本發(fā)明屬于疫苗生產(chǎn)領(lǐng)域，特別涉及一種乙肝病毒表面抗原基因與表達(dá)載體及細(xì)胞株。
背景技術(shù)：
：通過(guò)優(yōu)化乙肝病毒大s抗原基因序列和構(gòu)建高效表達(dá)載體的方法均無(wú)法高效表達(dá)分泌性乙肝表面抗原。這是因?yàn)檫^(guò)高的larges基因表達(dá)會(huì)抑制表面抗原的分泌，只有正確比例的larges：s才能夠獲得表面抗原的高效表達(dá)，而s抗原基因的調(diào)控序列正好位于pres序列之中，所以改變其基因序列來(lái)獲得大s抗原的高表達(dá)是不可取的。部分發(fā)明(如公開(kāi)號(hào)為cn102851313a的專(zhuān)利申請(qǐng))中描述了利用去除大部分乙肝病毒核心抗原基因的表達(dá)載體(含核質(zhì)附著區(qū)序列)，由于其載體中還有sv40等上游強(qiáng)啟動(dòng)子，會(huì)干擾乙肝病毒larges：s比例，從而影響抗原表達(dá)；并且由于其還是隨機(jī)插入基因組中，會(huì)造成插入序列的不穩(wěn)定，這對(duì)于生產(chǎn)性的表達(dá)是有風(fēng)險(xiǎn)的。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種乙肝病毒表面抗原基因。本發(fā)明的另一目的在于提供一種乙肝病毒表面抗原的表達(dá)載體，其含有上述乙肝病毒表面抗原基因。本發(fā)明的再一目的在于提供一種乙肝病毒表面抗原的表達(dá)細(xì)胞株及其制備方法。本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種乙肝病毒表面抗原基因，其由抗原啟動(dòng)子和部分核心抗原序列(包括間隔)、大s抗原基因和部分x基因序列(包括間隔)依次連接在一起，核苷酸序列如下(seqidno.1)所示。aagaggcaggtcccctagaagaagaactccctcgcctcgcagacgaaggtctcaatcgccgcgtcgcagaagatctcaatctcgggaatctcaatgttagtattccttggactcataaggtgggaactttacggggctttattcttctacggtacctagctttaatcctaattggcaaactccttcttttcctgacattcatttgcaggaggacattgttgatagatgtaagcaatttgtggggccccttacagtaaatgaaaacaggagactaaaattgattatgcctgctaggttttatcccaatgttactaaatatttgcccttagataaagggatcaaaccttattatccagagcatgtagttaatcattacttccagacgagacattatttacacactctttggaaggcgggtatcttatataaaagagagtccacaagtagcgcctcatattgggggtcaccatattcttgggaacaaaatctacagcatgggaggttggtcttccaaacctcgcaaaggcatggggacaaatctttctgtccccaatcccctgggattcttccccgatcatcagttggaccctgcattcaaagccaactcagaaaatccagattgggacctcaacccgcacaaggacaactggccggacgccaacaaggtgggagtgggagcattcgggccagggttcgcacctccccatgggggactgttggggtggagccctcaggctcagggactactcacaacggtgccagcagttcctcctcctgcctccaccaatcggcagtcaggaaggcagcctactcccttatctccacctctaagggacactcatcctcaggccatgcagtggaactccaccactttccaccaaactcttcaagatcccagagtcagggccctgtactttcctgctggtggctccagttcaggaacagtgagccctgctcagaatactgtctctgccatatcgtcaatcttatcgaagactggggaccctgtaccgaacaatgggaggttggtcttccaaacctcgcaaaggcatggggacaaatctttctgtccccaatcccctgggattcttccccgatcatcagttggaccctgcattcaaagccaactcagaaaatccagattgggacctcaacccgcacaaggacaactggccggacgccaacaaggtgggagtgggagcattcgggccagggttcgcacctccccatgggggactgttggggtggagccctcaggctcagggactactcacaacggtgccagcagttcctcctcctgcctccaccaatcggcagtcaggaaggcagcctactcccttatctccacctctaagggacactcatcctcaggccatgcagtggaactccaccactttccaccaaactcttcaagatcccagagtcagggccctgtactttcctgctggtggctccagttcaggaacagtgagccctgctcagaatactgtctctgccatatcgtcaatcttatcgaagactggggaccctgtaccgaacatggagaacatcgcatcaggactcctaggacccctgctcgtgttacaggcggggtttttcttgttgacaaaaatcctcacaataccacagagtctagactcgtggtggacttctctcaattttctaggggaaacacccgtgtgtcttggccaaaattcgcagtcccaaatctccagtcactcaccaacctgttgtcctccaatttgtcctggatatcgctggatgtgtctgcggcgttttatcatattcctctgcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatcaaggtatgttgcccgtttgtcctctaattccaggatcctcaacaaccagcacgggaccatgcaaaacctgcacaactcctgctcaaggaacctctatgtttccctcatgttgctgtacaaaacctacggacggaaactgcacctgtattcccatcccatcatcttgggctttcgcaaaatacctatgggagtgggcctcagtccgtttctcttggctcagtttactagtgccatttgttcagtggttcgtagggctttcccccactgtctggctttcagttatattgatgatgtggttttgggggccaagtctgtacaacatcttgagtccctttataccgctgttaccaattttcttttgtctttgggtatacatttaaatgtggctgatagggtgcggtgactgtatattgtgcgcgacacccctgtgtacatgtcgtgtgggctcagactcgcgcacaagacctctccggcgcgctgctctatacgcgcgctctgcgtatagtgtagagagagacacgcgcgcatctctctacacgcacactcgtgtgtgtgtctcatctgccgcaccgtgtgcacttcgctcacctctgcacgtcgcatgagacacgtgacaccacggcatctgccgaacgcccacgggaacctgcccaaggtcttgcataagaggactcttggactttcagcaatgtcaacgaccgaccttgaggcatacttcaaagactgtgtgtttaacgagtgggaggagtcgggggaggaggttaggttaatgatctttgta。一種乙肝病毒表面抗原的表達(dá)載體，含有上述乙肝病毒表面抗原基因和空載體。所述的空載體指的是不含有乙肝病毒表面抗原基因的載體，其優(yōu)選為含有重組酶識(shí)別位點(diǎn)的載體。從而將所述的乙肝病毒表面抗原的表達(dá)載體定點(diǎn)插入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的多拷貝或高表達(dá)位點(diǎn)。所述的重組酶識(shí)別位點(diǎn)可以為loxp位點(diǎn)、frt位點(diǎn)或其它重組酶識(shí)別位點(diǎn)；優(yōu)選為loxp位點(diǎn)。所述的空載體優(yōu)選為核苷酸序列如seqidno.2所示的空載體。一種乙肝病毒表面抗原的表達(dá)細(xì)胞株，含有上述乙肝病毒表面抗原基因。所述的乙肝病毒表面抗原的表達(dá)細(xì)胞株的制備方法，包括如下步驟：是將上述乙肝病毒表面抗原的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞株，篩選后得到。所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞株優(yōu)選為cho細(xì)胞株。所述的多拷貝或高表達(dá)位點(diǎn)主要指類(lèi)alu、tert、mll4、ccne1、senp5和rock1等位點(diǎn)。alu序列是人類(lèi)獨(dú)特的高拷貝序列，而cho細(xì)胞中僅有類(lèi)似序列；約有30％以上的自然感染的乙肝病毒是插入在此位點(diǎn)。tert、mll4、ccne1、senp5和rock1等附件序列屬于高表達(dá)位點(diǎn)，即單個(gè)拷貝插入即可實(shí)現(xiàn)高表達(dá)。所述的乙肝病毒表面抗原的表達(dá)細(xì)胞株的制備方法，優(yōu)選具體包括如下步驟：(1)將上述乙肝病毒表面抗原的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入哺乳動(dòng)物細(xì)胞株；(2)通過(guò)抗性篩選，得到乙肝病毒表面抗原的表達(dá)細(xì)胞株。步驟(1)中所述的轉(zhuǎn)染的方式包括磷酸鈣沉淀法和脂質(zhì)體方法。所述的乙肝病毒表面抗原的表達(dá)細(xì)胞株適合用于生產(chǎn)乙肝病毒表面抗原疫苗。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：(1)本發(fā)明提供的乙肝病毒表面抗原基因只含有部分核心抗原基因序列，避免得到復(fù)制型的病毒顆粒，從而影響產(chǎn)品的安全性和純度。(2)本發(fā)明提供的乙肝病毒表面抗原基因只含有部分x基因序列，避免完整的x基因會(huì)負(fù)向調(diào)控上游的s抗原基因表達(dá)。(3)本發(fā)明提供乙肝病毒表面抗原基因整合到哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組進(jìn)行表達(dá)后，大抗原得以分泌性表達(dá)。(4)本發(fā)明提供的x基因序列斷點(diǎn)是對(duì)大量臨床乙肝病毒感染者體內(nèi)乙肝病毒整合到人肝細(xì)胞基因組中的序列測(cè)序之后分析獲得的，其穩(wěn)定性和自然感染整合的乙肝病毒基因穩(wěn)定性相當(dāng)。附圖說(shuō)明圖1是hbv大抗原表達(dá)盒子的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2是乙肝表面抗原表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)示意圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例1一、元件選擇：(1)大s(pres1+pres2+s)抗原基因序列選用我們從廣東醫(yī)學(xué)臨床樣本中獲得的hbv序列：atgggaggttggtcttccaaacctcgcaaaggcatggggacaaatctttctgtccccaatcccctgggattcttccccgatcatcagttggaccctgcattcaaagccaactcagaaaatccagattgggacctcaacccgcacaaggacaactggccggacgccaacaaggtgggagtgggagcattcgggccagggttcgcacctccccatgggggactgttggggtggagccctcaggctcagggactactcacaacggtgccagcagttcctcctcctgcctccaccaatcggcagtcaggaaggcagcctactcccttatctccacctctaagggacactcatcctcaggccatgcagtggaactccaccactttccaccaaactcttcaagatcccagagtcagggccctgtactttcctgctggtggctccagttcaggaacagtgagccctgctcagaatactgtctctgccatatcgtcaatcttatcgaagactggggaccctgtaccgaacatggagaacatcgcatcaggactcctaggacccctgctcgtgttacaggcggggtttttcttgttgacaaaaatcctcacaataccacagagtctagactcgtggtggacttctctcaattttctaggggaaacacccgtgtgtcttggccaaaattcgcagtcccaaatctccagtcactcaccaacctgttgtcctccaatttgtcctggatatcgctggatgtgtctgcggcgttttatcatattcctctgcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatcaaggtatgttgcccgtttgtcctctaattccaggatcctcaacaaccagcacgggaccatgcaaaacctgcacaactcctgctcaaggaacctctatgtttccctcatgttgctgtacaaaacctacggacggaaactgcacctgtattcccatcccatcatcttgggctttcgcaaaatacctatgggagtgggcctcagtccgtttctcttggctcagtttactagtgccatttgttcagtggttcgtagggctttcccccactgtctggctttcagttatattgatgatgtggttttgggggccaagtctgtacaacatcttgagtccctttataccgctgttaccaattttcttttgtctttgggtatacatttaa。(2)抗原啟動(dòng)子和部分核心抗原序列(包括間隔)：aagaggcaggtcccctagaagaagaactccctcgcctcgcagacgaaggtctcaatcgccgcgtcgcagaagatctcaatctcgggaatctcaatgttagtattccttggactcataaggtgggaactttacggggctttattcttctacggtacctagctttaatcctaattggcaaactccttcttttcctgacattcatttgcaggaggacattgttgatagatgtaagcaatttgtggggccccttacagtaaatgaaaacaggagactaaaattgattatgcctgctaggttttatcccaatgttactaaatatttgcccttagataaagggatcaaaccttattatccagagcatgtagttaatcattacttccagacgagacattatttacacactctttggaaggcgggtatcttatataaaagagagtccacaagtagcgcctcatattgggggtcaccatattcttgggaacaaaatctacagcatgggaggttggtcttccaaacctcgcaaaggcatggggacaaatctttctgtccccaatcccctgggattcttccccgatcatcagttggaccctgcattcaaagccaactcagaaaatccagattgggacctcaacccgcacaaggacaactggccggacgccaacaaggtgggagtgggagcattcgggccagggttcgcacctccccatgggggactgttggggtggagccctcaggctcagggactactcacaacggtgccagcagttcctcctcctgcctccaccaatcggcagtcaggaaggcagcctactcccttatctccacctctaagggacactcatcctcaggccatgcagtggaactccaccactttccaccaaactcttcaagatcccagagtcagggccctgtactttcctgctggtggctccagttcaggaacagtgagccctgctcagaatactgtctctgccatatcgtcaatcttatcgaagactggggaccctgtaccgaaca。(3)部分x基因序列(包括間隔)：atgtggctgatagggtgcggtgactgtatattgtgcgcgacacccctgtgtacatgtcgtgtgggctcagactcgcgcacaagacctctccggcgcgctgctctatacgcgcgctctgcgtatagtgtagagagagacacgcgcgcatctctctacacgcacactcgtgtgtgtgtctcatctgccgcaccgtgtgcacttcgctcacctctgcacgtcgcatgagacacgtgacaccacggcatctgccgaacgcccacgggaacctgcccaaggtcttgcataagaggactcttggactttcagcaatgtcaacgaccgaccttgaggcatacttcaaagactgtgtgtttaacgagtgggaggagtcgggggaggaggttaggttaatgatctttgta。二、真核表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染1、載體構(gòu)建：通過(guò)序列合成方式，將空載體和如圖1所示hbv大抗原表達(dá)盒子連接在一起，得到的真核表達(dá)載體如圖2所示。其中，hbv大抗原表達(dá)盒子是將抗原啟動(dòng)子和部分核心抗原序列(包括間隔)、大s抗原基因和部分x基因序列(包括間隔)依次連接在一起；空載體含有重組酶識(shí)別位點(diǎn)cre、sv40啟動(dòng)子、g418抗性基因、多聚腺苷酸位點(diǎn)、puc復(fù)制原點(diǎn)、氨芐青霉素抗性基因等序列，具體序列如下所示。