本發(fā)明屬于藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及嘧啶并三氮唑類的化合物、它們的制備方法及其在以組蛋白賴氨酸特異性去甲基化酶(以下簡稱lsd1)為靶標(biāo)抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：：腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康而又難以克服的疾病，目前已經(jīng)上市的抗腫瘤藥物也有很多，但這些藥物中還是存在一些問題，比如毒性大、靶向性弱以及容易產(chǎn)生耐藥性等。因此，新型抗腫瘤藥物的研發(fā)顯得尤為重要。組蛋白共價修飾是一種重要的表觀遺傳模式，包括組蛋白乙?；?、甲基化、磷酸化以及泛素化等，其中乙酰化與甲基化是針對組蛋白修飾機制研究中比較多的組蛋白修飾方式。2004年以前組蛋白甲基化被認(rèn)為是不可逆的，賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶(lysinespecificdemethylase1，lsd1)是第一個被發(fā)現(xiàn)的可以催化組蛋白h3k4me1/2和h3k9me1/2去甲基化的特異性去甲基化酶，從而調(diào)節(jié)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。lsd1在多種腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)量顯著高于正常細(xì)胞，如神經(jīng)母細(xì)胞瘤、眼癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌等。而實驗證明，通過rnai技術(shù)或小分子抑制劑在細(xì)胞水平降低lsd1表達(dá)量或降低lsd1的活性能抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)一些細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)；在小分子單胺氧化酶抑制劑pcpa的作用下亦能抑制多種腫瘤細(xì)胞和實體瘤的生長。因此，lsd1抑制劑不僅能作為表觀遺傳學(xué)的研究工具用于闡述生物學(xué)功能，而且能作為表觀遺傳學(xué)藥物用于腫瘤的預(yù)防和治療，已經(jīng)引起科研界的廣泛關(guān)注，成為當(dāng)前研究的熱點。同時，嘧啶類及三氮唑雜環(huán)類化合物具有非常廣泛的生物活性，例如抗病毒、抗菌、抗炎以及抗腫瘤等。但是將嘧啶與三氮唑結(jié)構(gòu)結(jié)合的新的化合物與基于lsd1靶點的抗腫瘤作用結(jié)合到一起研究的報道較少，因此此類研究具有非常重要的價值。技術(shù)實現(xiàn)要素：為開發(fā)利用現(xiàn)有的臨床藥物資源，本發(fā)明目的在于提供一類以嘧啶并三氮唑為母核的衍生物，從而為尋找一類新的基于lsd1靶點的抗腫瘤藥物開辟一條新途徑；本發(fā)明另一目的在于提供其制備方法及其在制備抗腫瘤藥物和lsd1抑制劑中的應(yīng)用。為實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明所述的嘧啶并三氮唑類lsd1抑制劑的結(jié)構(gòu)通式如下：通式i中r2為c1-5直鏈烷基，c1-5支鏈烷基或者c3-5環(huán)烷基，中的任意一個，其中，r為鹵素，h，-oh，-no2，-och3，c1-4?；?，n＝1～6；mso-為甲基磺酸基，tso-為甲苯磺酸基；r1為以下幾個基團中的任意一個：c1-5直鏈烷基，c1-5支鏈烷基或者c3-5環(huán)烷基，氫原子，其中，x為氮，氧或者硫原子，r為鹵素，h，-oh，-no2，-och3，c1-4?；?，n＝1～6；r3為以下基團的任意一個：其中，r為鹵素，h，-oh，-no2，-och3，cf3，c1-4烷基或c1-4?；?。通式i中優(yōu)選：r2為c1-5直鏈烷基，c1-5支鏈烷基或者c3-5環(huán)烷基，中的任意一個；n＝1～3；r1為以下幾個基團中的任意一個：c1-5直鏈烷基，c1-5支鏈烷基或者c3-5環(huán)烷基，氫原子，其中，x為硫原子，n＝1～3；r3為以下基團的任意一個：其中，r為c1-4烷基，氯，溴，h。