本發(fā)明涉及腫瘤生物治療中主動(dòng)特異性免疫技術(shù)，尤其是提供了一種重組人tɑ1-fc融合蛋白抗腫瘤藥物及制備工藝，以達(dá)到預(yù)防和治療腫瘤的目的，屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：胸腺肽ɑ1由28個(gè)氨基酸組成，主要分布在胸腺組織，尤其是胸腺上皮細(xì)胞中，另外，也存在于淋巴組織(如脾、淋巴結(jié))和非淋巴組織(如肺、腎和腦)中，其分泌和釋放并不受其他激素或者釋放因子所調(diào)節(jié)。胸腺肽ɑ1可以增強(qiáng)tregs、il-1β、tnf-ɑ和il-6等免疫作用，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，降低促炎癥因子水平，減輕炎癥介質(zhì)作用，抗腫瘤作用，對(duì)其他疾病也有顯著的治療效果。但胸腺肽ɑ1在體內(nèi)易被降解失活，體內(nèi)半衰期很短(<2h)。fc是抗體經(jīng)木瓜蛋白酶/胃蛋白酶水解后的一個(gè)片段。據(jù)報(bào)道fc片段能顯著性提高與之結(jié)合的生物活性蛋白的半衰期。fc融合蛋白賦予所融合功能蛋白類似抗體的特性，包括延長(zhǎng)其血漿半衰期以及fc片段特有的一系列特有的效應(yīng)功能，可廣泛應(yīng)用于免疫治療、免疫診斷、抗體純化及蛋白分析定量等生物醫(yī)學(xué)研究中。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：：本發(fā)明利用基因工程的方法，提供一種重組人tɑ1-fc融合蛋白、制備方法及用途。本發(fā)明所述tɑ1-fc融合蛋白能夠用于腫瘤生物治療中特異性免疫，達(dá)到高效且副作用低的治療腫瘤的目的。本發(fā)明將igg1fc基因與人tɑ1基因融合在一起，導(dǎo)入原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中直接高效誘導(dǎo)表達(dá)tɑ1-fc融合蛋白。得到的tɑ1-fc融合蛋白既具有胸腺肽ɑ1的效應(yīng)功能又具有抗體的一系列功能。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：一種雙重功效融合蛋白，由胸腺肽α1通過(guò)連接肽或者直接與免疫球蛋白恒定區(qū)連接而成，所述融合蛋白氨基酸序列如seqidno:1所示。本發(fā)明的另一目的在于提供本發(fā)明所述融合蛋白的制備方法，包括如下步驟：(1)設(shè)計(jì)合成并克隆得到本發(fā)明所述融合蛋白的編碼基因；(2)構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌中進(jìn)行表達(dá)；(3)收集菌泥及破壁，收集破壁液上清，分離純化后得到。本發(fā)明一個(gè)具體的方案如下，(1)將將fc基因連在tɑ1基因之后，構(gòu)建原核表達(dá)載體pet-32a，通過(guò)酶切鑒定重組載體的正確性。(2)表達(dá)tɑ1-fc融合蛋白的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(de3)，在乳糖的誘導(dǎo)下，表達(dá)融合蛋白tɑ1-fc，通過(guò)sds-page和westernblot鑒定其正確性。(3)常規(guī)基因測(cè)序測(cè)定tɑ1-fc融合蛋白的基因序列。(4)大量培養(yǎng)重組大腸桿菌，經(jīng)超聲破碎提取全菌上清液，通過(guò)histraptm-hp柱/proteina柱→histraptmdesalting柱獲得較純的tɑ1-fc融合蛋白。通過(guò)sds-page得到鑒定。