本發(fā)明屬于高分子化學(xué)與生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，尤其涉及一種納米復(fù)合物及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

陽(yáng)離子聚合物載體是非病毒載體中的重要一類，此類材料能夠通過靜電相互作用和帶負(fù)電荷的核酸分子相結(jié)合，確保核酸分子在輸送過程中的完整性。相對(duì)于病毒載體，非病毒載體的發(fā)展面對(duì)的一個(gè)主要挑戰(zhàn)就是：如何提高轉(zhuǎn)染效率。

溶酶體逃逸是基于陽(yáng)離子載體的核酸輸送效率提高的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。一般情況下，如果細(xì)胞內(nèi)吞的納米顆粒物轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體中，將面臨被溶酶體水解酶降解的危險(xiǎn)。因此如果polyplexes細(xì)胞內(nèi)化轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體中時(shí)，必須設(shè)法突破溶酶體膜的屏障，盡早地實(shí)現(xiàn)溶酶體逃逸。當(dāng)前陽(yáng)離子聚合物核酸載體材料聚乙烯胺(pei)被公認(rèn)為基因轉(zhuǎn)染的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”，主要是由于pei具有較強(qiáng)的“質(zhì)子海綿”效應(yīng)，能夠有效的實(shí)現(xiàn)溶酶體逃逸，獲得較高的轉(zhuǎn)染水平。在生理ph7.4條件下，pei只有15～20％的氨基可以被質(zhì)子化；但在溶酶體通路中，隨著ph的降低，pei上氨基的質(zhì)子化程度顯著提高，導(dǎo)致納米復(fù)合物的表面正電荷密度上升，對(duì)溶酶體膜的擾動(dòng)作用增強(qiáng)。同時(shí)，由于質(zhì)子化過程引起大量質(zhì)子和氯離子的流入，提高了溶酶體內(nèi)的滲透壓，進(jìn)一步降低了溶酶體膜的穩(wěn)定性，有助于納米復(fù)合物實(shí)現(xiàn)溶酶體逃逸和轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞的表達(dá)效率。

除了質(zhì)子海綿效應(yīng)外，光化學(xué)內(nèi)化(photochemicalinternalization，pci)技術(shù)也是一個(gè)輔助大分子及納米粒子實(shí)現(xiàn)溶酶體逃逸的有效策略。pci技術(shù)基于光動(dòng)力學(xué)治療(photodynamictherapy，pdt)的原理，通過使用光、氧氣和光敏劑相互作用促進(jìn)大分子及納米粒子的溶酶體逃逸。通常，pci策略是通過納米復(fù)合物體系中引入卟啉、酞菁等具有強(qiáng)光誘導(dǎo)單線態(tài)氧產(chǎn)生能力的光敏劑，從而增強(qiáng)溶酶體膜的通透性，提高納米粒子的細(xì)胞質(zhì)釋放率。

共軛聚電解質(zhì)材料(conjugatedpolyelectrolyte，cpe)是一類具有由不飽和鍵和單鍵交替排列而成的主鏈和離子化側(cè)鏈的聚合物，同時(shí)具備獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)及良好的親水性，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域受到研究者們的青睞。例如，陽(yáng)離子聚噻吩(cationicpolythiophene，cpt)是一類易于制備、生物兼容性良好、光學(xué)性質(zhì)優(yōu)異的共軛聚電解質(zhì)材料，在細(xì)胞分化、生物傳感器、熒光探針、熒光成像、仿生人造器官等生物領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。類似的，陽(yáng)離子聚苯撐乙炔(cationicpoly(phenyleneethynylene)，cppe)也被應(yīng)用于生物傳感、熒光成像、抗菌等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。cpe一般具有對(duì)氧分子的光敏化能力。

通常，陽(yáng)離子聚合物載體材料往往需要相對(duì)較高的核酸用量以及較多的聚合物過量使用(96孔板中，劑量一般為5μg/ml或以上，n/p一般為10或以上；n/p越高，意味著載體材料用量越大)，既不經(jīng)濟(jì)，也不安全。眾所周知，使用過多的載體材料是引起細(xì)胞毒性最主要的原因。但是在陽(yáng)離子聚合物載體體系中存在的普遍問題是，一旦降低聚合物和核酸分子的用量，就會(huì)導(dǎo)致核酸輸送效率嚴(yán)重偏低的不利結(jié)果。

因此，在聚合物載體材料和核酸分子用量雙降的前提下，采取新的聚合物載體體系構(gòu)建策略，開發(fā)核酸輸送的有效增強(qiáng)方法，將使聚合物載體材料在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域具有更廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：本發(fā)明的第一目的是提供一種能夠在低質(zhì)粒和聚合物用量的條件下有效增強(qiáng)核酸轉(zhuǎn)運(yùn)效率的納米復(fù)合物；

本發(fā)明的第二目的是提供該復(fù)合物的制備方法；

本發(fā)明的第三目的是提供該復(fù)合物的應(yīng)用。

技術(shù)方案：本發(fā)明的納米復(fù)合物，包括：陽(yáng)離子聚合物載體、核酸分子及共軛聚電解質(zhì)；其中，共軛聚電解質(zhì)及陽(yáng)離子聚合物載體的正電荷總和與核酸分子的負(fù)電荷之比為1～20:1，共軛聚電解質(zhì)與陽(yáng)離子聚合物載體的正電荷之比為0.01～10％。

本發(fā)明添加微量共軛聚電解質(zhì)，通過共軛聚電解質(zhì)材料的光敏化產(chǎn)生ros的作用，增強(qiáng)溶酶體膜通透性的改變、輔助納米復(fù)合物的溶酶體逃逸。

進(jìn)一步說，所述陽(yáng)離子聚合物載體包括聚氨基酸衍生物、聚糖衍生物或聚酰胺衍生物。優(yōu)選的，聚氨基酸衍生物為可降解陽(yáng)離子星形聚天冬酰胺載體材料，其由聚天冬酰胺主鏈和二乙烯三胺側(cè)鏈構(gòu)成，結(jié)構(gòu)式如下所示：

其中，n＝20～500。

再進(jìn)一步說，所述共軛聚電解質(zhì)包括陽(yáng)離子聚噻吩、陽(yáng)離子聚苯撐乙炔、陽(yáng)離子聚芴、陽(yáng)離子聚苯撐乙烯或陽(yáng)離子聚電解質(zhì)共聚物。優(yōu)選的，陽(yáng)離子聚噻吩為陽(yáng)離子線形聚噻吩或陽(yáng)離子支化聚噻吩。其中，陽(yáng)離子線形聚噻吩的結(jié)構(gòu)式為：

n＝10～250，

r為

陽(yáng)離子支化聚噻吩的結(jié)構(gòu)式為：

其中，m/n＝1/10～1/100，n＝10～250，

r為

優(yōu)選的，陽(yáng)離子聚苯撐乙炔的結(jié)構(gòu)式為：

其中，n＝10～250。

本發(fā)明制備納米復(fù)合材料的方法，包括如下步驟：將陽(yáng)離子聚合物載體與核酸分子混合，加入共軛聚電解質(zhì)，靜置10～60min，得到多組份納米復(fù)合物。