更優(yōu)選以下化合物之一：8:r1＝propyl-s-,9:r1＝propyl-s-,10:r1＝propyl-s-,11:r1＝propyl-s-,12:r1＝propyl-s-,13:r1＝propyl-s-,14:r1＝propyl-s-,15:r1＝propyl-s-,16:r1＝propyl-s-,17:r1＝propyl-s-,18:r1＝propyl-s-,19:r1＝propyl-s-,20:r1＝propyl-s-,21:r1＝propyl-s-,本發(fā)明所述嘧啶并三氮唑類lsd1抑制劑的制備方法，主要通過以下步驟制得：1.通式2的制備方法：溶劑中，將化合物1和溴代烴，在堿性物質(zhì)作用下，室溫下攪拌反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，過濾，洗滌，干燥，得系列化合物2。本反應(yīng)中，所用溶劑可以是丙酮、甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、四氫呋喃、乙腈、水、dmf、二氯甲烷、氯仿、二氧六環(huán)中之一或者兩種以上的混合物。所用的堿性物質(zhì)可以是三乙胺、二異丙基乙胺、吡啶、氫氧化鈉、氫氧化鉀中的一種。所述溴代烴對應(yīng)通式中r1取代基；2.通式3的制備方法：在醋酸中，加入硝化試劑，然后分批加入系列化合物2，攪拌反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，倒入水中，抽濾，洗滌，干燥，得系列化合物3。本反應(yīng)中，所述硝化試劑選發(fā)煙硝酸，濃硝酸。優(yōu)選溫度15-60℃。3.通式4的制備方法：溶劑中，加入氯化試劑，然后分批加入系列化合物3，滴加有機堿，回流反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，冷至室溫，水解，用有機溶劑萃取，水洗，中和，干燥有機相即得系列化合物4粗品(不經(jīng)進一步優(yōu)化可以直接進行下一步，純品可以經(jīng)用柱層析制得)。本反應(yīng)中，所述氯化試劑可以是三氯氧磷，五氯化磷，溶劑可以是甲苯，二氧六環(huán)，thf，乙酸乙酯等，所述有機堿可以是三乙胺、n,n-二甲基苯胺、二甲基乙酰胺(dma)、n，n-二乙基苯胺或吡啶等。優(yōu)選溫度40～120℃。4.通式5的制備方法：將系列化合物4溶于乙醇和醋酸的混合溶劑中，然后分批加入還原鐵粉，升溫回流反應(yīng)，抽濾，旋干溶劑，再用有機溶劑萃取，水洗，干燥有機相，得到系列化合物5的粗品，純品可經(jīng)柱層析制得。5.通式6的制備方法：將系列化合物5和胺類化合物溶于溶劑中，再加入有機堿，回流反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，蒸干溶劑，加入乙酸乙酯，水洗，干燥有機相，得到系列化合物6的粗品(不經(jīng)進一步純化直接用于下一步反應(yīng))。本反應(yīng)中，反應(yīng)所用溶劑可以是甲醇，乙醇，異丙醇，dmf，二氧六環(huán)，thf，乙腈等，所述有機堿可以是三乙胺，吡啶或二異丙基乙胺等。優(yōu)選反應(yīng)溫度是60～120℃。所述的胺類化合物對應(yīng)通式中r2取代基；6.通式7的制備方法：將系列化合物6溶于醋酸和水的混合液中，冰浴下滴加亞硝酸鈉的水溶液反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，加入乙酸乙酯和水，分層，水洗，中和，干燥有機相，得系列化合物7粗品，不經(jīng)進一步純化直接進行下一步反應(yīng)。7.通式中化合物8～21的制備方法：將系列化合物7和巰基芳環(huán)類化合物溶于溶劑中，加入縛酸劑，室溫或回流反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，蒸干溶劑，溶于乙酸乙酯，用水洗，干燥，過柱，流動相為不同比例的石油醚和乙酸乙酯。本反應(yīng)中，所述溶劑為甲醇，乙醇，異丙醇，thf，乙腈，dmf，二氧六環(huán)等，縛酸劑為三乙胺，吡啶，異丙基乙胺等。