本發(fā)明涉及crispr/cas9技術(shù)在獲得家蠶鋅指蛋白基因突變體中的應(yīng)用，屬家蠶育種和基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

家蠶(bombyxmori)，完全變態(tài)的鱗翅目昆蟲(chóng)，是目前最重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)之一。養(yǎng)蠶繅絲的發(fā)明是中國(guó)人民對(duì)世界文明作出的卓越貢獻(xiàn)。轉(zhuǎn)錄因子是家蠶中非常重要的基因，家蠶很多性狀均受轉(zhuǎn)錄因子家族基因調(diào)控，研究各種轉(zhuǎn)錄因子的功能對(duì)家蠶育種和絲質(zhì)改良以及作為生物反應(yīng)器表達(dá)外源蛋白具有非常重要的意義。

現(xiàn)代生物技術(shù)，包括轉(zhuǎn)基因技術(shù)和測(cè)序技術(shù)等的快速發(fā)展，為傳統(tǒng)蠶絲業(yè)帶來(lái)新的發(fā)展機(jī)遇和廣闊的前景，特別是crispr/cas9系統(tǒng)，在生命科學(xué)領(lǐng)域可謂是掀起了一場(chǎng)全新的技術(shù)革命。

在家蠶中已經(jīng)成功應(yīng)用crispr/cas9系統(tǒng)對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行了基因編輯，但是還沒(méi)有對(duì)轉(zhuǎn)錄因子基因相關(guān)的研究被報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于為轉(zhuǎn)錄因子的研究提供一種可實(shí)施的方法，提供crispr/cas9技術(shù)在獲得家蠶鋅指蛋白基因突變體中的應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

利用crispr/cas9技術(shù)獲得家蠶鋅指蛋白基因突變體的方法，從ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得鋅指蛋白基因(bgibmga014418-ta)全序列，獲得cds序列，預(yù)測(cè)活性結(jié)構(gòu)域，并在其附近設(shè)計(jì)sgrna位點(diǎn)，而后預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)起作用的靶位點(diǎn)，將起作用的sgrna和cas9mrna按1：1的比例混合后顯微注射到家蠶卵中，用新鮮桑葉飼養(yǎng)孵化蟻蠶并觀察表型，等到出現(xiàn)表型之后對(duì)有表型的蠶進(jìn)行基因型檢測(cè)，確定基因功能。

所述sgrna核心位點(diǎn)序列為cccagatgcctgaccctaagact，cctgaccctaagacttacaaaca或cctaagaacgatctaccagatga；核心位點(diǎn)序列三個(gè)小寫堿基為pam位點(diǎn)。

所述sgrna通過(guò)以下方法得到：

步驟s1，獲得家蠶鋅指蛋白基因堿基序列，預(yù)測(cè)活性結(jié)構(gòu)域，并在其附近設(shè)計(jì)sgrna位點(diǎn)；

步驟s2，在設(shè)計(jì)好的sgrna核心位點(diǎn)序列前部加上t7啟動(dòng)子序列，在sgrna核心位點(diǎn)序列后部加上與crrna/tracrrna互補(bǔ)的序列，得到完整的sgrna5’端dna片段；

步驟s3，人工合成步驟s2中獲得的dna片段和80bp的crrna/tracrrna序列，兩個(gè)片段變性退火延伸生成完整的sgrnadna序列；

步驟s4，步驟s3中獲得的sgrna脫氧核苷酸序列在體外轉(zhuǎn)錄成sgrna核苷酸序列。

所述cas9mrna通過(guò)以下方法得到：將cas9載體采用noti(neb)線性化酶酶切，獲得線性化的cas9載體，然后應(yīng)用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒mmessaget7kit將cas9載體轉(zhuǎn)錄成有翻譯活性的cas9mrna。

進(jìn)一步地，所述cas9mrna和sgrna按1：1濃度混合，cas9mrna和sgrna的濃度均為1000ng/ul。

本發(fā)明的機(jī)理如下：本發(fā)明應(yīng)用crispr/cas9基因編輯技術(shù)對(duì)家蠶進(jìn)行了鋅指蛋白基因敲除，首先確定多化品系nistari家蠶鋅指蛋白基因序列，根據(jù)序列設(shè)計(jì)編碼鏈和非編碼鏈sgrna靶位點(diǎn)，然后加上啟動(dòng)子和crrna/tracrrna保守序列，體外轉(zhuǎn)錄成sgrna核苷酸序列；線性化cas9載體，得到cas9mrna，將sgrna和cas9mrna共同注射到家蠶卵中，cas9mrna在家蠶中進(jìn)行表達(dá)得到cas9蛋白，sgrna引導(dǎo)cas9蛋白到指定靶點(diǎn)，對(duì)基因進(jìn)行定點(diǎn)切割，通過(guò)非同源重組的方式對(duì)鋅指蛋白基因進(jìn)行基因編輯，影響家蠶鋅指蛋白基因的正常表達(dá)。