本發(fā)明所述的納米復(fù)合物應(yīng)用于增強(qiáng)核酸的輸送。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)為：通過在聚合物載體及核酸分子體系基礎(chǔ)上，引入微量共軛聚電解質(zhì)材料，形成該納米復(fù)合物，采用非共價(jià)組裝途徑對(duì)納米復(fù)合物表面進(jìn)行功能化改造，不僅穩(wěn)定性強(qiáng)，且應(yīng)用于核酸的輸送中，在光照或非光照條件下均能夠增強(qiáng)溶酶體膜的滲透性，幫助納米復(fù)合物實(shí)現(xiàn)溶酶體逃逸，不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成顯著損傷，增強(qiáng)基因輸送及核酸轉(zhuǎn)運(yùn)效率，滿足基因輸送安全高效的要求；同時(shí)，其制備方法設(shè)計(jì)合理，制備過程簡(jiǎn)單，大幅減少載體材料的使用量，具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為多組份納米復(fù)合物體系修飾增強(qiáng)核酸輸送的示意圖；

圖2a為陽(yáng)離子線性聚噻吩的制備工藝流程圖；

圖2b為陽(yáng)離子支化聚噻吩的制備工藝流程圖；

圖3a為lptm和bptm在cdcl3中的1hnmr表征圖；

圖3b為lpt和bpt在cdcl3中的1hnmr表征圖；

圖3c為脂溶性線性/支化聚噻吩的gpc表征，thf為流動(dòng)相圖；

圖3d為脂溶性線性/支化聚噻吩由gpc測(cè)試結(jié)果計(jì)算得出的分子量和pdi圖；

圖4為陽(yáng)離子聚噻吩構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物的尺寸和表面電勢(shì)圖；

圖5為陽(yáng)離子聚噻吩構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物的eb競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)圖；

圖6為陽(yáng)離子線性/支化聚噻吩構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物對(duì)hepg2細(xì)胞作用24h的細(xì)胞毒性圖；

圖7a為無光照條件下，陽(yáng)離子星形聚天冬酰胺載體材料(sp)在hela細(xì)胞內(nèi)引起的光誘導(dǎo)ros檢測(cè)結(jié)果圖；

圖7b為以dcfh-da為ros熒光成像探針，光照條件下，陽(yáng)離子星形聚天冬酰胺載體材料(sp)在hela細(xì)胞內(nèi)引起的光誘導(dǎo)ros檢測(cè)結(jié)果圖；

圖8a為無光照條件下，聚乙烯胺載體材料(pei)在hela細(xì)胞內(nèi)引起的光誘導(dǎo)ros檢測(cè)結(jié)果圖；

圖8b為以dcfh-da為ros熒光成像探針，光照條件下，聚乙烯胺載體材料(pei)在hela細(xì)胞內(nèi)引起的光誘導(dǎo)ros檢測(cè)結(jié)果圖；

圖9a為無光照條件下，5％的陽(yáng)離子支化聚噻吩(cbptm-1)構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物在hela細(xì)胞內(nèi)引起的光誘導(dǎo)ros檢測(cè)結(jié)果圖；

圖9b為以dcfh-da為ros熒光成像探針，光照條件下，5％的陽(yáng)離子支化聚噻吩(cbptm-1)構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物在hela細(xì)胞內(nèi)引起的光誘導(dǎo)ros檢測(cè)結(jié)果圖；

圖10a為無光照條件下，2.5％的陽(yáng)離子支化聚噻吩(cbptm-1)構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物在hela細(xì)胞內(nèi)引起的光誘導(dǎo)ros檢測(cè)結(jié)果圖；

圖10b為以dcfh-da為ros熒光成像探針，光照條件下，2.5％的陽(yáng)離子支化聚噻吩(cbptm-1)構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物在hela細(xì)胞內(nèi)引起的光誘導(dǎo)ros檢測(cè)結(jié)果圖；

圖11a為無光照條件下，5％的陽(yáng)離子線性聚噻吩(clptm)構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物在hela細(xì)胞內(nèi)引起的光誘導(dǎo)ros檢測(cè)結(jié)果圖；

圖11b為以dcfh-da為ros熒光成像探針，光照條件下，5％的陽(yáng)離子線性聚噻吩(clptm)構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物在hela細(xì)胞內(nèi)引起的光誘導(dǎo)ros檢測(cè)結(jié)果圖；

圖12a為無光照條件下，2.5％的陽(yáng)離子線性聚噻吩(clptm)構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物在hela細(xì)胞內(nèi)引起的光誘導(dǎo)ros檢測(cè)結(jié)果圖；

圖12b為以dcfh-da為ros熒光成像探針，光照條件下，2.5％的陽(yáng)離子線性聚噻吩(clptm)構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物在hela細(xì)胞內(nèi)引起的光誘導(dǎo)ros檢測(cè)結(jié)果圖；

圖13a為無光照條件下，5％的陽(yáng)離子線性聚噻吩(clpt-1)構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物在hela細(xì)胞內(nèi)引起的光誘導(dǎo)ros檢測(cè)結(jié)果圖；

圖13b為以dcfh-da為ros熒光成像探針，光照條件下，5％的陽(yáng)離子線性聚噻吩(clpt-1)構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物在hela細(xì)胞內(nèi)引起的光誘導(dǎo)ros檢測(cè)結(jié)果圖；

圖14a為無光照條件下，2.5％的陽(yáng)離子線性聚噻吩(clpt-1)構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物在hela細(xì)胞內(nèi)引起的光誘導(dǎo)ros檢測(cè)結(jié)果圖；

圖14b為以dcfh-da為ros熒光成像探針，光照條件下，2.5％的陽(yáng)離子線性聚噻吩(clpt-1)構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物在hela細(xì)胞內(nèi)引起的光誘導(dǎo)ros檢測(cè)結(jié)果圖；

圖15a為無光照條件下，5％的陽(yáng)離子支化聚噻吩(cbpt-1)構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物在hela細(xì)胞內(nèi)引起的光誘導(dǎo)ros檢測(cè)結(jié)果圖；

圖15b為以dcfh-da為ros熒光成像探針，光照條件下，5％的陽(yáng)離子支化聚噻吩(cbpt-1)構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物在hela細(xì)胞內(nèi)引起的光誘導(dǎo)ros檢測(cè)結(jié)果圖；

圖16a為無光照條件下，2.5％的陽(yáng)離子支化聚噻吩(cbpt-1)構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物在hela細(xì)胞內(nèi)引起的光誘導(dǎo)ros檢測(cè)結(jié)果圖；

圖16b為以dcfh-da為ros熒光成像探針，光照條件下，2.5％的陽(yáng)離子支化聚噻吩(cbpt-1)構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物在hela細(xì)胞內(nèi)引起的光誘導(dǎo)ros檢測(cè)結(jié)果圖；

圖17a為無光照條件下，hela在無血清培養(yǎng)基中與聚乙烯胺載體材料(pei)共育5h后，在綠色通道的溶酶體通透性檢測(cè)結(jié)果圖；

圖17b為無光照條件下，hela在無血清培養(yǎng)基中與聚乙烯胺載體材料(pei)共育5h后，在紅色通道的溶酶體通透性檢測(cè)結(jié)果圖；

圖17c為無光照條件下，hela在無血清培養(yǎng)基中與聚乙烯胺載體材料(pei)共育5h后，在合并通道的溶酶體通透性檢測(cè)結(jié)果圖；

圖17d為光照條件下，hela在無血清培養(yǎng)基中與聚乙烯胺載體材料(pei)共育5h后，在綠色通道的溶酶體通透性檢測(cè)結(jié)果圖；

圖17e為光照條件下，hela在無血清培養(yǎng)基中與聚乙烯胺載體材料(pei)共育5h后，在紅色通道的溶酶體通透性檢測(cè)結(jié)果圖；

圖17f為光照條件下，hela在無血清培養(yǎng)基中與聚乙烯胺載體材料(pei)共育5h后，在合并通道的溶酶體通透性檢測(cè)結(jié)果圖；

圖18a為無光照條件下，hela在無血清培養(yǎng)基中與陽(yáng)離子星形聚天冬酰胺載體材料(sp)共育5h后，在綠色通道的溶酶體通透性檢測(cè)結(jié)果圖；