對(duì)本發(fā)明所述融合蛋白tɑ1-fc抗腫瘤及免疫活性進(jìn)行了測(cè)定，包括：(1)tɑ1-fc抗鼠乳腺癌活性：將鼠乳腺癌細(xì)胞4t1皮下注射到balb/c小鼠體內(nèi)，10天后給藥并測(cè)量腫瘤體積。持續(xù)3周左右。(2)tɑ1-fc抗人乳腺癌活性：將人乳腺癌細(xì)胞mcf-7皮下注射到裸鼠體內(nèi)，10天后給藥并測(cè)量腫瘤體積。持續(xù)4周左右。(3)tɑ1-fc免疫增強(qiáng)活性：將40mg/kg氫化可的松(hc)皮下注射到六周齡雄性icr小鼠體內(nèi)，持續(xù)7天左右，構(gòu)建小鼠免疫抑制模型，給藥7天，測(cè)脾和胸腺指數(shù)及血清中細(xì)胞因子含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明所述融合蛋白tɑ1-fc相較于胸腺肽ɑ1具有優(yōu)越的抗腫瘤和免疫增強(qiáng)活性。本發(fā)明的另一目的在于提供本發(fā)明所述融合蛋白在制備治療原發(fā)性或繼發(fā)性t細(xì)胞缺陷病、自身免疫性疾病，細(xì)胞免疫功能低下疾病及癌癥藥物中的應(yīng)用。所述原發(fā)性或繼發(fā)性t細(xì)胞缺陷病、自身免疫性疾病，細(xì)胞免疫功能低下疾病包括重癥肝炎、慢性活動(dòng)性肝炎、慢性遷延性肝炎及肝硬化、帶狀皰疹、生殖器皰疹、尖銳濕疣、支氣管炎、支氣管哮喘、肺結(jié)核、上呼吸道感染、紅斑狼瘡、風(fēng)濕性及類風(fēng)濕性疾病、強(qiáng)直性脊柱炎、格林巴利綜合癥、再生障礙性貧血、白血病、血小板減少癥、病毒性角膜炎、病毒性結(jié)膜炎、過(guò)敏性鼻炎、老年性早衰、婦女更年期綜合癥、多發(fā)性癤腫及面部皮膚痤瘡等，銀屑病、扁平苔癬、鱗狀細(xì)胞癌及上皮角化癥、兒童先天性免疫缺陷癥等。所述癌癥優(yōu)選為各種腺癌及其轉(zhuǎn)移癌。本發(fā)明的另一目的在于提供包括本發(fā)明所述融合蛋白及藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。進(jìn)一步的，所述藥物組合物還包括抗病毒藥物、促細(xì)胞生長(zhǎng)素或化療藥物。本發(fā)明適用于下述醫(yī)療用途：1.預(yù)防和治療各種腺癌及其轉(zhuǎn)移癌。2.治療免疫缺陷。3.與抗病毒藥物聯(lián)合用藥。4.與促細(xì)胞生長(zhǎng)素聯(lián)合用藥。5.與化療藥物配伍使用。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)：目前腫瘤治療采取綜合療法包括手術(shù)、放療和化療。癌癥患者在接受手術(shù)或放化療后免疫系統(tǒng)會(huì)受到不同程度的的損傷。胸腺肽ɑ1是從胸腺中獲得的重要免疫增強(qiáng)劑，已成功用于臨床腫瘤輔助治療，可以降低血液及神經(jīng)毒性，有助于免疫抑制的逆轉(zhuǎn)，推遲復(fù)發(fā)時(shí)間和延長(zhǎng)存活時(shí)間。但胸腺肽ɑ1在體內(nèi)易被降解失活，體內(nèi)半衰期很短(<2h)。本發(fā)明利用fc片段賦予所融合功能蛋白類似抗體的特性，得到的融合蛋白tɑ1-fc相較于胸腺肽ɑ1具有更優(yōu)越的抗腫瘤和免疫增強(qiáng)活性。可廣泛應(yīng)用于免疫治療、免疫診斷、抗體純化及蛋白分析定量等生物醫(yī)學(xué)研究中。附圖說(shuō)明圖1是tɑ1-fc融合蛋白的sds-page圖及westernblot鑒定。(圖1-1m表示蛋白mark；1表示未加入誘導(dǎo)劑時(shí)菌體破碎上清；2表示加入誘導(dǎo)劑后菌體破碎上清；箭頭指示目的蛋白位置；圖1-2b為是融合蛋白sds-page圖片，1-2a是檢測(cè)融合蛋白tɑ1部分，1-2c是檢測(cè)融合蛋白igg1fc片段)。