cggggtcattagttcatagcccatatatggagttagcaggatccggtaccaagcttaagtttaaaccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagctggggctctagggggtatccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattaattataacttcgtatagcatacattatacgaagttatctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctctgcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagctcccgggagcttgtatatccattttcggatctgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccaccccaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctgtataccgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtcggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgaatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacgggctagttattaatagtaatcaatta。真核表達(dá)載體合成后缺口用t4dna連接酶連接，方法是配制含終濃度為66mm的tris-hcl(三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液)、ph7.6，6.6mmmgcl2(氯化鎂)，10mmdtt(二硫蘇糖醇)，0.1mmatp(三磷酸腺苷)的反應(yīng)液，加入合成dna1μg，t4dna連接酶1000單位，總體積為20μl，16℃反應(yīng)24小時(shí)。2、轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)：取大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞dh5α100μl，加入上述連接產(chǎn)物5μl，置冰浴30分鐘，然后置42℃水浴90秒，迅速移置冰浴30分鐘，然后加入大腸桿菌培養(yǎng)基(lb液體培養(yǎng)基)，置37℃搖床，轉(zhuǎn)速為180rpm培養(yǎng)1小時(shí)，取100μl菌液涂布于含50μg/ml氨芐青霉素的lb瓊脂平板，37℃培養(yǎng)16小時(shí)。3、挑取陽(yáng)性克隆，接種到含50μg/ml氨芐青霉素的lb液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16小時(shí)，用商用大量質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒(如索來(lái)寶公司產(chǎn)品貨號(hào)d1110)。二、轉(zhuǎn)染cho細(xì)胞1、轉(zhuǎn)染前一天接種cho細(xì)胞于6孔板，(0.5～2)×105個(gè)細(xì)胞/孔，無(wú)抗生素f12培養(yǎng)基(含10％胎牛血清)2ml/孔，第二天轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞豐度達(dá)到90-95％。2、轉(zhuǎn)染前半小時(shí)換mem無(wú)血清培養(yǎng)基1.5ml，使用脂質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。①轉(zhuǎn)染液的配制(1孔的量)：a液：5μgdna加入245μlmem無(wú)血清培養(yǎng)基，輕輕混勻。b液：脂質(zhì)體使用前輕輕混勻，10μl脂質(zhì)體加入245μlmem無(wú)血清培養(yǎng)基，輕輕混勻，室溫靜止5min。b液加入a液，用移液器輕輕混勻，室溫靜止20min，得到轉(zhuǎn)染液。②將轉(zhuǎn)染液均勻分散慢慢滴加到6孔板細(xì)胞中，邊滴加邊前后左右十字交叉搖晃。孵箱37℃培養(yǎng)4h后加入2ml完全培養(yǎng)基培養(yǎng)恢復(fù)。③孵箱37℃培養(yǎng)48h。同時(shí)設(shè)立細(xì)胞對(duì)照組，空白轉(zhuǎn)染組(即按步驟①配制轉(zhuǎn)染液，但是不含dna)。3、篩選：①用濃度為0.25％的胰酶溶液消化細(xì)胞并傳入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板；細(xì)胞計(jì)數(shù)，每孔加2×104個(gè)細(xì)胞；②加入含g418(700μg/ml)的f12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)進(jìn)行篩選；③15天后換液，含g418的f12完全培養(yǎng)基；④一個(gè)月后獲得具有g(shù)418抗性的單克隆細(xì)胞株。四、檢測(cè)抗原表達(dá)1、用乙型肝炎病毒表面抗原和前s1抗原(hbvpres1)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法)(北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)有限公司)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后48小時(shí)、15天、30天的cho細(xì)胞上清結(jié)果如下：表1乙肝病毒表面抗原檢測(cè)結(jié)果(o.d.450nm)轉(zhuǎn)染后48小時(shí)轉(zhuǎn)染后15天轉(zhuǎn)染后30天表面抗原0.2540.3111.022pres1抗原0.0680.0890.165表2對(duì)照載體表面抗原檢測(cè)結(jié)果(od450nm)轉(zhuǎn)染后48小時(shí)轉(zhuǎn)染后15天轉(zhuǎn)染后30天表面抗原0.0540.0890.102pres1抗原0.0680.0560.065注：該對(duì)照是用pcdna3.1-larges(pcdna3.1為invitrogen公司產(chǎn)品)，對(duì)照載體通過(guò)如下步驟制備得到：用引物f1和r1對(duì)合成得到的真核表達(dá)載體進(jìn)行pcr，擴(kuò)增得到的pcr產(chǎn)物是含kozak序列的大s(pres1+pres2+s)抗原基因序列；pcr產(chǎn)物再通過(guò)nhei、hindiii進(jìn)行雙酶切，酶切純化后得到的片段與nhei、hindiii雙酶切后的pcdna3.1(+)載體通過(guò)t4dna連接酶連接，經(jīng)大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、氨芐青霉素篩選后得到；引物f1：5’-tcagctagcgccaccatgggaggttggtcttccaaa-3’；粗體為kozak序列，下劃線(xiàn)為nhei酶切位點(diǎn)；引物r1：5’-cggaagcttttaaatgtatacccaaagacaaaagaaaat-3’；粗體為kozak序列，下劃線(xiàn)為hindiii酶切位點(diǎn)。