圖18b為無光照條件下，hela在無血清培養(yǎng)基中與陽(yáng)離子星形聚天冬酰胺載體材料(sp)共育5h后，在紅色通道的溶酶體通透性檢測(cè)結(jié)果圖；

圖18c為無光照條件下，hela在無血清培養(yǎng)基中與陽(yáng)離子星形聚天冬酰胺載體材料(sp)共育5h后，在合并通道的溶酶體通透性檢測(cè)結(jié)果圖；

圖18d為光照條件下，hela在無血清培養(yǎng)基中與陽(yáng)離子星形聚天冬酰胺載體材料(sp)共育5h后，在綠色通道的溶酶體通透性檢測(cè)結(jié)果圖；

圖18e為光照條件下，hela在無血清培養(yǎng)基中與陽(yáng)離子星形聚天冬酰胺載體材料(sp)共育5h后，在紅色通道的溶酶體通透性檢測(cè)結(jié)果圖；

圖18f為光照條件下，hela在無血清培養(yǎng)基中與陽(yáng)離子星形聚天冬酰胺載體材料(sp)共育5h后，在合并通道的溶酶體通透性檢測(cè)結(jié)果圖；

圖19a為無光照條件下，hela在無血清培養(yǎng)基中與陽(yáng)離子線性聚噻吩(clpt-2)共育5h后，在綠色通道的溶酶體通透性檢測(cè)結(jié)果圖；

圖19b為無光照條件下，hela在無血清培養(yǎng)基中與陽(yáng)離子線性聚噻吩(clpt-2)共育5h后，在紅色通道的溶酶體通透性檢測(cè)結(jié)果圖；

圖19c為無光照條件下，hela在無血清培養(yǎng)基中與陽(yáng)離子線性聚噻吩(clpt-2)共育5h后，在合并通道的溶酶體通透性檢測(cè)結(jié)果圖；

圖19d為光照條件下，hela在無血清培養(yǎng)基中與陽(yáng)離子線性聚噻吩(clpt-2)共育5h后，在綠色通道的溶酶體通透性檢測(cè)結(jié)果圖；

圖19e為光照條件下，hela在無血清培養(yǎng)基中與陽(yáng)離子線性聚噻吩(clpt-2)共育5h后，在紅色通道的溶酶體通透性檢測(cè)結(jié)果圖；

圖19f為無光照條件下，hela在無血清培養(yǎng)基中與陽(yáng)離子線性聚噻吩(clpt-2)共育5h后，在合并通道的溶酶體通透性檢測(cè)結(jié)果圖；

圖20為陽(yáng)離子線性/支化聚噻吩與sp構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物對(duì)hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)luciferase的質(zhì)粒pluci40h的轉(zhuǎn)染情況圖；

圖21a為bpei在無光照條件下對(duì)hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)綠色熒光蛋白的質(zhì)粒pgfp40h的轉(zhuǎn)染情況圖；

圖21b為bpei在光照條件下對(duì)hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)綠色熒光蛋白的質(zhì)粒pgfp40h的轉(zhuǎn)染情況圖；

圖22a為sp在無光照條件下對(duì)hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)綠色熒光蛋白的質(zhì)粒pgfp40h的轉(zhuǎn)染情況圖；

圖22b為sp在光照條件下對(duì)hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)綠色熒光蛋白的質(zhì)粒pgfp40h的轉(zhuǎn)染情況圖；

圖23a為0.1％的陽(yáng)離子聚苯撐乙炔(pim-1)構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物在無光照條件下對(duì)hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)綠色熒光蛋白的質(zhì)粒pgfp40h的轉(zhuǎn)染情況圖；

圖23b為0.1％的陽(yáng)離子聚苯撐乙炔(pim-1)構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物在光照條件下對(duì)hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)綠色熒光蛋白的質(zhì)粒pgfp40h的轉(zhuǎn)染情況圖；

圖24a為0.25％的陽(yáng)離子聚苯撐乙炔(pim-1)構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物在無光照條件下對(duì)hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)綠色熒光蛋白的質(zhì)粒pgfp40h的轉(zhuǎn)染情況圖；

圖24b為0.25％的陽(yáng)離子聚苯撐乙炔(pim-1)構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物在光照條件下對(duì)hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)綠色熒光蛋白的質(zhì)粒pgfp40h的轉(zhuǎn)染情況圖；

圖25a為0.5％的陽(yáng)離子聚苯撐乙炔(pim-1)構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物在無光照條件下對(duì)hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)綠色熒光蛋白的質(zhì)粒pgfp40h的轉(zhuǎn)染情況圖；

圖25b為0.5％的陽(yáng)離子聚苯撐乙炔(pim-1)構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物在光照條件下對(duì)hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)綠色熒光蛋白的質(zhì)粒pgfp40h的轉(zhuǎn)染情況圖；

圖26a為1％的陽(yáng)離子聚苯撐乙炔(pim-1)構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物在無光照條件下對(duì)hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)綠色熒光蛋白的質(zhì)粒pgfp40h的轉(zhuǎn)染情況圖；

圖26b為1％的陽(yáng)離子聚苯撐乙炔(pim-1)構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物在光照條件下對(duì)hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)綠色熒光蛋白的質(zhì)粒pgfp40h的轉(zhuǎn)染情況圖；

圖27為無光照條件下，陽(yáng)離子聚苯撐乙炔(pim-1、pim-2)與sp構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物對(duì)hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)luciferase的質(zhì)粒pluci40h的轉(zhuǎn)染情況圖，bpei和sp的轉(zhuǎn)染情況作為對(duì)照。

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說明。

本發(fā)明的納米復(fù)合物，包括：陽(yáng)離子聚合物載體、核酸分子及共軛聚電解質(zhì)；其中，共軛聚電解質(zhì)及陽(yáng)離子聚合物載體的正電荷總和與核酸分子的負(fù)電荷之比為1～20:1，共軛聚電解質(zhì)與陽(yáng)離子聚合物載體的正電荷之比為0.01～10％。

其中，陽(yáng)離子聚合物載體包括聚氨基酸衍生物、聚糖衍生物或聚酰胺衍生物等。具體而言，陽(yáng)離子聚合物載體包括骨架及側(cè)鏈，其中，陽(yáng)離子聚合物載體的骨架包括聚氨基酸、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚降冰片烯、聚乙烯胺、聚糖、聚酰胺、或基于上述骨架結(jié)構(gòu)的共聚物等；陽(yáng)離子聚合物側(cè)鏈基團(tuán)包括烷基胺、烷基季銨鹽、烷基咪唑等，其中烷基可以是c1～c18鏈，烷基鏈上含有0～6個(gè)雜原子，聚合物分子量為2000～150000da。