圖2是tɑ1-fc融合蛋白的純化圖(m表示蛋白mark；1是未加入誘導(dǎo)劑時(shí)菌體破碎上清；2是加入5mm乳糖時(shí)菌體破碎液上清；3-4是100mm咪唑洗脫液；5是200mm咪唑洗脫液)。圖3是tɑ1-fc融合蛋白對(duì)小鼠乳腺癌4t1模型的抗腫瘤活性(圖3-1是小鼠乳腺癌4t1模型中不同組的腫瘤重量，圖3-2是不同時(shí)間腫瘤體積的變化)。圖4是tɑ1-fc融合蛋白對(duì)人乳腺癌mcf-7模型的抗腫瘤活性(圖4-1是人乳腺癌mcf-7模型中不同組的腫瘤重量，圖4-2是不同時(shí)間腫瘤體積的變化)。具體實(shí)施方式實(shí)施例一tɑ1-fc融合蛋白重組載體的表達(dá)與鑒定1.重組基因的誘導(dǎo)表達(dá)將融合蛋白氨基酸序列如seqidno:1所示的序列轉(zhuǎn)換成所對(duì)應(yīng)的核苷酸序列其互補(bǔ)序列進(jìn)行基因合成，合成的序列兩端設(shè)計(jì)了ncoi和hindiii酶切位點(diǎn)，將合成的基因與原核表達(dá)載體pet-32a進(jìn)行連接，再將正確連接的pet-32a-tɑ1-fc質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(de3)，并將其涂布在含有氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基平板中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)；從lb固體平板中挑取單菌落接種于含有氨芐青霉素的lb液體培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)；將250μl的過(guò)夜培養(yǎng)物接種于25ml含氨芐青霉素的lb液體培養(yǎng)基中，搖床37℃200rpm培養(yǎng)3個(gè)小時(shí)，至菌達(dá)到其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入5mm乳糖誘導(dǎo)4個(gè)小時(shí)，離心沉淀細(xì)菌，棄上清，沉淀保存于-20℃；重懸沉淀，然后加入10倍菌體濕重的菌懸液重懸菌體，將菌體重懸液與上樣緩沖液按同體積混合，80-100℃高溫變性5分鐘，離心，取上清10-15μl加入到sds-page上電泳鑒定蛋白的表達(dá)情況。由圖1-1可以看出，誘導(dǎo)后，在破碎液上清中表達(dá)出本發(fā)明所述tɑ1-fc融合蛋白。2.大量積累tɑ1-fc融合蛋白將凍存的含有pet-32a-tɑ1-fc質(zhì)粒的大腸桿菌bl21(de3)接種于25mllb液體培養(yǎng)基中，搖床37℃200rpm過(guò)夜；次日，將培養(yǎng)液按1:100接種于新lb液體培養(yǎng)基中；離心沉淀，棄上清，將沉淀保存于-20℃；加入5mm乳糖誘導(dǎo)4個(gè)小時(shí)；離心沉淀，棄上清，將沉淀保存于-20℃。3.聚丙烯酰氨凝膠電泳(sds—page)安裝電泳玻璃板裝置；配置5％濃縮膠和15％分離膠；將細(xì)菌用菌懸液重懸后，2×上樣緩沖液與菌體重懸液1:1混合，100℃高溫變性5分鐘；安裝電泳槽；離心取上清10-15μl加入15％sds—page；設(shè)恒壓80v，30min120v1.5h；剝下凝膠，考馬斯亮藍(lán)r-250振搖染色1h；在40％乙醇，10％乙酸，水溶液中脫色2h。4.westernblot先sds-page電泳。