本發(fā)明涉及一種快速高效篩選維生素k2(mk-7)高產(chǎn)菌的方法，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：維生素k2是一類脂溶性凝血類維生素，為甲萘醌類系列化合物，根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)上c-3位異戊二烯側(cè)鏈的長(zhǎng)短不同共有14種形式，以mk-n表示(n指?jìng)?cè)鏈上異戊二烯單位的個(gè)數(shù))，甲萘醌-4(mk-4)和甲萘醌-7(mk-7)最為常見，而mk-7由于可快速被腸道吸收，在血液中的半衰期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)被廣泛研究。維生素k2在骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療方面具有顯著的效果，被稱為“第四代抗骨質(zhì)疏松產(chǎn)品”。除此之外，維生素k2還可以迅速改善由于維生素k缺乏引起的出血，抗動(dòng)脈鈣化及骨關(guān)節(jié)炎，抗腫瘤，延緩衰老，修復(fù)損傷細(xì)胞，治療帕金森癥等，廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域。維生素k2的應(yīng)用已得到了權(quán)威機(jī)構(gòu)的認(rèn)可。2005年日本批準(zhǔn)維生素k2作為抗骨質(zhì)疏松藥物上市。我國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局也將維生素k2列入“營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑申報(bào)與審評(píng)規(guī)定(試行)”的“維生素、礦物質(zhì)化合物名單”中(國(guó)食藥監(jiān)注[2005]202號(hào))，可用做保健食品或營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑的原料。2008年1月，維生素k2通過美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(fda)安全認(rèn)定。2009年，歐洲議會(huì)和歐盟理事會(huì)決定在其所有成員國(guó)中，維生素k2可用作保健食品或營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑的原料(2009/345/ec)。目前，國(guó)內(nèi)外維生素k2的專利主要涉及三方面內(nèi)容，一方面是發(fā)酵過程調(diào)控的優(yōu)化(ep1803820b1；cn104357355a)；一方面是維生素k2產(chǎn)物的分離提取(cn103898175a；us20060057688a1)；另一方面是菌種篩選，達(dá)能日爾維公司(法國(guó))采用桿菌肽或過氧化物使乳酸菌自然變種(us7981657b2)；上海紅馬飼料有限公司采用紫外和亞硝基胍復(fù)合誘變，結(jié)合原生質(zhì)體融合技術(shù)篩選維生素k2高產(chǎn)菌株(cn102827798a)。目前，工業(yè)化生產(chǎn)維生素k2大多是都以化學(xué)合成法生產(chǎn)，由于微生物發(fā)酵法生產(chǎn)其產(chǎn)量太低，成本過高，無法作為批量生產(chǎn)的主要途徑，需要進(jìn)行誘變篩選提高產(chǎn)量。菌株篩選的方法一般為化學(xué)誘變法，物理誘變法，離子注入誘變法和原生質(zhì)體誘變法等。其中，常壓室溫等離子體(artp)誘變不僅可以對(duì)微藻、細(xì)菌、真菌、酵母等微生物進(jìn)行快速誘變，而且由于其正突變率高，與傳統(tǒng)誘變方式相比，更容易獲得遺傳穩(wěn)定性良好的優(yōu)良突變菌。在大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中，維生素k2(甲基萘醌類)是細(xì)胞內(nèi)唯一的內(nèi)源性親脂抗氧化劑，也是呼吸鏈中不可或缺的電子傳遞體。其作用效果和coq相似，通過維持線粒體dna和基因的穩(wěn)定促進(jìn)細(xì)胞的生存，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔等起到獨(dú)立的抗凋亡作用。