共軛聚電解質(zhì)包括陽(yáng)離子聚噻吩、陽(yáng)離子聚苯撐乙炔、陽(yáng)離子聚芴、陽(yáng)離子聚苯撐乙烯或陽(yáng)離子聚電解質(zhì)共聚物。具體而言，共軛聚電解質(zhì)包括骨架及側(cè)鏈，其中，共軛聚電解質(zhì)骨架包括聚噻吩、聚苯撐乙炔、聚芴、聚苯撐乙烯、聚丁二炔、或基于上述骨架結(jié)構(gòu)的共聚物等；共軛聚電解質(zhì)側(cè)鏈基團(tuán)包括烷基胺、烷基季銨鹽、烷基咪唑等，其中烷基可以是c1～c18鏈，鏈上含有0～6個(gè)雜原子。聚合物分子量為1000～50000da。優(yōu)選的，陽(yáng)離子聚噻吩可包括線形陽(yáng)離子聚噻吩或陽(yáng)離子支化聚噻吩；陽(yáng)離子聚苯撐乙炔可包括線形陽(yáng)離子聚苯撐乙炔或陽(yáng)離子支化聚苯撐乙炔；陽(yáng)離子聚芴可為線形陽(yáng)離子聚芴；陽(yáng)離子聚苯撐乙烯可為線形陽(yáng)離子聚苯撐乙烯；陽(yáng)離子聚電解質(zhì)共聚物可包括陽(yáng)離子聚(苯撐乙炔-co-苯)、陽(yáng)離子聚(芴-co-苯)等。

進(jìn)一步說，本發(fā)明陽(yáng)離子線性聚噻吩由如下步驟制備而得：

(1)分別催化氧化3-噻吩乙酸乙酯或者3-噻吩丙二酸二乙酯單體聚合，隨后清洗使鐵離子完全除去，得到兩類脂溶性線性聚噻吩；

(2)將上述兩類脂溶性線性聚噻吩分別經(jīng)分離純化、胺解、質(zhì)子化及透析后，即得到陽(yáng)離子線性聚噻吩。

本發(fā)明陽(yáng)離子支化聚噻吩由如下步驟制備而得：

(1)按摩爾比0.5～1:1將2-噻吩乙酸與n-羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)生成2-噻吩乙酸活性酯；

(2)將2-噻吩乙酸活性酯與三(2-氨乙基)胺及三乙胺在ch2cl2中反應(yīng)，制得如下結(jié)構(gòu)式的t3，其中，2-噻吩乙酸活性酯、三(2-氨乙基)胺、三乙胺的摩爾比為0.1～1:0.03～0.3:1，

(3)分別催化氧化噻吩乙酸乙酯與t3或者噻吩丙二酸二乙酯與t3聚合，隨后清洗，使鐵離子完全除去得到兩類脂溶性支化聚噻吩，其中，噻吩乙酸乙酯與t3的摩爾比為10～100:1，噻吩丙二酸二乙酯與t3的摩爾比為10～100:1；

(4)將上述兩類脂溶性支化聚噻吩分別經(jīng)分離純化、胺解、質(zhì)子化及透析后，即得到陽(yáng)離子支化聚噻吩。

本發(fā)明陽(yáng)離子聚苯撐乙炔cppe-det由如下步驟制備而得：

(1)將2,5-二碘-1,4-二苯乙酸溶于無水乙醇中，加入二氯亞砜，制得2,5-二碘-1,4-二苯乙酸乙酯，其中，2,5-二碘-1,4-二苯乙酸與二氯亞砜的摩爾比為10～100:1；

(2)將2,5-二碘-1,4-二苯乙酸乙酯溶于無水四氫呋喃和三乙胺中，分別加入pd(pph3)4、cui及三甲基硅烷乙炔，隨后加入四丁基氟化銨，沉淀制得ppe-et，其中，2,5-二碘-1,4-二苯乙酸乙酯、pd(pph3)4、cui及三甲基硅烷乙炔的摩爾比為0.25～0.5:0.001～0.01:0.001～0.01:1；

(3)將上述制得的ppe-et溶于nmp，加入二乙基三胺的nmp溶液，透析后制得cppe-det。

本發(fā)明陽(yáng)離子聚苯撐乙烯由如下步驟制備而得：

(1)將2,5-二碘-1,4-二苯乙酸溶于無水乙醇，加入二氯亞砜，制得2,5-二碘-1,4-二苯乙酸乙酯，其中，2,5-二碘-1,4-二苯乙酸與二氯亞砜的摩爾比為10～100:1；

(2)將2,5-二碘-1,4-二苯乙酸乙酯、1,4-苯二乙烯溶于無水二氧六環(huán)，加入三乙胺和pd/c，反應(yīng)制得ppv-et，其中，2,5-二碘-1,4-二苯乙酸乙酯、1,4-苯二乙烯的摩爾比為0.8～1.25:1；

(3)將上述ppv-et溶于nmp，加入二乙基三胺的nmp溶液，即制得cppv-det。

本發(fā)明陽(yáng)離子共聚物聚(芴-co-苯)由如下步驟制備而得：

將fl-et、1,4-二苯硼酸溶于甲苯和碳酸鉀水溶液中，隨后加入四(三苯基膦)鈀，反應(yīng)后制得pfp-et，將該pfp-et溶于干燥的nmp，加入r-nh2的nmp溶液，反應(yīng)后制得cpfp-r，其中，fl-et、1,4-二苯硼酸、四(三苯基膦)鈀的摩爾比為10～25:10～25:1。

下述實(shí)施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法，所用的實(shí)驗(yàn)材料，如無特殊說明，均自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。下述實(shí)施例中所述x％的共軛聚電解質(zhì)用量，如無特殊說明，均為摩爾量的百分含量。以下實(shí)施例中的定量實(shí)驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

實(shí)施例1陽(yáng)離子聚噻吩的制備

1、陽(yáng)離子線性聚噻吩

本發(fā)明的陽(yáng)離子線性聚噻吩的結(jié)構(gòu)式為：

制備方法包括如下步驟：

(1)脂溶性線性聚噻吩(lpt或lptm)的合成

氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將無水三氯化鐵(1.05g，6.5mmol)溶于無水硝基甲烷(25ml)，另在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將3-噻吩乙酸乙酯(0.50g，3.34mmol)或者3-噻吩丙二酸二乙酯(0.80g，3.31mmol)溶解于無水chcl3(25ml)；冰浴下，將fecl3的硝基甲烷溶液逐滴加入反應(yīng)體系，體系加熱至35℃，避光攪拌反應(yīng)2h，停止反應(yīng)后，體系先用0.01m鹽酸洗一遍，再用含有三乙醇胺(5％，w/v)和檸檬酸鈉(36.7g/l)的混合溶液洗三次，最后用氟化銨(10％，w/v)洗一次，使鐵離子完全除去；有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥過夜后蒸除溶劑，得到的固體用少量氯仿溶解，再用乙醚重沉淀，得到脂溶性線性聚噻吩的混合物，該混合物進(jìn)一步分別用尺寸排阻色譜法(sec)分離，得到脂溶性線性聚噻吩(lpt1、lpt2、lptm)。

(2)陽(yáng)離子線性聚噻吩(clpt或clptm)的合成

稱取上述脂溶性線性聚噻吩(0.50g)溶于nmp(10ml)中，冰箱內(nèi)放置6h，使其充分溶解；氬氣保護(hù)下，另取二乙烯三胺det(50eq.)溶于n-甲基吡咯烷酮，即nmp(8ml)中，并用冰鹽浴冷卻，隨后，攪拌下，將已置換氬氣的脂溶性線性聚噻吩的nmp溶液逐滴加入至det的nmp溶液中，反應(yīng)4h，反應(yīng)停止后，將體系慢慢逐滴加入預(yù)冷的ph＝1的鹽酸中，冰鹽浴下大力攪拌；將鹽酸質(zhì)子化后得到澄清透明的液體轉(zhuǎn)入透析袋(根據(jù)gpc測(cè)試結(jié)果確定使用何種截留分子量的透析袋)中，先用ph＝2的鹽酸溶液透析1d，再用ph＝4的鹽酸溶液透析1d，最后用中性去離子水透析2d，透析完成后，取出透析袋中液體，用0.22μm濾器過濾后，凍干得到陽(yáng)離子線性聚噻吩(clptm、clpt-1、clpt-2)。