優(yōu)選反應(yīng)溫度為20～100℃。本發(fā)明所述的嘧啶并三氮唑類衍生物，通過lsd1酶活性實驗發(fā)現(xiàn)對lsd1有很好的抑制作用。因此，本發(fā)明提供的嘧啶并三氮類衍生物為開發(fā)新型抗腫瘤藥物、藥物的聯(lián)合用藥以及新型lsd1抑制劑藥物開辟了另一有效途徑，此類化合物的合成設(shè)計合理，反應(yīng)條件溫和，操作簡單，反應(yīng)收率高，總收率達(dá)60％以上，若開發(fā)成為新藥將有良好的市場應(yīng)用前景。具體實施方式為了對本發(fā)明進行更好的說明，特舉實施例如下：實施例1化合物8，r1＝propyl-s-,的制備(1)化合物2(r1＝propyl-s-)的制備將巴比妥酸(3g，1eq)和三乙胺(2.9ml，1eq)加到30ml的甲醇中，加熱回流下，緩慢滴加溴丙烷(1.8ml,1eq)，加完后繼續(xù)回流1小時，冷卻，抽濾，得到3.7g粉色固體化合物2b，產(chǎn)率97％。(2)化合物3(r1＝propyl-s-)的制備冰浴下，將3ml的發(fā)煙硝酸小心溶于6ml的醋酸中，然后分批加入2.9g化合物2b，加完后，繼續(xù)攪拌2小時，然后將反應(yīng)液加到18ml的冰水中，抽濾，水洗，得到暗紅色的粉末化合物3b，產(chǎn)率77.5％。(3)化合物4(r1＝propyl-s-)的制備將化合物3b(12.4g，1eq)，溶于50ml的三氯氧磷中，緩慢滴加dma(12ml，1.8eq)，然后升溫至回流，反應(yīng)5小時。冷至室溫，水解，然后用ea萃取，水洗，再用飽和的碳酸鈉溶液洗滌，有機相干燥后，即得棕色化合物4b粗品13g，產(chǎn)率90.2％。(4)化合物5(r1＝propyl-s-)的制備將化合物4b(0.5g,1eq)溶于4ml的甲醇和2ml的醋酸中，然后分批加入還原鐵粉(0.3g,3eq),回流2小時，冷至室溫，抽濾，濾液蒸干，溶于乙酸乙酯，用飽和的碳酸鈉溶液洗滌，水洗，干燥有機相，蒸干后得0.44g化合物5b粗品，產(chǎn)率95％。(5)化合物6(r1＝propyl-s-，)的制備將化合物5b(3.9g,1eq),乙醇胺(1.0g，1eq)和三乙胺(3ml,1.3eq)溶于乙醇中，回流48小時，蒸干溶劑，溶于乙酸乙酯，然后用稀鹽酸中和至中性，水洗三次，干燥，蒸干后得化合物6b粗品，不經(jīng)進一步純化，直接進行下一步。(6)化合物7(r1＝propyl-s-，)的制備將上步化合物6的粗品溶于醋酸和水的混合液中，0℃冰浴下，滴加亞硝酸鈉(1.13g,1eq)的水溶液，保持溫度不超于10℃，然后繼續(xù)攪拌反應(yīng)1小時，將反應(yīng)液溶于乙酸乙酯中，用水洗三次，然后再用飽和的碳酸氫鈉溶液中和至中性，水洗，干燥有機相，蒸干后得到化合物7b粗品，不經(jīng)純化直接進行下一步。(7)化合物8的制備將中間體化合物7b(100mg,1eq)、巰基苯并噻唑(61mg,1eq)和三乙胺(37mg,1eq)溶于乙醇中，加熱至回流數(shù)小時，用tlc(pe/ea)監(jiān)測反應(yīng)，結(jié)束后蒸干溶劑，溶于乙酸乙酯，水洗，干燥，過柱，得白色固體89mg，產(chǎn)率60％。1hnmr(400mhz,dmso-d6,ppm):δ8.23-8.25(d,j＝7.6hz,1h),8.10-8.12(d,j＝8.0hz,1h),7.55-7.63(m,2h),4.95-4.97(t,j＝5.8hz,1h),4.64-4.67(t,j＝5.4hz,2h),3.92-3.96(m,2h),2.95-2.99(t,j＝7.0hz,2h),1.48-1.57(m,2h),0.77-0.80(t,j＝7.4hz,3h).13cnmr(100mhz,dmso-d6,ppm):δ169.45,159.12,155.22,152.07,149.55,137.35,131.15,127.31,126.72,123.39,122.66,59.26,50.35,33.09,22.33,13.44.。