本發(fā)明擬采用artp方法對(duì)納豆芽孢桿菌的出發(fā)菌株進(jìn)行誘變，并針對(duì)抗反饋突變菌株(結(jié)構(gòu)類似物抗性突變菌)和抗呼吸鏈抑制劑的菌株的篩選進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)，通過對(duì)比底物消耗速率、生物量和產(chǎn)量等方面，從而獲得高產(chǎn)菌株，為實(shí)現(xiàn)維生素k2的微生物發(fā)展的工業(yè)化奠定基礎(chǔ)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題在于，現(xiàn)有技術(shù)中菌種選育過程效率過低，無法獲取高產(chǎn)菌株；為了解決該問題，本發(fā)明提供一種快速高效篩選維生素k2(mk-7)高產(chǎn)菌的方法。具體的，本方案為：一種快速高效篩選維生素k2高產(chǎn)菌的方法，其中，以納豆芽孢桿菌為出發(fā)菌株，經(jīng)常壓室溫等離子體(artp)誘變?cè)季?，誘變后的菌株用含維生素k2結(jié)構(gòu)類似物的平板選育后，再在含呼吸鏈抑制劑的平板上進(jìn)行選育，并經(jīng)96孔培養(yǎng)板發(fā)酵復(fù)篩，獲取維生素k2高產(chǎn)菌。本發(fā)明所述的方法，其中，具體步驟為：(1)將納豆芽孢桿菌出發(fā)菌株在種子培養(yǎng)基中活化；(2)將滅菌的金屬載片置于已滅菌的玻璃平板中，將活化后的納豆菌菌懸液均勻涂布于載片上，分別在artp-ii型誘變機(jī)中進(jìn)行誘變；(3)納豆菌菌懸液誘變完成后，將其用生理鹽水洗脫，并涂布在添加維生素k2結(jié)構(gòu)類似物無菌平板上，挑選出單菌落在96孔培養(yǎng)板中發(fā)酵，將維生素k2高產(chǎn)菌株進(jìn)行保藏；(4)將步驟(3)獲得的納豆芽孢桿菌活化后，均勻涂布在添加呼吸鏈抑制劑無菌平板上，挑選出單菌落在96孔培養(yǎng)板中發(fā)酵，將維生素k2高產(chǎn)菌株進(jìn)行保藏。本發(fā)明所述的方法，其中，所述步驟(2)中，常壓室溫等離子體誘變采用artp-ii型誘變機(jī)，以時(shí)間為可變參數(shù)，功率設(shè)定為100w，氣流量設(shè)定為10slm，調(diào)整誘變時(shí)間為30～150s。本發(fā)明所述的方法，其中，在k2結(jié)構(gòu)類似物無菌平板中添加了2.5～20mg/l維生素k2結(jié)構(gòu)類似物，所述維生素k2類似物為1-羥基-2-萘甲酸、2-甲基-1,4-萘醌、對(duì)苯醌、1-萘酚中的一種或幾種。本發(fā)明所述的方法，其中，所述步驟(4)中，添加呼吸鏈抑制劑無菌平板中添加了5～200mg/l呼吸鏈抑制劑，所述呼吸鏈抑制劑為魚藤酮和氰化物中的一種或幾種。本發(fā)明所述的方法，其中，所述步驟(1)中，種子培養(yǎng)基為30g/l葡萄糖，40g/l蛋白胨，5g/lnacl，5g/l牛肉膏，5g/l酵母膏，培養(yǎng)溫度37℃，120rpm培養(yǎng)1d。本發(fā)明中所述的維生素k2為mk-7型。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，包括如下步驟：(1)將納豆芽孢桿菌原始菌株在種子培養(yǎng)基上活化；(2)根據(jù)菌濃度計(jì)算稀釋倍數(shù)，利用滅菌后的生理鹽水將活化菌液的od600稀釋至0.5～2.0之間，取10ul菌液均勻涂于金屬載片上，不經(jīng)風(fēng)干，將裝有樣品的金屬載片移至artp誘變系統(tǒng)操作倉(cāng)進(jìn)行誘變實(shí)驗(yàn)。其中，artp誘變時(shí)間為30s、45s、60s、90s、120s和150s，優(yōu)選60s。(3)納豆菌菌懸液誘變完成后，將其用生理鹽水洗脫，并涂布在添加維生素k2結(jié)構(gòu)類似物無菌平板上；對(duì)新的菌懸液進(jìn)行適當(dāng)稀釋、涂布含維生素k2結(jié)構(gòu)類似物的初篩平板，培養(yǎng)計(jì)數(shù)，挑選生長(zhǎng)旺盛的單菌落進(jìn)行96孔培養(yǎng)板發(fā)酵，對(duì)維生素k2高產(chǎn)菌株進(jìn)行保藏；其中，所述的維生素k2結(jié)構(gòu)類似物為1-羥基-2-萘甲酸、2-甲基-1,4-萘醌、對(duì)苯醌、1-萘酚中的任意一種或幾種的混合物。