上述反應(yīng)的流程如圖2a所示。

2、陽(yáng)離子支化聚噻吩

本發(fā)明的陽(yáng)離子支化聚噻吩的結(jié)構(gòu)式為：

制備方法包括如下步驟：

(1)化合物t3的合成

將2-噻吩乙酸(0.30g，2.1mmol)溶于二氯甲烷(20ml)，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(0.48g，2.52mmol)及n-羥基琥珀酰亞胺(0.29g，2.52mmol)，室溫下反應(yīng)過夜；水洗、無水硫酸鈉干燥后，旋蒸除去溶劑，將上述2-噻吩乙酸活性酯溶于二氯甲烷(8ml)，加入三(2-氨乙基)胺(0.08g，0.55mmol)和三乙胺(0.067g，0.66mmol)并攪拌反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)體系用飽和氯化銨水溶液洗兩次，飽和食鹽水洗一次，無水硫酸鈉干燥過夜，產(chǎn)物濃縮后用硅膠柱分離純化，得到白色固體t3(0.18g)；將t3進(jìn)行性能檢測(cè)，可得到如下所述的產(chǎn)物表征：核磁氫譜(400mhz，cdcl3):δ(ppm)7.19(3h)，6.96-6.90(m，6h)，6.70(brs，3h)，3.75(s，6h)，3.19(q，6h)，2.47(t，6h).核磁碳譜(75mhz，dmso-d6):δ(ppm)169.7，138.1，127.0，126.4，125.2，53.7，37.6，37.0.高分辨質(zhì)譜:m/zc24h31n4o3s3([m+h]⁺)計(jì)算值519.1558，實(shí)測(cè)值519.1557。上述表征數(shù)據(jù)表明t3結(jié)構(gòu)無誤。

(2)脂溶性支化聚噻吩(bpt或bptm)的合成。

氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將無水三氯化鐵(1.05g，6.5mmol)溶解于無水硝基甲烷(25ml)；另在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將3-噻吩乙酸乙酯(0.50g，3.3mmol)或者3-噻吩丙二酸二乙酯(0.80g，3.3mmol)和t3(0.07g，0.14mmol)溶解于無水chcl3(25ml)，冰浴下，將fecl3的硝基甲烷溶液逐滴加入反應(yīng)體系，體系升溫至35℃，避光攪拌反應(yīng)2h；停止反應(yīng)后，體系先用0.01m鹽酸洗一遍，再用含有三乙醇胺(5％，w/v)和檸檬酸鈉(36.7g/l)的混合溶液洗三次，最后用氟化銨(10％，w/v)洗一次，使鐵離子完全除去；有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥過夜后蒸除溶劑，得到的固體用少量氯仿溶解，再用乙醚重沉淀，得到脂溶性線性聚噻吩的混合物，該混合物進(jìn)一步用尺寸排阻色譜法分離，收集各部分產(chǎn)物并分別濃縮干燥，即得到脂溶性支化聚噻吩bpt-1、bpt-2、bpt-3、bptm-1、bptm-2。

上述lpt1、lpt2、lptm的1hnmr和gpc的表征結(jié)果，bpt或bptm的1hnmr和gpc的表征結(jié)果如圖3a至3d所示。根據(jù)lpt1、lpt2、lptm的1hnmr和gpc的表征結(jié)果可知，低場(chǎng)、中高場(chǎng)以及高場(chǎng)的共振峰對(duì)應(yīng)核磁譜圖中噻吩單元的氫，以聚苯乙烯為參照物的gpc分析顯示mw分子量分別為33、9、4kda，說明為聚噻吩結(jié)構(gòu)；根據(jù)bpt或bptm的1hnmr和gpc的表征結(jié)果可知，在核磁氫譜方面，bpt和bptm除了具有噻吩單元的共振峰，還具有支化單元t3的共振峰，在gpc方面，bpt和bptm都出現(xiàn)在比單體更短的保留時(shí)間，上述結(jié)果表明bpt和bptm為聚合產(chǎn)物，且t3結(jié)構(gòu)被成功整合到聚噻吩中。

(3)陽(yáng)離子支化聚噻吩(cbpt或cbptm)的合成

稱取上述脂溶性支化聚噻吩(0.50g)溶于nmp(10ml)中，冰箱內(nèi)放置6h，使其充分溶解；氬氣保護(hù)下，另取det(50eq.)溶于nmp(8ml)中并用冰鹽浴冷卻，隨后，攪拌下，將已置換氬氣的脂溶性支化聚噻吩的nmp溶液逐滴加入至det的nmp溶液中，反應(yīng)4h；反應(yīng)停止后，將體系慢慢逐滴加入預(yù)冷的ph＝1的鹽酸中，冰鹽浴下大力攪拌。將鹽酸質(zhì)子化后得到澄清透明的液體轉(zhuǎn)入透析袋(根據(jù)gpc測(cè)試結(jié)果確定使用何種截留分子量的透析袋)中，先用ph＝2的鹽酸溶液透析1d，再用ph＝4的鹽酸溶液透析1d，最后用中性去離子水透析2d，透析完成后，取出透析袋中液體，用0.22μm濾器過濾后，凍干得到陽(yáng)離子支化聚噻吩(cbptm-1、cbptm-2、cbpt-1、cbpt-2、cbpt-3)。其制備工藝流程圖如圖2b所示。

在制備陽(yáng)離子支化聚噻吩時(shí)，步驟(1)中，將2-噻吩乙酸與n-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比替換成0.5:1或1:1，其中，2-噻吩乙酸活性酯與三(2-氨乙基)胺及三乙胺的摩爾比為0.1:0.03:1、0.5:0.1:1或1:0.3:1，均可制得該結(jié)構(gòu)的陽(yáng)離子支化聚噻吩；步驟(2)中，將噻吩乙酸乙酯與t3，或噻吩丙二酸二乙酯與t3的摩爾比替換為10:1、50:1、100:1，均可制得該結(jié)構(gòu)的陽(yáng)離子支化聚噻吩。

實(shí)施例2陽(yáng)離子線性/支化聚噻吩構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物

原料組成：該復(fù)合物包括可降解陽(yáng)離子星形聚天冬酰胺載體、dna及陽(yáng)離子線性/支化聚噻吩；其中，陽(yáng)離子線性/支化聚噻吩及可降解陽(yáng)離子星形聚天冬酰胺載體的正電荷總和與dna的負(fù)電荷之比為2.5:1，陽(yáng)離子線性/支化聚噻吩與可降解陽(yáng)離子星形聚天冬酰胺載體的正電荷之比為2.5％或5％。

制備方法：在聚合物材料所含的胺基(包括1～4級(jí)胺)數(shù)目與核酸分子所含磷酸酯鍵數(shù)目之比為5的條件下(即n/p＝5，由于只有一半胺基在中性條件下發(fā)生了質(zhì)子化，此時(shí)正負(fù)電荷比為2.5:1)，首先將可降解陽(yáng)離子星形聚天冬酰胺載體(sp)材料和質(zhì)粒dna用超純水稀釋到相同的體積后，將質(zhì)粒溶液緩慢加入到sp材料中，完全加完后靜置15min，使材料與質(zhì)粒自組裝形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物。隨后，向納米復(fù)合物體系中緩慢加入等體積的陽(yáng)離子線性/支化聚噻吩，完全加完后再靜置15min，使陽(yáng)離子線性/支化聚噻吩結(jié)合在納米復(fù)合物表面，組裝形成穩(wěn)定的多組份納米復(fù)合物。