實施例2化合物9，r1＝propyl-s-,的制備甲磺酰氯保護的羥基乙胺代替乙醇胺，采取實施例7同樣的方法制備9.1hnmr(400mhz,cdcl3,ppm):δ8.12-8.14(d,j＝8.0hz,1h),7.97-7.99(d,j＝7.6hz,1h),7.55-7.59(m,1h),7.49-7.53(m,1h),4.95-4.97(t,j＝5.2hz,2h),4.79-4.81(t,j＝5.2hz,2h),3.00(s,3h),1.57-1.62(m,2h),0.85-0.89(t,j＝7.4hz,3h).13cnmr(100mhz,cdcl3,ppm):δ171.34,160.36,154.99,152.17,149.24,137.33,131.06,126.62,126.08,123.47,121.31,65.21,46.06,37.95,33.50,22.17,13.26.。產(chǎn)率70％。實施例3化合物10，r1＝propyl-s-,的制備苯甲?；Ｗo的羥基乙胺代替乙醇胺，采取實施例7同樣的方法制備10.1hnmr(400mhz,cdcl3,ppm):δ8.11-8.13(d,j＝8.0hz,1h),7.96-7.98(d,j＝7.6hz,1h),7.91-7.94(m,2h),7.54-7.58(m,2h),7.48-7.52(m,1h),7.40-7.44(m,2h),5.02-5.05(t,j＝5.2hz,2h),4.83-4.85(t,j＝5.2hz,2h),2.87-2.90(t,j＝7.2hz,2h),1.50-1.59(m,2h),0.83-0.86(t,j＝7.4hz,3h).13cnmr(100mhz,cdcl3,ppm):δ171.04,166.04,160.02,155.33,152.08,149.33,137.23,133.37,131.01,129.75,129.20,128.50,126.57,125.99,123.40,121.26,62.34,46.12,33.32,22.12,13.27.。產(chǎn)率63％。實施例4化合物11，r1＝propyl-s-,的制備用甘二醇胺代替乙醇胺，采取實施例7同樣的方法制備11.1hnmr(400mhz,cdcl3,ppm):δ8.08-8.10(d,j＝8.0hz,1h),7.94-7.96(d,j＝8.0hz,1h),7.52-7.56(m,1h),7.45-7.49(m,1h),4.78-4.81(t,j＝5.2hz,2h),4.03-4.06(t,j＝5.2hz,2h),3.65(m,2h),3.58-3.60(t,j＝4.2hz,2h),2.91-2.95(t,j＝7.4hz,2h),1.52-1.58(m,2h),0.80-0.84(t,j＝7.4hz,3h).13cnmr(100mhz,cdcl3,ppm):δ170.83,160.15,155.16,152.20,149.21,137.36,131.09,126.58,126.04,123.45,121.28,72.57,68.65,61.61,46.90,33.47,22.19,13.24.。產(chǎn)率65％。實施例5化合物12，r1＝propyl-s-,的制備用對甲苯磺酰基保護的甘二醇胺代替乙醇胺，采取實施例7同樣的方法制備12.1hnmr(400mhz,cdcl3,ppm):δ8.10-8.12(d,j＝8.0hz,1h),7.95-7.97(d,j＝7.6hz,1h),7.73-7.75(d,j＝8.4hz,2h),7.53-7.57(m,1h),7.46-7.50(m,1h),7.32-7.34(d,j＝8.4hz,2h),4.70-4.73(t,j＝5.6hz,2h),4.05-4.08(t,j＝4.6hz,2h),3.99-4.02(t,j＝5.6hz,2h),3.64-3.66(t,j＝4.6hz,2h),2.96-3.00(t,j＝7.2hz,2h),2.44(s,3h),1.56-1.64(m,2h),1.24-1.28(t,j＝7.2hz,3h).13cnmr(100mhz,cdcl3,ppm):δ170.72,159.91,155.39,152.15,149.21,144.94,137.30,131.03,129.88,127.90,126.54,125.97,123.42,121.26,68.88,68.86,68.55,68.41,46.49,33.47,22.21,13.27.。產(chǎn)率72％。