結(jié)果說(shuō)明：本發(fā)明中的乙肝病毒大s抗原已經(jīng)在轉(zhuǎn)染的cho細(xì)胞中獲得表達(dá)，并分泌到細(xì)胞培養(yǎng)上清中；而用cmv啟動(dòng)子的載體不能在上清中檢測(cè)到大s抗原表達(dá)。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。sequencelisting<110>李,軍濤<120>一種乙肝病毒表面抗原基因與表達(dá)載體及細(xì)胞株<130>1<160>7<170>patentinversion3.5<210>1<211>2621<212>dna<213>artificialsequence<220><223>乙肝病毒表面抗原基因<400>1aagaggcaggtcccctagaagaagaactccctcgcctcgcagacgaaggtctcaatcgcc60gcgtcgcagaagatctcaatctcgggaatctcaatgttagtattccttggactcataagg120tgggaactttacggggctttattcttctacggtacctagctttaatcctaattggcaaac180tccttcttttcctgacattcatttgcaggaggacattgttgatagatgtaagcaatttgt240ggggccccttacagtaaatgaaaacaggagactaaaattgattatgcctgctaggtttta300tcccaatgttactaaatatttgcccttagataaagggatcaaaccttattatccagagca360tgtagttaatcattacttccagacgagacattatttacacactctttggaaggcgggtat420cttatataaaagagagtccacaagtagcgcctcatattgggggtcaccatattcttggga480acaaaatctacagcatgggaggttggtcttccaaacctcgcaaaggcatggggacaaatc540tttctgtccccaatcccctgggattcttccccgatcatcagttggaccctgcattcaaag600ccaactcagaaaatccagattgggacctcaacccgcacaaggacaactggccggacgcca660acaaggtgggagtgggagcattcgggccagggttcgcacctccccatgggggactgttgg720ggtggagccctcaggctcagggactactcacaacggtgccagcagttcctcctcctgcct780ccaccaatcggcagtcaggaaggcagcctactcccttatctccacctctaagggacactc840atcctcaggccatgcagtggaactccaccactttccaccaaactcttcaagatcccagag900tcagggccctgtactttcctgctggtggctccagttcaggaacagtgagccctgctcaga960atactgtctctgccatatcgtcaatcttatcgaagactggggaccctgtaccgaacaatg1020ggaggttggtcttccaaacctcgcaaaggcatggggacaaatctttctgtccccaatccc1080ctgggattcttccccgatcatcagttggaccctgcattcaaagccaactcagaaaatcca1140gattgggacctcaacccgcacaaggacaactggccggacgccaacaaggtgggagtggga1200gcattcgggccagggttcgcacctccccatgggggactgttggggtggagccctcaggct1260cagggactactcacaacggtgccagcagttcctcctcctgcctccaccaatcggcagtca1320ggaaggcagcctactcccttatctccacctctaagggacactcatcctcaggccatgcag1380tggaactccaccactttccaccaaactcttcaagatcccagagtcagggccctgtacttt1440cctgctggtggctccagttcaggaacagtgagccctgctcagaatactgtctctgccata1500tcgtcaatcttatcgaagactggggaccctgtaccgaacatggagaacatcgcatcagga1560ctcctaggacccctgctcgtgttacaggcggggtttttcttgttgacaaaaatcctcaca1620ataccacagagtctagactcgtggtggacttctctcaattttctaggggaaacacccgtg1680tgtcttggccaaaattcgcagtcccaaatctccagtcactcaccaacctgttgtcctcca1740atttgtcctggatatcgctggatgtgtctgcggcgttttatcatattcctctgcatcctg1800ctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatcaaggtatgttgcccgtttgt1860cctctaattccaggatcctcaacaaccagcacgggaccatgcaaaacctgcacaactcct1920gctcaaggaacctctatgtttccctcatgttgctgtacaaaacctacggacggaaactgc1980acctgtattcccatcccatcatcttgggctttcgcaaaatacctatgggagtgggcctca2040gtccgtttctcttggctcagtttactagtgccatttgttcagtggttcgtagggctttcc2100cccactgtctggctttcagttatattgatgatgtggttttgggggccaagtctgtacaac2160atcttgagtccctttataccgctgttaccaattttcttttgtctttgggtatacatttaa2220atgtggctgatagggtgcggtgactgtatattgtgcgcgacacccctgtgtacatgtcgt2280gtgggctcagactcgcgcacaagacctctccggcgcgctgctctatacgcgcgctctgcg2340tatagtgtagagagagacacgcgcgcatctctctacacgcacactcgtgtgtgtgtctca2400tctgccgcaccgtgtgcacttcgctcacctctgcacgtcgcatgagacacgtgacaccac2460ggcatctgccgaacgcccacgggaacctgcccaaggtcttgcataagaggactcttggac2520tttcagcaatgtcaacgaccgaccttgaggcatacttcaaagactgtgtgtttaacgagt2580gggaggagtcgggggaggaggttaggttaatgatctttgta2621<210>2<211>1203<212>dna<213>人<400>2atgggaggttggtcttccaaacctcgcaaaggcatggggacaaatctttctgtccccaat60cccctgggattcttccccgatcatcagttggaccctgcattcaaagccaactcagaaaat120ccagattgggacctcaacccgcacaaggacaactggccggacgccaacaaggtgggagtg180ggagcattcgggccagggttcgcacctccccatgggggactgttggggtggagccctcag240gctcagggactactcacaacggtgccagcagttcctcctcctgcctccaccaatcggcag300tcaggaaggcagcctactcccttatctccacctctaagggacactcatcctcaggccatg360cagtggaactccaccactttccaccaaactcttcaagatcccagagtcagggccctgtac420tttcctgctggtggctccagttcaggaacagtgagccctgctcagaatactgtctctgcc480atatcgtcaatcttatcgaagactggggaccctgtaccgaacatggagaacatcgcatca540ggactcctaggacccctgctcgtgttacaggcggggtttttcttgttgacaaaaatcctc600acaataccacagagtctagactcgtggtggacttctctcaattttctaggggaaacaccc660gtgtgtcttggccaaaattcgcagtcccaaatctccagtcactcaccaacctgttgtcct720ccaatttgtcctggatatcgctggatgtgtctgcggcgttttatcatattcctctgcatc780ctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatcaaggtatgttgcccgtt840tgtcctctaattccaggatcctcaacaaccagcacgggaccatgcaaaacctgcacaact900cctgctcaaggaacctctatgtttccctcatgttgctgtacaaaacctacggacggaaac960tgcacctgtattcccatcccatcatcttgggctttcgcaaaatacctatgggagtgggcc1020tcagtccgtttctcttggctcagtttactagtgccatttgttcagtggttcgtagggctt1080tcccccactgtctggctttcagttatattgatgatgtggttttgggggccaagtctgtac1140aacatcttgagtccctttataccgctgttaccaattttcttttgtctttgggtatacatt1200taa1203<210>3<211>1017<212>dna<213>artificialsequence<220><223>抗原啟動(dòng)子和部分核心抗原序列<400>3aagaggcaggtcccctagaagaagaactccctcgcctcgcagacgaaggtctcaatcgcc60gcgtcgcagaagatctcaatctcgggaatctcaatgttagtattccttggactcataagg120tgggaactttacggggctttattcttctacggtacctagctttaatcctaattggcaaac180tccttcttttcctgacattcatttgcaggaggacattgttgatagatgtaagcaatttgt240ggggccccttacagtaaatgaaaacaggagactaaaattgattatgcctgctaggtttta300tcccaatgttactaaatatttgcccttagataaagggatcaaaccttattatccagagca360tgtagttaatcattacttccagacgagacattatttacacactctttggaaggcgggtat420cttatataaaagagagtccacaagtagcgcctcatattgggggtcaccatattcttggga480acaaaatctacagcatgggaggttggtcttccaaacctcgcaaaggcatggggacaaatc540tttctgtccccaatcccctgggattcttccccgatcatcagttggaccctgcattcaaag600ccaactcagaaaatccagattgggacctcaacccgcacaaggacaactggccggacgcca660acaaggtgggagtgggagcattcgggccagggttcgcacctccccatgggggactgttgg720ggtggagccctcaggctcagggactactcacaacggtgccagcagttcctcctcctgcct780ccaccaatcggcagtcaggaaggcagcctactcccttatctccacctctaagggacactc840atcctcaggccatgcagtggaactccaccactttccaccaaactcttcaagatcccagag900tcagggccctgtactttcctgctggtggctccagttcaggaacagtgagccctgctcaga960atactgtctctgccatatcgtcaatcttatcgaagactggggaccctgtaccgaaca1017<210>4<211>401<212>dna<213>人<400>4atgtggctgatagggtgcggtgactgtatattgtgcgcgacacccctgtgtacatgtcgt60gtgggctcagactcgcgcacaagacctctccggcgcgctgctctatacgcgcgctctgcg120tatagtgtagagagagacacgcgcgcatctctctacacgcacactcgtgtgtgtgtctca180tctgccgcaccgtgtgcacttcgctcacctctgcacgtcgcatgagacacgtgacaccac240ggcatctgccgaacgcccacgggaacctgcccaaggtcttgcataagaggactcttggac300tttcagcaatgtcaacgaccgaccttgaggcatacttcaaagactgtgtgtttaacgagt360gggaggagtcgggggaggaggttaggttaatgatctttgta401<210>5<211>4101<212>dna<213>artificialsequence<220><223>空載體<400>5cggggtcattagttcatagcccatatatggagttagcaggatccggtaccaagcttaagt60ttaaaccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccc120tcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaat180gaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtgggg240caggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggc300tctatggcttctgaggcggaaagaaccagctggggctctagggggtatccccacgcgccc360tgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacactt420gccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgcc480ggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgcttta540cggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccc600tgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttg660ttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggatt720ttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaat780taattataacttcgtatagcatacattatacgaagttatctgtggaatgtgtgtcagtta840gggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaat900tagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagc960atgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgccccta1020actccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgca1080gaggccgaggccgcctctgcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttgga1140ggcctaggcttttgcaaaaagctcccgggagcttgtatatccattttcggatctgatcaa1200gagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccg1260gccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctct1320gatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgac1380ctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacg1440acgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctg1500ctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaa1560gtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgccca1620ttcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtctt1680gtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgcc1740aggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgc1800ttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctg1860ggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagctt1920ggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcag1980cgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaa2040tgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttct2100atgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcg2160gggatctcatgctggagttcttcgcccaccccaacttgtttattgcagcttataatggtt2220acaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattcta2280gttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctgtataccgagtaaacttg2340gtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcg2400ttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttacc2460atctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatc2520agcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgc2580ctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatag2640tttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtat2700ggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtg2760caaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagt2820gttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaag2880atgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcg2940accgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaacttt3000aaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgct3060gttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttac3120tttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaat3180aagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcat3240ttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaaca3300aataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtcggcgttttgcgctg3360cttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgaatgtgagcaaaagg3420ccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccg3480cccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacagg3540actataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgac3600cctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctca3660tagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgt3720gcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtc3780caacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcag3840agcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacac3900tagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagt3960tggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtttttttgtttgcaagca4020gcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacgggcta4080gttattaatagtaatcaatta4101<210>6<211>36<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物f1<400>6tcagctagcgccaccatgggaggttggtcttccaaa36<210>7<211>39<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物r1<400>7cggaagcttttaaatgtatacccaaagacaaaagaaaat39當(dāng)前第1頁(yè)12