引入2.5％、5％陽(yáng)離子線性/支化聚噻吩構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物體系，測(cè)定其水合動(dòng)力學(xué)直徑及表面電勢(shì)，結(jié)果如圖4所示，加入少量的陽(yáng)離子線性/支化聚噻吩后，納米復(fù)合物的尺寸變小，表面電勢(shì)提高。

如圖1所示，核酸分子被穩(wěn)定包裝于內(nèi)核處的納米復(fù)合材料被細(xì)胞攝取后，其表面的共軛聚電解質(zhì)在非光照下擾動(dòng)溶酶體膜，或者在光照下通過光化學(xué)內(nèi)化效應(yīng)進(jìn)一步增加溶酶體膜的通透性，從而顯著提高核酸顆粒溶酶體逃逸的成功率以及最終的轉(zhuǎn)染效率。

性能檢測(cè)1陽(yáng)離子線性/支化聚噻吩構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物的穩(wěn)定性檢測(cè)

溴化乙錠(ethidiumbromide,eb)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)陽(yáng)離子線性/支化聚噻吩構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)中eb終濃度為5μg/ml，質(zhì)粒dna終濃度為1.6μg/ml，去離子為溶劑。以n/p＝0.25為變化當(dāng)量，逐步加入材料(加入材料溶液的體積盡量少，以免引起質(zhì)粒濃度較大的變化)，混勻后靜置5min測(cè)定eb的熒光發(fā)射光譜強(qiáng)度變化，溶液隨著材料加入，體系相對(duì)熒光強(qiáng)度(relativefluorescenceintensity，rfi)可以按如下公式計(jì)算得出：

rfi＝(fx-f0)/(fmax-f0)

其中，f0表示僅有eb時(shí)，體系熒光強(qiáng)度；fmax表示eb中加入質(zhì)粒dna，穩(wěn)定5min后的熒光強(qiáng)度；fx表示eb與質(zhì)粒dna的溶液中加入載體材料，穩(wěn)定5min后熒光強(qiáng)度。為了避免陽(yáng)離子噻吩材料的干擾，選用激發(fā)光波長(zhǎng)為550nm，收集最大發(fā)射波長(zhǎng)600nm處的熒光變化。結(jié)果如圖5所示，引入2.5％或5％的cpt修飾sp/pgfp納米復(fù)合物，有效提高了納米復(fù)合物的穩(wěn)定性，且相比sp/dna和bpei/dna，cpt/sp/dna多組分納米復(fù)合物具有更高的穩(wěn)定性，有助于提高在輸送過程中載體材料對(duì)dna的保護(hù)能力。

性能檢測(cè)2微量陽(yáng)離子線性/支化聚噻吩構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期hepg2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，以每孔大約1.6×10⁴個(gè)/200μl的細(xì)胞濃度接種到96孔板，置于含有5％co2的37℃培養(yǎng)箱內(nèi)生長(zhǎng)12-24h。當(dāng)細(xì)胞融合70-80％時(shí)，將培養(yǎng)基吸除，pbs洗細(xì)胞1-2遍，加入含有預(yù)設(shè)濃度測(cè)試樣品的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育24h。24h后，吸除含有樣品的培養(yǎng)基，pbs洗細(xì)胞1-2遍，每孔加入100μl含有mtt(0.5mg/ml)的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4h。4h后吸除培養(yǎng)基，pbs輕洗細(xì)胞1-2遍。加入150μldmso，搖床上輕搖20min，使生成的甲瓚晶體充分溶解。酶標(biāo)儀分別測(cè)定各孔在570nm、720nm波長(zhǎng)下的吸收值，記錄結(jié)果。其中，每孔所記錄的720nm波長(zhǎng)下的吸光度值為扣除背景用，即最終計(jì)算用的吸光度值為od570減去od720后的數(shù)值。細(xì)胞存活率可以按照如下公式計(jì)算：

細(xì)胞存活率(％)＝(樣品組平均吸光度值/對(duì)照組平均吸光度值)×100％

注意當(dāng)檢測(cè)光毒性時(shí)，則在多組份納米復(fù)合物體系與細(xì)胞共孵育4-6h時(shí)引入光照條件即可，其余操作與未光照組一致。

結(jié)果如圖6所示，sp/pgfp復(fù)合物的細(xì)胞毒性和cpts構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物體系的細(xì)胞毒性基本相近，分子量較低的陽(yáng)離子聚噻吩材料，在光照及非光照條件下均未產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性。

性能檢測(cè)3微量陽(yáng)離子線性/支化聚噻吩構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)引起ros水平變化測(cè)定

細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無熒光的dcfh生成有熒光的dcf，通過檢測(cè)dcf的熒光強(qiáng)度可以推算出細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。將ros捕捉劑dcfh-da用dmso溶解制備成10mm溶液，使用時(shí)用pbs稀釋至終濃度為20μm。以96孔板為例：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，以每孔大約1.6×10⁴個(gè)/200μl的細(xì)胞濃度接種到96孔板，置于含有5％co2的37℃培養(yǎng)箱內(nèi)生長(zhǎng)12-24h。當(dāng)細(xì)胞融合70-80％時(shí)，將培養(yǎng)基吸除，pbs洗細(xì)胞1-2遍，加入含有載體材料/質(zhì)粒的納米復(fù)合物的不完全培養(yǎng)基。吸除每孔中含有材料的培養(yǎng)基，pbs洗1-2遍，加入dcfh-da探針溶液(終濃度為20μm)，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育20min。去除探針溶液，pbs洗2-3遍。洗滌完后每孔加入100μl完全培養(yǎng)基，熒光倒置顯微鏡下觀察記錄dcfh-da捕捉了ros后的氧化產(chǎn)物dcf的綠色熒光(ex＝465/95nm，em＝515-555nm)。

當(dāng)檢測(cè)光照作用時(shí)，則在多組份納米復(fù)合物體系與細(xì)胞共孵育4-6h時(shí)引入光照條件即可，其余操作與未光照組一致。

通過圖7a、7b至圖16a、16b所示，陽(yáng)離子線性/支化聚噻吩修飾形成的多組份納米復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)化后，在經(jīng)過白光(500mw/cm²)照射后，源自于dcf的綠色熒光顯著增強(qiáng)，說明光照后納米復(fù)合物中的微量cpts能夠顯著提升細(xì)胞內(nèi)的ros水平，這對(duì)增強(qiáng)納米復(fù)合物的溶酶體逃逸具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

性能檢測(cè)4微量陽(yáng)離子線性/支化聚噻吩構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物被細(xì)胞攝取后引起的溶酶體通透性變化。