實施例6化合物13，r1＝propyl-s-,的制備用糠胺代替乙醇胺，采取實施例7同樣的方法制備13.1hnmr(400mhz,cdcl3,ppm):δ8.08-8.10(d,j＝8.0hz,1h),7.94-7.96(d,j＝8.0hz,1h),7.52-7.56(m,1h),7.46-7.49(m,1h),7.36-7.37(d,j＝1.2hz,1h),6.48-6.49(d,j＝3.2hz,1h),6.35-6.36(m,1h),5.76(s,2h),3.00-3.03(t,j＝7.4hz,2h),1.61-1.66(m,2h),0.89-0.93(t,j＝7.4hz,3h).13cnmr(100mhz,cdcl3,ppm):δ170.86,159.80,155.56,151.99,148.69,147.10,143.40,137.14,130.94,126.51,125.90,123.33,121.24,110.77,110.26,43.34,33.45,22.24,13.36.。產(chǎn)率61％。實施例7化合物14，r1＝propyl-s-,的制備用異丙胺代替乙醇胺，采取實施例7同樣的方法制備14.1hnmr(400mhz,cdcl3,ppm):δ8.10-8.12(d,j＝8.4hz,1h),7.96-7.98(d,j＝8.0hz,1h),7.53-7.57(m,1h),7.47-7.50(m,1h),5.17-5.23(m,1h),3.01-3.05(t,j＝7.2hz,2h),1.74-1.76(d,j＝6.8hz,6h),1.61-1.70(m,2h),0.90-0.94(t,j＝7.4hz,3h).13cnmr(100mhz,cdcl3,ppm):δ169.85,159.59,155.77,151.99,148.24,137.14,131.41,126.50,125.87,123.31,121.24,51.52,33.43,22.28,21.94,13.35.。產(chǎn)率60％。實施例8化合物15，r1＝propyl-s-,的制備用巰基苯并噁唑代替巰基苯并噻唑，采取實施例7同樣的方法制備15.1hnmr(400mhz,dmso-d6,ppm):δ7.92-7.94(d,j＝8.0hz,1h),7.86-7.88(d,j＝8.0hz,1h),7.56-7.60(m,1h),7.50-7.54(m,1h),4.95(br,1h),4.61-4.63(t,j＝5.4hz,2h),3.89-3.93(m,2h),2.76-2.79(t,j＝7.2hz,2h),1.33-1.42(m,2h),0.67-0.71(t,j＝7.4hz,3h).13cnmr(100mhz,dmso-d6,ppm):δ169.51,160.03,153.67,152.79,149.94,141.77,131.46,127.52,125.78,120.93,111.76,59.23,50.35,33.13,22.10,13.22.。產(chǎn)率66％。實施例9化合物16，r1＝propyl-s-,的制備用巰基嘧啶代替巰基苯并噻唑，采取實施例7同樣的方法制備16.1hnmr(400mhz,dmso-d6,ppm):δ8.85-8.86(d,j＝4.8hz,2h),7.58-7.60(t,j＝4.8hz,1h),4.98(br,1h),4.62-4.65(t,j＝5.4hz,2h),3.93-3.94(m,2h),3.02-3.04(t,j＝7.0hz,2h),1.58-1.67(m,2h),0.91-0.95(t,j＝7.2hz,3h).13cnmr(100mhz,dmso-d6,ppm):δ169.52,165.21,160.78,159.51,149.96,132.73,121.32,59.19,50.28,33.14,22.38,13.63.。產(chǎn)率71％。實施例10化合物17，r1＝propyl-s-,的制備用2-巰基-1,3,4-噻二唑代替巰基苯并噻唑，采取實施例7同樣的方法制備17.1hnmr(400mhz,dmso-d6,ppm):δ9.96(s,1h),4.94-4.97(t,j＝6.0hz,1h),4.65-4.67(t,j＝5.4hz,2h),3.92-3.96(m,2h),3.03-3.07(t,j＝7.2hz,2h),1.58-1.67(m,2h),0.93-0.97(t,j＝7.4hz,3h).13cnmr(100mhz,dmso-d6,ppm):δ169.48,159.38,158.04,155.12,149.59,131.18,59.25,50.38,33.12,22.36,13.63.。