因?yàn)殇\指蛋白基因較小，很難進(jìn)行大片段敲除，也很難進(jìn)行檢測(cè)，我們?cè)诨钚越Y(jié)構(gòu)域附近設(shè)計(jì)了3個(gè)位點(diǎn)，成功的篩選到了敲除了活性結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白基因突變體。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明將crispr/cas9基因編輯技術(shù)應(yīng)用在轉(zhuǎn)錄因子的功能研究中，實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)錄因子基因進(jìn)行基因編輯，并成功敲除其活性結(jié)構(gòu)域以研究其功能。

附圖說(shuō)明

圖1為sgrna結(jié)構(gòu)和序列。t7promoter：t7啟動(dòng)子，20n區(qū)域?yàn)閟grna可變序列，即pam位點(diǎn)前的sgrna核心序列。

圖2為鋅指蛋白基因突變體檢測(cè)上、下游引物序列。

圖3鋅指蛋白基因敲除克隆檢測(cè)。

圖4鋅指蛋白基因敲除篩選出的純合突變體基因序列。

圖5鋅指蛋白基因敲除雜合突變體表型呈現(xiàn)多態(tài)性。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例1

從silkdb家蠶數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得家蠶鋅指蛋白基因(基因編號(hào)為bgibmga014418-ta)，設(shè)計(jì)引物驗(yàn)證基因序列后獲得nistari谷氨酸合成酶基因序列。應(yīng)用在線軟件crisprdirect設(shè)計(jì)20bp的sgrna核心序列，篩選出三個(gè)靶位點(diǎn)合成序列cccagatgcctgaccctaagact，cctgaccctaagacttacaaaca或cctaagaacgatctaccagatga分別在前面加上gaaattaatacgactcactatat7啟動(dòng)子序列，和與crrna/tracrrna互補(bǔ)的片段gttttagagctagaaatagc，人工合成為62bp的前引物，與后引物crrna/tracrrna經(jīng)過(guò)pcr程序，獲得完整的sgrna序列，見(jiàn)圖1。

采用的試劑如表1所示。pcr反應(yīng)條件如表2所示。

表1sgrna合成體系

表2sgrna合成pcr反應(yīng)溫度和程序

應(yīng)用qaigen公司的minelutepcr純化試劑盒對(duì)pcr產(chǎn)物進(jìn)行純化，pcr純化獲得完整的sgrna序列。具體步驟如下：

1、100ulpcr產(chǎn)物，加500ulbufferpb，混勻；

2、加入準(zhǔn)備好的離心柱中，放置1min，12000×g離心1min；

3、倒掉廢液，加入750ulbufferpe,12000×g離心1min；

4、空管離心1min；

5、換新的1.5ep管加10ul滅菌水，靜置1min，離心1min。獲得的sgrna序列即作為體外轉(zhuǎn)錄模版。

sgrna體外轉(zhuǎn)錄

具體操作步驟參見(jiàn)maxit7transcriptionkit(北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司)按照表3反應(yīng)體系加入相應(yīng)試劑。

表3sgrna體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

混勻，37℃孵育4h，

加入1μlturbodnase，混勻，37℃孵育15min,

加入29μl水使反應(yīng)體積達(dá)到50μl，

加入5μl5mammoniumacetate(乙酸銨)，混勻，

加入3倍體積100％ethanol(乙醇)，混勻，

放置-20℃2h，4℃離心20min，

倒掉上清，用70％乙醇洗滌一次，4℃離心20min，倒掉上清，將沉淀晾干，加入適量水溶解，即為可用于注射的sgrna，放入-80℃冰箱備用。

cas9質(zhì)粒線性化

使用noti(neb)酶對(duì)cas9質(zhì)粒進(jìn)行線性化，cas9線性化體系，如表4所示。

表4cas9線性化體系

割膠回收，應(yīng)用qaigen公司的膠回收試劑盒(qiagelextractionkit)進(jìn)行回收，具體步驟參見(jiàn)試劑說(shuō)明書(shū),獲得的線性化質(zhì)粒即作為體外轉(zhuǎn)錄模版。

cas9體外轉(zhuǎn)錄

具體步驟參見(jiàn)mmessaget7kitwithmanual說(shuō)明書(shū)按照表5反應(yīng)體系加入相應(yīng)試劑。

表5cas9mrna體外轉(zhuǎn)錄

混勻，37℃孵育3h，

加入1μlturbodnase，混勻，37℃孵育15min,

加入30μl水使反應(yīng)體積達(dá)到50μl，加入30μlliclprecipitationsolution，混勻，-20℃放置2h，4℃離心15min，倒掉上清，用70％乙醇洗滌一次，倒掉上清，將沉淀晾干，加入適量水溶解，即為用于注射的具有轉(zhuǎn)錄活性的cas9mrna，放入-80℃冰箱備用。