利用質(zhì)粒標(biāo)記試劑盒(miruslabelit)，對(duì)表達(dá)luciferase的質(zhì)粒pluci進(jìn)行rhodamine標(biāo)記，得到rho-pluci。配制含微量cpt和rho-pluci的多組分納米復(fù)合物。實(shí)驗(yàn)中，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以7×10⁴個(gè)/800μl的濃度接種于30mm玻璃培養(yǎng)皿中，置于含有5％co2的37℃培養(yǎng)箱內(nèi)生長(zhǎng)12-24h。當(dāng)細(xì)胞融合70-80％時(shí)，將培養(yǎng)基吸除，pbs洗細(xì)胞1-2遍，加入含有載體材料/質(zhì)粒的納米復(fù)合物(質(zhì)粒終濃度為2μg/ml，n/p5)的不完全培養(yǎng)基。繼續(xù)孵育4h后，培養(yǎng)皿置于白光(500mw/cm²)下照射1min，對(duì)照組細(xì)胞則不經(jīng)受光照。隨后使用lysotracker對(duì)細(xì)胞進(jìn)行溶酶體染色。激光共聚焦顯微鏡觀察溶酶體熒光探針染料所用的激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，收集了505-525nm波長(zhǎng)范圍的發(fā)射光；觀察羅丹明染料所用的激發(fā)波長(zhǎng)為543nm，收集了560-700nm波長(zhǎng)范圍的發(fā)射光。

結(jié)果如圖17a、17b、17c、17d、17e、17f至19a、19b、19c、19d、19e、19f所示，對(duì)照組pei/dna和sp/dna，在光照或非光照條件下，在細(xì)胞內(nèi)均呈現(xiàn)很強(qiáng)的lysotracker綠色熒光，rho-pluci的紅色熒光與lysotracker綠色熒光高度重合，表明溶酶體膜比較完整，納米顆粒很難從溶酶體逃逸到胞漿。而攝取了微量cpt/sp/dna多組分納米復(fù)合物的細(xì)胞，在非光照時(shí)，lysotracker綠色熒光明顯變暗，表明溶酶體膜完整性受到擾動(dòng)而導(dǎo)致ph值下降受阻；在光照后，lysotracker的綠色熒光非常暗淡，而且與rho-pluci的紅色熒光重合不佳，表明溶酶體膜完整性被破壞、質(zhì)粒成功從溶酶體逃逸。該結(jié)果充分說明利用微量共軛聚合物的pci效應(yīng)，能夠有效輔助納米復(fù)合物的溶酶體逃逸。

性能檢測(cè)5微量陽(yáng)離子線性/支化聚噻吩構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物的invitro基因輸送實(shí)驗(yàn)

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，以每孔大約1.6×10⁴個(gè)/200μl的細(xì)胞濃度接種到96孔板，置于含有5％co2的37℃培養(yǎng)箱內(nèi)生長(zhǎng)12-24h。當(dāng)細(xì)胞融合70-80％時(shí)，將培養(yǎng)基吸除，pbs洗細(xì)胞1-2遍，加入含有載體材料/質(zhì)粒的納米復(fù)合物的不完全培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育4-6h。隨后，吸除含有樣品的不完全培養(yǎng)基，pbs洗細(xì)胞1-2遍，每孔加入200μl完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育36-40h。對(duì)質(zhì)粒pgfp的轉(zhuǎn)染效率通過熒光倒置顯微鏡觀察記錄(ex＝465/95nm，em＝515-555nm)，對(duì)質(zhì)粒pluc的轉(zhuǎn)染效率通過luciferaseassay(購(gòu)買于美國(guó)promega公司)測(cè)定。

當(dāng)檢測(cè)光照作用時(shí)，則在多組份納米復(fù)合物體系與細(xì)胞共孵育4～6h時(shí)引入光照條件即可，其余操作與未光照組一致。

陽(yáng)離子線性/支化聚噻吩構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物體系對(duì)hela細(xì)胞的pgfp轉(zhuǎn)染40h。結(jié)果如圖20所示，當(dāng)轉(zhuǎn)染過程中引入光照條件后，含有微量cpts的基因輸送體系對(duì)hela細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率顯著增強(qiáng)。結(jié)果表明，相比對(duì)照載體材料sp和pei，本發(fā)明使用含量為2.5％的cpt、結(jié)合pci策略可使luciferase的表達(dá)最多增強(qiáng)約10倍以上。

實(shí)施例3陽(yáng)離子聚苯撐乙炔及其制備

本發(fā)明的陽(yáng)離子聚苯撐乙炔的結(jié)構(gòu)式為：

其中，cppe-det合成路線如下所示：

具體的制備方法如下：

(1)2,5-二碘-1,4-二苯乙酸乙酯的合成：將2,5-二碘-1,4-二苯乙酸(4.45g，10mmol)溶于無水乙醇(100ml)，滴加二氯亞砜(1ml)，室溫下攪拌24h，旋蒸除去溶劑，硅膠柱分離后得到淺黃色固體(4.0g)；

(2)ppe-et合成：將2,5-二碘-1,4-二苯乙酸乙酯(0.5g，1mmol)溶于無水四氫呋喃(15ml)和三乙胺(5ml)，脫氣后加入催化劑量的pd(pph3)4和cui，鼓氮?dú)?0min，加入三甲基硅烷乙炔(0.27ml，2mmol)，室溫下反應(yīng)0.5h，向反應(yīng)液滴加1m四丁基氟化銨溶液(2ml，2mmol)，在室溫下繼續(xù)反應(yīng)24h，將反應(yīng)混合物通過短的硅膠柱，用乙醚沉淀3次，得到淺黃色固體(0.16g)；

(3)cppe-det的合成：取78mg(0.2mmol)ppe-et溶于10ml干燥的nmp，冷卻后，加入二乙基三胺的nmp溶液(100eq，10ml)，35℃反應(yīng)3d，鹽酸中和后，先后用鹽酸(ph2)和水透析，最后冷凍干燥，得到黃色固體cppe-det。

在制備陽(yáng)離子聚苯撐乙炔時(shí)，步驟(1)中，將2,5-二碘-1,4-二苯乙酸與二氯亞砜的摩爾比替換成10:1、50:1、100:1，均可制得該結(jié)構(gòu)的陽(yáng)離子聚苯撐乙炔；步驟(2)中，將2,5-二碘-1,4-二苯乙酸乙酯、pd(pph3)4、cui及三甲基硅烷乙炔的摩爾比替換為0.25:0.001:0.001:1、0.5:0.01:0.01:1，均可制得該結(jié)構(gòu)的陽(yáng)離子聚苯撐乙炔。

實(shí)施例4陽(yáng)離子聚苯撐乙炔構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物

原料組成：該復(fù)合物包括聚氨基酸衍生物、rna及陽(yáng)離子聚苯撐乙炔；其中，陽(yáng)離子聚苯撐乙炔及聚氨基酸衍生物的正電荷總和與rna的負(fù)電荷之比為10:1，共軛聚電解質(zhì)與聚氨基酸衍生物的正電荷之比為0.1％、0.25％、0.5％或1.0％。

其中，所述聚氨基酸衍生物，為聚賴氨酸或多聚精氨酸，分子量為5～50kda。

制備方法：在聚合物材料所含的胺基(包括1～4級(jí)胺)數(shù)目與核酸分子所含磷酸酯鍵數(shù)目之比為5的條件下(即n/p＝5)，首先將聚氨基酸和rna用超純水稀釋到相同的體積后，將rna溶液緩慢加入到聚氨基酸中，完全加完后靜置30min，使材料與質(zhì)粒自組裝形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物；隨后，向納米復(fù)合物體系中緩慢加入等體積的陽(yáng)離子聚苯撐乙炔，完全加完后再靜置60min，得到穩(wěn)定的多組份納米復(fù)合物。

性能檢測(cè)6微量陽(yáng)離子聚苯撐乙炔構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物的invitro基因輸送實(shí)驗(yàn)