添加濃度為2.5～20mg/l，優(yōu)選5mg/l。(4)對(duì)步驟3獲得的維生素k2高產(chǎn)菌株進(jìn)行培養(yǎng)后，適當(dāng)稀釋、涂布含呼吸鏈抑制劑的初篩平板，培養(yǎng)計(jì)數(shù)，挑選生長(zhǎng)旺盛的單菌落進(jìn)行96孔培養(yǎng)板發(fā)酵，對(duì)維生素k2高產(chǎn)菌株進(jìn)行保藏；其中，所述的呼吸鏈抑制劑為魚藤酮和氰化物乙腈中的任意一種或幾種的混合物。魚藤酮的添加濃度為20～200mg/l，優(yōu)選150mg/l；乙腈的添加濃度為5～80mg/l優(yōu)選20mg/l。(5)將上述高產(chǎn)菌株進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)。按5％接種量接種到裝有100ml發(fā)酵培養(yǎng)基的帶擋板的500ml三角瓶中，發(fā)酵培養(yǎng)基為50g/l甘油、30g/l大豆蛋白胨、0.6g/l酵母粉、0.3g/lk2hpo4、0.1g/lcacl2·h2o、0.3g/lmgso4.7h2o，在37℃下200rpm培養(yǎng)3d。本發(fā)明的有益效果在于：(1)本發(fā)明所采取常壓室溫等離子體誘變能使微生物細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及通透性發(fā)生改變，引起基因損傷，artp富含的高活性能量粒子對(duì)菌體的遺傳物質(zhì)造成損傷，并誘發(fā)細(xì)胞啟動(dòng)sos修復(fù)機(jī)制。而修復(fù)過程中會(huì)產(chǎn)生豐富的基因突變位點(diǎn)，并最終穩(wěn)定遺傳進(jìn)而形成突變株。與傳統(tǒng)誘變方式相比，具有正突變率高，操作簡(jiǎn)介，誘變成本低，適用范圍廣和易獲得遺傳穩(wěn)定性良好的突變菌等優(yōu)點(diǎn)。(2)本發(fā)明所公開的誘變手段再結(jié)合結(jié)構(gòu)類似物進(jìn)行抗性篩選，可以阻礙代謝物的正常生成，定向的改變了反饋抑制的酶的結(jié)構(gòu)(抗反饋抑制)，或者改變了阻遏的酶的生成的系統(tǒng)(抗反饋?zhàn)瓒?，所以只有對(duì)結(jié)構(gòu)類似物并不敏感的突變菌才能繼續(xù)生長(zhǎng)，大大提高了篩選頻率。(3)本發(fā)明所公開的誘變手段再結(jié)合呼吸鏈抑制劑進(jìn)行抗性篩選，可以使納豆芽孢桿菌呼吸鏈?zhǔn)茏瑁T導(dǎo)菌種定向向抗呼吸鏈抑制劑的方向突變。分離出來的菌株外形大致分為三種，分別為白色褶皺形、全透明水滴形和膜包裹的半透明菌落。全透明水滴形和膜包裹的高粘性透明菌落，有拉絲情況出現(xiàn)，而白色褶皺菌落的mk-7含量較高。附圖說明圖1實(shí)施例6三種典型突變菌體形態(tài)對(duì)比圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例1：本實(shí)施例說明本發(fā)明的生物材料來源信息本發(fā)明中的生物材料為納豆芽孢桿菌，分離自市場(chǎng)上購(gòu)買的納豆產(chǎn)品。實(shí)施例2：本實(shí)施例子說明artp誘變的過程將納豆芽孢桿菌在固體平板上活化培養(yǎng)，活化培養(yǎng)后的菌體用生理鹽水懸浮。用生理鹽水將菌體適當(dāng)稀釋成od600值在0.5～2.0之間，于超凈臺(tái)將金屬載片置于酒精燈外焰灼燒30s，冷卻后放到已滅菌的玻璃平板中，取10ul菌懸液均勻涂于載片，不經(jīng)風(fēng)干，進(jìn)行誘變。artp誘變系統(tǒng)操作倉(cāng)先開紫外滅菌30min，再用無菌鑷子將載片放至artp誘變系統(tǒng)操作倉(cāng)，調(diào)節(jié)載臺(tái)下方旋鈕，使載片處于氣流端口2mm處。設(shè)置儀器功率為100w、氣流量參數(shù)為10slm，以誘變時(shí)間為可變參數(shù)，誘變時(shí)間為30s、45s、60s、90s、120s、150s。樣品處理完畢，將載片放至裝有490ul生理鹽水的ep管中，震蕩5min，把納豆芽孢桿菌洗脫到液體中，形成新的菌懸液。結(jié)果表明，經(jīng)等離子體射流處理30s、45s、60s、90s、120s和150s，其致死率分別為19.89％、37.63％、58.18％、90.91％、98.18％和100％。實(shí)施例3：本實(shí)施例說明結(jié)構(gòu)類似物濃度臨界值確定的過程將活化培養(yǎng)后的菌體用生理鹽水稀釋至10-1～10-7之間，取100ul稀釋液涂布平板。其中，固體平板的配方為：30g/l葡萄糖，40g/l蛋白胨，5g/lnacl，5g/l牛肉膏，5g/l酵母膏，20g/l瓊脂，2.5～20mg/l1,4-二羥基-2-萘甲酸、對(duì)苯醌、2-甲基-1,4-萘醌或1-萘酚。結(jié)構(gòu)類似物由于與代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)相似，能與阻遏物及變構(gòu)酶相結(jié)合，使酶的催化作用不可逆地被抑制。以不同種類維生素k2結(jié)構(gòu)類似物作為預(yù)篩選來確定納豆芽孢桿菌的敏感性臨界值，選育抗性突變株，一系列濃度的類似物添加到平板上。表1維生素k2結(jié)構(gòu)類似物抗性濃度試驗(yàn)濃度(mg/l)2.557.51015201-羥基-2-萘甲酸+++±±－對(duì)苯醌+++±±－2-甲基-1,4-萘醌++±±－－1-萘酚++++±±note：“+”good；“±”bad；“－”nd由上述試驗(yàn)結(jié)果得出，當(dāng)1-羥基-2-萘甲酸的濃度低于10mg/l時(shí)，b.natto生長(zhǎng)良好；當(dāng)其濃度高于20mg/l時(shí)，b.natto不生長(zhǎng)。當(dāng)2-甲基-1,4-萘醌和1-萘酚的濃度分別低于7.5mg/l和15mg/l時(shí)，b.natto生長(zhǎng)良好。實(shí)施例4：本實(shí)施例說明基于維生素k2結(jié)構(gòu)類似物篩選菌株的過程在此基礎(chǔ)上，將artp誘變與結(jié)構(gòu)類似物結(jié)合，分別對(duì)處理30s、60s和90s的菌懸液涂布在含5mg/l、10mg/l或20mg/l的預(yù)篩平板上。挑取長(zhǎng)出的單菌落接入裝有0.5～1ml的96孔培養(yǎng)板上發(fā)酵。其中，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：50g/l甘油、30g/l大豆蛋白胨、0.6g/l酵母粉、0.3g/lk2hpo4、0.1g/lcacl2·h2o、0.3g/lmgso4.7h2o。在37℃的搖床中，以200rpm的轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)72h，經(jīng)高效液相色譜法檢測(cè)。hplc方法：色譜柱：c18柱，柱溫：50℃，流動(dòng)相：甲醇，流速：1ml/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)270nm，進(jìn)樣量：30ul，檢測(cè)時(shí)間：35min。表2artp與結(jié)構(gòu)類似物結(jié)合的誘變效果表中結(jié)果為各條件下篩選出的最高mk-7產(chǎn)量，由上述試驗(yàn)結(jié)果，最終將誘變60s的菌體涂布于含5mg/l1-羥基-2-萘甲酸的平板上作為最適條件。獲得的突變菌b.nattoa1-1的mk-7產(chǎn)量為15.19mg/l，比原始菌提高了83.90％。實(shí)施例5：本實(shí)施例說明呼吸鏈抑制劑濃度臨界值確定的過程將活化培養(yǎng)后的菌體用生理鹽水稀釋至10-1～10-7之間，取100ul稀釋液涂布平板。其中，固體平板的配方為：30g/l葡萄糖，40g/l蛋白胨，5g/lnacl，5g/l牛肉膏，5g/l酵母膏，20g/l瓊脂，20～200mg/l魚藤酮或5～80mg/l乙腈。以不同種類呼吸鏈抑制劑作為預(yù)篩選來確定納豆芽孢桿菌的敏感性臨界值，選育抗性突變株，一系列濃度的類似物添加到平板上。表3呼吸鏈抑制劑抗性濃度試驗(yàn)濃度(mg/l)205080100150200魚藤酮+++±±－濃度(mg/l)51020406080乙腈++±±－－note：“+”good；“±”bad；“－”nd。由上述試驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)魚藤酮的濃度低于100mg/l時(shí)，b.natto生長(zhǎng)良好；當(dāng)其濃度高于200mg/l時(shí)，b.natto不生長(zhǎng)。當(dāng)乙腈的濃度低于20mg/l時(shí)，b.natto生長(zhǎng)良好；當(dāng)其濃度高于60mg/l時(shí)，b.natto不生長(zhǎng)。