產(chǎn)率70％。實施例11化合物18，r1＝propyl-s-,的制備用2-氨基-5-巰基-1,3,4-噻二唑代替巰基苯并噻唑，采取實施例7同樣的方法制備18.1hnmr(400mhz,dmso-d6,ppm):δ7.79(s,1h),4.90-4.93(t,j＝5.8hz,1h),4.62-4.64(t,j＝5.4hz,2h),3.90-3.94(m,2h),3.03-3.07(t,j＝7.2hz,2h),1.58-1.67(m,2h),0.94-0.97(t,j＝7.4hz,3h).13cnmr(100mhz,dmso-d6,ppm):δ173.62,168.96,160.34,149.11,138.42,130.82,58.77,49.78,32.78,22.13,13.09.。產(chǎn)率65％。實施例12化合物19，r1＝propyl-s-,的制備用2-巰基-5-甲基-1,3,4-噻二唑代替巰基苯并噻唑，采取實施例7同樣的方法制備19.1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.29(d,j＝1.2hz,1h),7.25(d,j＝1.3hz,1h),4.71-4.73(m,2h),4.17(m,2h),3.73(s,3h),2.89-2.93(m,2h),1.62-1.65(m,2h),0.97-1.00(t,j＝7.4hz,3h).13cnmr(100mhz,cdcl3)δ174.95,167.39,154.15,136.25,136.12,135.73,129.97,64.56,54.53,38.84,38.15,27.01,18.12.。產(chǎn)率69％。實施例13化合物20，r1＝propyl-s-,的制備用2-巰基噻唑代替巰基苯并噻唑，采取實施例7同樣的方法制備20.1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.02(d,j＝3.4hz,1h),7.68(d,j＝3.4hz,1h),4.74-4.77(m,2h),4.17-4.21(m,2h),2.97-3.00(t,j＝6.7hz,2h),1.64-1.69(m,2h),0.98-1.02(t,j＝7.3hz,3h).13cnmr(100mhz,cdcl3)δ170.27,160.66,152.04,149.15,143.59,131.03,125.00,59.98,49.91,33.32,22.23,13.37.。產(chǎn)率62％。實施例14化合物21，r1＝propyl-s-,的制備用甲巰咪唑代替巰基苯并噻唑，采取實施例7同樣的方法制備21，1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.29(d,j＝1.2hz,1h),7.25(d,j＝1.3hz,1h),4.71-4.73(m,2h),4.17(m,2h),3.73(s,3h),2.89-2.93(d,j＝7.2hz,2h),1.62-1.65(m,2h),0.97-1.00(t,j＝7.4hz,3h).13cnmr(100mhz,cdcl3)δ174.95,167.39,154.15,136.25,136.12,135.73,129.97,64.56,54.53,38.84,38.15,27.01,18.12.。產(chǎn)率68％。實施例15上述化合物的lsd1抑制活性測定：1.實驗方法：樣品為實施例所合成的上述化合物、純化而得；樣品儲備液：稱取3-5mg樣品置于1.5mlep管中，然后用dmso配制成濃度是20mm的溶液，4℃保存放置，實驗時根據(jù)所需濃度用dmso稀釋。將待測樣品與lsd1蛋白于室溫孵育后，加入lsd1反應(yīng)底物h3k4me2并孵育反應(yīng)，最后加入熒光染料amplex和辣根過氧化酶hrp室溫孵育，在酶標(biāo)儀上激發(fā)光530nm，發(fā)射光590nm檢測熒光數(shù)值:試驗結(jié)果采用spss軟件計算ic50值。實驗結(jié)果如下所示。table1.上述化合物8～21對lsd1的抑制活性數(shù)據(jù):當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12