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，以每孔大約1.6×10⁴個(gè)/200μl的細(xì)胞濃度接種到96孔板，置于含有5％co2的37℃培養(yǎng)箱內(nèi)生長(zhǎng)12～24h；當(dāng)細(xì)胞融合70-80％時(shí)，將培養(yǎng)基吸除，pbs洗細(xì)胞1～2遍，加入含有載體材料/質(zhì)粒的納米復(fù)合物的不完全培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育4～6h；隨后，吸除含有樣品的不完全培養(yǎng)基，pbs洗細(xì)胞1-2遍，每孔加入200μl完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育36-40h，對(duì)pgfp的轉(zhuǎn)染水平通過熒光倒置顯微鏡觀察記錄(ex＝465/95nm，em＝515-555nm)，對(duì)pluci的轉(zhuǎn)染效率通過luciferaseassaykit(promega公司)定量測(cè)定。

注意當(dāng)檢測(cè)光照作用時(shí)，則在多組份納米復(fù)合物體系與細(xì)胞共孵育4-6h時(shí)引入光照條件即可，其余操作與未光照組一致。

微量陽(yáng)離子聚苯撐乙炔的多組份納米復(fù)合物體系對(duì)hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染40h的結(jié)果如圖21a、21b至26a、26b及圖27所示，cppe修飾后能夠顯著提高sp/dna復(fù)合物對(duì)pgfp和pluc轉(zhuǎn)染效率。0.1％、0.25％、0.5％、1.0％不同的cppe含量條件下轉(zhuǎn)染效率均有提升，0.25％的作用效果最佳。luciferaseassay檢測(cè)結(jié)果顯示，在不引入光照的條件下，pim-2就具有很強(qiáng)的促進(jìn)sp/dna復(fù)合物轉(zhuǎn)染的能力，0.25％的pim-2材料加入后，多組份納米復(fù)合物的基因轉(zhuǎn)染效率相比sp提高了10倍，相比bpei提高了約23倍。上述結(jié)果均證實(shí)了微量陽(yáng)離子聚苯撐乙炔構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物體系能夠顯著提高基因輸送效率。

實(shí)施例5陽(yáng)離子聚苯撐乙烯及其制備

本發(fā)明的陽(yáng)離子聚苯撐乙烯的結(jié)構(gòu)式為：

其中，n＝10～200。

其制備路線為：

制備方法包括如下步驟：

(1)2,5-二碘-1,4-二苯乙酸乙酯的合成：將2,5-二碘-1,4-二苯乙酸(4.45g，10mmol)溶于無水乙醇(100ml)，滴加二氯亞砜(1ml)，室溫下攪拌24h，旋蒸除去溶劑，硅膠柱分離后得到淺黃色固體(4.0g)；

(2)ppv-et的合成：將2,5-二碘-1,4-二苯乙酸乙酯(0.5g，1mmol)、1,4-苯二乙烯(0.13g)溶于無水二氧六環(huán)(10ml)，鼓氮?dú)?0min；氮?dú)鈿夥障录尤肴野?1ml)和催化量5％pd/c，加熱回流，反應(yīng)24h，過濾后旋蒸除去溶劑，氯仿溶解，在乙醚中沉淀3次，得到黃色固體(0.3g)；

(3)cppv-det的合成：取78mg(0.2mmol)ppv-et溶于10ml干燥的nmp，冷卻后，加入二乙基三胺的nmp溶液(100eq，10ml)，35℃反應(yīng)3d；鹽酸中和后，先后用鹽酸(ph2)和水透析，最后冷凍干燥，得到黃色固體cppv-det。

在制備陽(yáng)離子聚苯撐乙烯時(shí)，步驟(1)中，將2,5-二碘-1,4-二苯乙酸與二氯亞砜的摩爾比1替換成10:1、50:1、100:1，均可制得該結(jié)構(gòu)的陽(yáng)離子聚苯撐乙烯；步驟(2)中，將2,5-二碘-1,4-二苯乙酸乙酯與1,4-苯二乙烯的摩爾比替換為0.8:1、1:1、1.25:1，均可制得該結(jié)構(gòu)的陽(yáng)離子聚苯撐乙烯。

實(shí)施例6陽(yáng)離子聚苯撐乙烯構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物

原料組成：該復(fù)合物包括聚酰胺衍生物、dna及陽(yáng)離子聚苯撐乙烯；其中，陽(yáng)離子聚苯撐乙烯及聚酰胺衍生物的正電荷總和與dna的負(fù)電荷之比為1:1，陽(yáng)離子聚苯撐乙烯與聚酰胺衍生物的正電荷之比為0.01％。其中，所述聚酰胺衍生物為胺型聚酰胺pamam(第3.0～6.0代)。

制備方法：在聚合物材料所含的胺基(包括1～4級(jí)胺)數(shù)目與核酸分子所含磷酸酯鍵數(shù)目之比為5的條件下(即n/p＝5)，首先將聚酰胺衍生物和dna用超純水稀釋到相同的體積后，將質(zhì)粒溶液緩慢加入到聚酰胺衍生物中，完全加完后靜置30min，使材料與質(zhì)粒自組裝形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物。隨后，向納米復(fù)合物體系中緩慢加入等體積的陽(yáng)離子聚苯撐乙烯，完全加完后再靜置30min，得到穩(wěn)定的多組份納米復(fù)合物。

實(shí)施例7陽(yáng)離子共聚物聚(芴-co-苯)及其制備

本發(fā)明的陽(yáng)離子共聚物聚(芴-co-苯)的結(jié)構(gòu)式為：

其中，n＝10～200。

其制備路線為：

具體的制備方法包括如下步驟：

將fl-et(496mg，1mmol)、1,4-二苯硼酸(166mg，1mmol)溶于甲苯(10ml)和碳酸鉀水溶液(5ml，2m)，脫氣后加入催化量的四(三苯基膦)鈀，90℃反應(yīng)24h，氯仿萃取、水洗、無水硫酸鈉干燥，旋蒸濃縮，再經(jīng)3次乙醚沉淀、干燥，得到淺黃色固體pfp-et(220mg)，取82mg(0.2mmol)pfp-et溶于10ml干燥的nmp，冷卻后，加入r-nh2的nmp溶液(100eq，10ml)，35℃反應(yīng)3d，鹽酸中和后，先后用鹽酸(ph2)和水透析，最后冷凍干燥，得到黃色固體cpfp-r。

在制備陽(yáng)離子共聚物聚(芴-co-苯)時(shí)，將fl-et、1,4-二苯硼酸與四(三苯基膦)鈀的摩爾比為替換為10:10:1，25:25:1，均可制得該結(jié)構(gòu)的陽(yáng)離子共聚物聚(芴-co-苯)。

實(shí)施例8陽(yáng)離子共聚物聚(芴-co-苯)構(gòu)建的多組份納米復(fù)合物

原料組成：該復(fù)合物包括聚糖衍生物、rna及陽(yáng)離子聚(芴-co-苯)；其中，陽(yáng)離子聚芴及聚糖衍生物的正電荷總和與rna的負(fù)電荷之比為20:1，陽(yáng)離子聚(芴-co-苯)與聚糖衍生物的正電荷之比為10％。其中，所述聚糖衍生物為殼聚糖。

制備方法：在聚合物材料所含的胺基數(shù)目與核酸分子所含磷酸酯鍵數(shù)目之比為5的條件下(即n/p＝5)，首先將聚糖和rna用超純水稀釋到相同的體積后，將質(zhì)粒溶液緩慢加入到聚糖中，完全加完后靜置20min，使材料與質(zhì)粒自組裝形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物，隨后，向納米復(fù)合物體系中緩慢加入等體積的陽(yáng)離子聚(芴-co-苯)，再靜置10min，得到穩(wěn)定的多組份納米復(fù)合物。