然后轉(zhuǎn)膜：電泳結(jié)束前，剪膜，甲醇泡5min后，轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)印緩沖液中平衡15min；結(jié)束電泳，切膠；先把膠放在雙蒸水中蕩一下，轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)印緩沖液中平衡10min，與此同時(shí)泡上8片濾紙；敷膜；轉(zhuǎn)膜80-100ma1-2h。封閉：轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將膜取下，用洗滌液洗5min×2；吸干膜表面的洗滌液，用5％脫脂奶粉封閉2h；封閉結(jié)束后，用洗滌液洗5min×2。一抗孵育過(guò)夜：吸干膜表面的洗滌液，分別夾入封口膜中，鼠抗人tɑ1和鼠抗人fc一抗封閉過(guò)夜。洗滌一抗：用洗滌液洗10三分鐘，洗滌三次。孵育二抗：吸干膜表面的洗滌液，分別夾入封口膜中用山羊抗鼠、兔抗鼠fc二抗室溫孵育2h。洗滌二抗：用洗滌液洗10三分鐘，洗滌三次。曝光：將膜表面的洗滌液輕輕拭干；按照1:1(顯色a液：b液)的比例配制發(fā)光液，緩緩加入到膜上，凝膠成像儀曝光。由圖1-2所示，圖1-2b是融合蛋白sds-page圖片，圖1-2a是檢測(cè)融合蛋白tɑ1部分，如圖所示，凝膠成像儀曝光后，在pvdf膜上顯示的條帶，其大小和形狀均與sds-page圖片上目的蛋白一致，說(shuō)明該蛋白中含有tɑ1片段；圖1-2c是檢測(cè)融合蛋白igg1fc片段，如圖所示，凝膠成像儀曝光后，在pvdf膜上顯示的條帶，其大小和形狀均與sds-page圖片上目的蛋白一致，說(shuō)明該蛋白中含有igg1fc片段。綜上所述，該融合蛋白在結(jié)構(gòu)上包含有tɑ1片段和igg1fc片段，是本發(fā)明設(shè)計(jì)的目的蛋白。實(shí)施例二tɑ1-fc融合蛋白的純化1.大腸桿菌超聲破碎每克濕菌體加入10-30ml0.1mtris緩沖液重懸菌體，制成細(xì)菌懸液。冰浴中超聲破碎細(xì)菌，超聲功率設(shè)定60％w，超聲3s，間隔3s，總時(shí)間15min。溶液變?yōu)槌吻迩也徽吵恚?℃8000r/min離心10min，保留上清，sds-page電泳鑒定。由圖1-1可以看出，誘導(dǎo)后，在破碎液上清中表達(dá)出本發(fā)明所述tɑ1-fc融合蛋白。2.tɑ1-fc融合蛋白分離純化將鎳柱內(nèi)的膠液吹打均勻，使瓊脂糖凝膠重懸；待膠床恒定后加5倍柱體積去離子水洗去20％乙醇；加10倍柱體積bindingbuffer(含30mm咪唑)平衡柱子，控制流速2s/d；加入菌體超聲破碎上清，流速20s/d，流出液分管保存；依次用咪唑濃度依次升高的washingbuffer(含0mm咪唑、30mm咪唑、80mm、100mm、200mm咪唑)洗滌柱子，每個(gè)梯度用量10ml，洗出液分別分管保存。流速控制10s/d；用雙蒸水沖洗柱子，加入20％乙醇放4℃保存；收集的蛋白質(zhì)進(jìn)行sds-page電泳分析。如圖2所示：泳道1是未加入誘導(dǎo)劑時(shí)破碎液的上清，泳道2是加入誘導(dǎo)劑后的菌體破碎液的上清，3、4是100mm咪唑洗脫液，5是200mm咪唑洗脫液，由圖可以看出100mm和200mm咪唑含有本發(fā)明所述tɑ1-fc融合蛋白，且目的蛋白純度高。3.tɑ1-fc融合蛋白的脫鹽及凍干蛋白的脫鹽及凍干使用葡聚糖凝膠sephadexg-25柱層析，步驟如下：柱平衡。去掉頂蓋打開(kāi)下端封口，倒出柱貯存液，加入10ml的nh4hco3沖洗柱子，控制流速5s/d；上樣。樣品上樣體積0.5ml，樣品進(jìn)入柱內(nèi)接入緩沖液洗脫，根據(jù)洗脫圖譜收集含有目的蛋白的流出液；洗柱。用約8mlnh4hco3緩沖液沖洗柱子。