于光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)。待幼苗長至5-6片葉時(30天)，停止?jié)菜?周，觀察植株生長情況，并記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。

2、煙草植株經(jīng)干旱處理2周后，ntsap5轉(zhuǎn)基因煙草生長狀況明顯優(yōu)于野生型煙草植株，轉(zhuǎn)基因植株葉片萎焉，野生型植株萎蔫情況更為明顯，大部分葉片萎焉(圖6)。表明ntsap5過表達的轉(zhuǎn)基因煙草對干旱脅迫表現(xiàn)出較好的抗性。

sequencelisting

<110>云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院

<120>一種煙草抗旱基因ntsap5及其克隆方法與應用

<130>2017

<160>10

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>471

<212>dna

<213>ntsap5的核苷酸序列

<400>1

atggctcagagaacagagaaagaagagactgaatacaacaaagtcgtacatgagaaaacc60

ttaacactttgcgttaaaagttgcggtgtcatcggcaatccagccaccaataatatgtgc120

caaaattgctctaacgctagctcctccaaggtcgcatatcctcataaattcgccaacata180

ttaaccagatctacctcgtccgatctaaaaaaatatgtcgatcgagcggtgaaagatgat240

gataaggcaaaggagagcgtttcaccggcgaagagggaggtgaaccgttgctctggttgt300

cggaggaagctaggattaaccggcttccgttgccggtgcggtgaattattctgcggcgaa360

caccgttactctgaccgtcatgattgcagctatgattacagaaccgccggccgagaggcg420

atcgcgaggcagaatccgctcgtcaaagccgcgaagatcgttaaactttga471

<210>2

<211>160

<212>prt

<213>ntsap5編碼的氨基酸序列

<400>2

metgluthralaglnargthrglulysglugluthrglutyrasnlys

151015

valvalhisglulysthrleuthrleucysvallyssercysglyval

202530

ileglyasnproalathrasnasnmetgluthrcysglnasncysser

354045

asnalaserserserlysvalalatyrprohislysphealaasnile

505560

leuthrargserthrserseraspleulyslystyrvalaspargala

65707580

vallysaspaspasplysalalysgluservalserproalalysarg

859095

gluvalasnargcysserglycysargarglysleuglyleuthrgly

100105110

pheargcysargcysglygluleuphecysglygluhisargtyrser

115120125

asparghisaspcyssertyrasptyrargthralaglyarggluala

130135140

ilealaargglnasnproleuvallysalaalalysilevallysleu

145150155160

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>正向引物

<400>3

atggctcagagaacagagaaag22

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>反向引物

<400>4

tcaaagtttaacgatcttcg20

<210>5

<211>53

<212>dna

<213>gateway反應正向引物

<400>5

ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgcatggctcagagaacagagaaag

53

<210>6

<211>50

<212>dna

<213>gateway反應反向引物

<400>6

ggggaccactttgtacaagaaagctgggtctcaaagtttaacgatcttcg50

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>ntsap5qrt正向引物

<400>7

ccaaggtcgcatatcctcat20

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>ntsap5qrt反向引物

<400>8

gccggttaatcctagcttcc20

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>26s內(nèi)參基因正向引物

<400>9

gaagaaggtcccaagggttc20

<210>10

<211>20

<212>dna

<213>26s內(nèi)參基因反向引物

<400>10

tctccctttaacaccaacgg20