魚藤酮阻斷電子由nadh向coq的傳遞，氰化物阻斷電子由細(xì)胞色素aa3到氧的傳遞。而在菌體中，維生素k2的產(chǎn)量與菌種的發(fā)育和生理狀態(tài)有關(guān)，依賴于編碼相關(guān)基因的表達(dá)的活性高低。維生素k2在b.natto的呼吸鏈中起著主要的電子轉(zhuǎn)移作用，如果要提高維生素k2的產(chǎn)量，在培養(yǎng)基中添加呼吸鏈抑制劑，由于使呼吸鏈?zhǔn)茏?，所以誘導(dǎo)菌種定向向抗呼吸鏈抑制劑的方向突變。實(shí)施例6：本實(shí)施例說明基于呼吸鏈抑制劑篩選菌株的過程將實(shí)施例4中獲得的納豆芽孢桿菌經(jīng)活化后，稀釋涂布在含80mg/l、150mg/l魚藤酮和10mg/l、20mg/l乙腈的預(yù)篩平板上。挑取長(zhǎng)出的單菌落接入裝有0.5～1ml的96孔培養(yǎng)板上發(fā)酵。其中，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：50g/l甘油、30g/l大豆蛋白胨、0.6g/l酵母粉、0.3g/lk2hpo4、0.1g/lcacl2·h2o、0.3g/lmgso4.7h2o。在37℃的搖床中，以200rpm的轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)72h，經(jīng)高效液相色譜法檢測(cè)。表4呼吸鏈抑制劑的誘變效果由上述試驗(yàn)結(jié)果，最終將誘變60s的菌體涂布于含20mg/l乙腈的平板上作為最適條件。獲得的突變菌b.nattoa5-1的mk-7產(chǎn)量為23.61mg/l，比原始菌提高了185.84％；b.nattoa13-12的mk-7產(chǎn)量為25.51mg/l，比原始菌提高了208.84％。本發(fā)明所公開的誘變手段分離出來的菌株外形大致分為三種，依次標(biāo)為a、b、c三大類，分別為白色褶皺形a類、全透明水滴形b類和膜包裹的半透明菌落c類，如附圖1所示。全透明水滴形和膜包裹的高粘性透明菌落，有拉絲情況出現(xiàn)，而白色褶皺菌落的mk-7含量較高。實(shí)施例7：菌株發(fā)酵性能考察將-80℃保藏的高產(chǎn)菌接種至裝有100ml種子培養(yǎng)基的帶擋板的500ml三角瓶中，在37℃下，120rpm振蕩培養(yǎng)1d。將活化兩代的種子液按5％接種量接種到裝有100ml發(fā)酵培養(yǎng)基的帶擋板的500ml三角瓶中，在37℃下200rpm培養(yǎng)。種子培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g/l、牛肉浸膏5g/l、酵母膏5g/l、葡萄糖30g/l、nacl5g/l，ph7.0，121℃，20min。發(fā)酵培養(yǎng)基：50g/l甘油、30g/l大豆蛋白胨、0.6g/l酵母粉、0.3g/lk2hpo4、0.1g/lcacl2·h2o、0.3g/lmgso4.7h2o，ph7.0，121℃，20min。結(jié)果如表6所示。表6不同菌株發(fā)酵性能比較表菌體形態(tài)甘油消耗速率(g/l/h)最大od600mk-7(mg/l)對(duì)照(d)白色褶皺狀0.8930.658.26b.nattoa1-1透明水滴狀1.4730.2215.19b.nattoa5-1白色褶皺狀1.0038.2123.61b.nattoa13-12白色褶皺狀0.9442.1725.51由上述試驗(yàn)結(jié)果，同時(shí)對(duì)b.nattoa1-1、a5-1和a13-12三株菌進(jìn)行發(fā)酵性能考察。與原始菌相比，突變菌a1-1的甘油消耗速率在24h內(nèi)達(dá)到1.47g/l/h，但其生物量較低，最大od600為30.22，mk-7產(chǎn)量為15.19mg/l。突變菌a1-1為透明水滴狀，發(fā)酵液顏色較深且較為粘稠，菌液有拉絲，其消耗的甘油大多用于γ-聚谷氨酸等其他物質(zhì)的合成，導(dǎo)致mk-7產(chǎn)量較低。突變菌a5-1mk-7產(chǎn)量為23.61mg/l，甘油消耗速率與突變菌a13-12相似，較a1-1慢，在24h時(shí)，其甘油消耗速率僅為1.00g/l/h，后續(xù)其甘油消耗速率加快，72h時(shí)基本消耗完全。a13-12mk-7產(chǎn)量最高，為25.51mg/l。a13-12生物量較大，最大od600達(dá)到42.17。當(dāng)前第1頁(yè)12