顯微注射實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

在顯微注射前一天要將所有在實(shí)驗(yàn)中要用到的東西進(jìn)行滅菌或消毒，如對(duì)雙蒸水進(jìn)行滅菌，注射所用針，消毒棉，注射后孵化盒等，對(duì)顯微注射室內(nèi)進(jìn)行紫外消毒。將產(chǎn)卵紙上涂上膠水，晾干備用。

注射卵的制備

交配用的蛾子應(yīng)提前放入冰箱過(guò)夜后再?gòu)谋渲心贸觯a(chǎn)卵時(shí)要制造黑暗環(huán)境，且溫度不能太低，應(yīng)保持在25-28℃。當(dāng)發(fā)現(xiàn)母蛾?duì)顟B(tài)不好或蠶卵狀態(tài)不好時(shí)，將蠶卵丟掉。

顯微注射預(yù)實(shí)驗(yàn)

將按1：1混合好的cas9和sgrna注射到已經(jīng)準(zhǔn)備好的卵中，放入37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2到3天，取84顆注射卵(一板)提取基因組，pcr檢測(cè)，篩選工作效率高的位點(diǎn)用于后期顯微注射。

顯微注射

將在黑暗環(huán)境下產(chǎn)在事先涂有膠水的產(chǎn)卵紙上的卵放入無(wú)菌雙蒸水中，浸泡五到十分鐘，直到能用共線筆輕易掃下，然后用清水洗滌3遍，直至卵被洗干凈；然后將蠶卵按照較厚的一面朝向注射的一面的規(guī)則將卵擺放整齊，吹干，沾膠二次固定，再吹干；用顯微注射儀的雙針注射系統(tǒng)進(jìn)行顯微注射已經(jīng)按1：1混合好的cas9mrna和sgrna混合物，cas9mrna和sgrna的濃度均為1000ng/ul，在注射的時(shí)候傷口要小，以減少對(duì)蠶卵的傷害。注射時(shí)朝蠶卵較厚的一面的中間部位注射，以提高成活率和敲除效率。

顯微注射后飼養(yǎng)和表型觀察

顯微注射后孵化的蟻蠶飼養(yǎng)在室溫條件下，喂食新鮮桑葉。在飼養(yǎng)的過(guò)程中觀察表型，發(fā)現(xiàn)注射后的蠶80％都在幼蟲(chóng)期死亡，而成功化蛹個(gè)體繭層也很薄，在繼代飼養(yǎng)和純合突變體篩選中每一代都有大批蠶在幼蟲(chóng)期死亡，且純合突變體的后代不能傳代，雜合突變體蛹期呈現(xiàn)多態(tài)性(薄繭、裸蛹)。

檢測(cè)有表型個(gè)體基因型，確定基因功能

提取死亡家蠶個(gè)體基因組，pcr擴(kuò)增基因，克隆測(cè)序，確定基因型。發(fā)現(xiàn)死亡個(gè)體大部分都是雜合突變體，由此能確定缺失鋅指蛋白會(huì)使家蠶變?nèi)酰绊懫湔ＩL(zhǎng)。

具體方法如下：

應(yīng)用天根血液/組織提取試劑盒提取dna，應(yīng)用先前確定基因片段序列的引物作為pcr引物，應(yīng)用pmd19-t載體作為骨架載體，檢測(cè)引物為m13通用引物進(jìn)行克隆測(cè)序，獲得的序列應(yīng)用seqman軟件進(jìn)行分析。pcr程序具體如表6(mix為康為試劑的產(chǎn)品)。pcr反應(yīng)條件如表7所示。pcr結(jié)束后進(jìn)行sanger測(cè)序，克隆載體應(yīng)用takara的pmd19-tvectorcloningkit克隆體系，16℃過(guò)夜連接，而后轉(zhuǎn)入大腸桿菌，具體反應(yīng)如表8所示，具體方法如下：

1、從-80℃冰箱中取100μl感受態(tài)細(xì)胞懸液置冰上；

2、加入上述質(zhì)粒dna溶液(10μl全部加入)搖勻，冰上放置30分鐘；

3、42℃水浴熱激50秒，熱激后迅速置于冰上冷卻2分鐘；

4、向管中加入500ullb液體培養(yǎng)基(不含amp)，混勻后37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因(ampr)；

5、將上述菌液搖勻后取100μl涂布于含amp的篩選平板上，正面向上放置半小時(shí)，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)8小時(shí)；

6、克隆測(cè)序。

表6pcr反應(yīng)體系

表7pcr反應(yīng)溫度和程序

表8pmd^tm19-tvectorcloningkit克隆體系