將收集的樣品－20℃預(yù)凍，在凍干機(jī)中凍干，得到白色絮狀蛋白粉末。實(shí)施例三tɑ1-fc融合蛋白抗腫瘤及免疫活性的測(cè)定1.1構(gòu)建小鼠乳腺癌腫瘤模型利用小鼠活體腫瘤模型，檢測(cè)融合蛋白的抗腫瘤效果。購(gòu)買實(shí)驗(yàn)用小鼠balb/c，在其前肢左側(cè)皮下注射小鼠乳腺癌細(xì)胞4t1，至成瘤80mm3-100mm3時(shí)，在前肢右側(cè)皮下注射tɑ1-fc融合蛋白，陽(yáng)性對(duì)照為注射紫杉醇(docetaxel)，陰性對(duì)照注射pbs。每天注射一次，給藥21天，每隔一天測(cè)量腫瘤大小，觀察腫瘤變化趨勢(shì)。培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞：將4t1細(xì)胞復(fù)蘇，分別以含有10％胎牛血清的rpmi1640培養(yǎng)基孵育，37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，換液，至細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，進(jìn)行傳代，獲得足夠的細(xì)胞數(shù)量；收集小鼠乳腺癌4t1細(xì)胞，胰酶消化，1000rpm離心5分鐘，pbs清洗三次，用生理鹽水(0.9％nacl)重懸細(xì)胞，在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，稀釋成1×107個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。在每只balb/c小鼠前肢左側(cè)皮下注射0.1ml細(xì)胞懸液，十天左右，接瘤處出現(xiàn)80mm3-100mm3腫瘤塊；小鼠按照瘤塊體積大小分組，分別為給藥組、對(duì)照組。每天在小鼠前肢右側(cè)皮下給藥0.1ml，并且每隔一天統(tǒng)計(jì)利用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)與寬，稱量小鼠體重，持續(xù)21天。處死小鼠，取血、脾和胸腺，解剖腫瘤，稱量瘤重，4％多聚甲醛固定保存腫瘤組織進(jìn)行分析；統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)：利用excel處理上述數(shù)據(jù)，分別對(duì)腫瘤大小變化、小鼠體重變化及瘤重大小進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，腫瘤體積公式：體積＝0.5×長(zhǎng)×寬2。在本次小鼠乳腺癌模型實(shí)驗(yàn)中，采用小鼠乳腺癌4t1細(xì)胞進(jìn)行建模，細(xì)胞密度為1×107個(gè)/ml。皮下注射腫瘤細(xì)胞十天左右，小鼠前肢左側(cè)的接瘤處出現(xiàn)80mm3-100mm3腫瘤塊，小鼠按照瘤塊體積大小分組，分別為給藥組、對(duì)照組。給藥組為(tɑ1和tɑ1-fc)組，對(duì)照組為陽(yáng)性對(duì)照組(紫杉醇組)和陰性對(duì)照組(pbs組)。分組后給藥組和陰性對(duì)照組每天給藥一次，tɑ1的給藥劑量為0.082umol/kg，tɑ1-fc的給藥劑量為0.082umol/kg；陽(yáng)性藥為紫杉醇，每二天給藥一次，給藥劑量為10mg/kg。給藥11天后，與陰性對(duì)照組相比陽(yáng)性對(duì)照組表現(xiàn)出明顯的腫瘤抑制作用，但同時(shí)表現(xiàn)出一些副作用，如小鼠體重開(kāi)始降低，精神萎靡等。同時(shí)其他給藥組均表現(xiàn)出一定的抑制作用。如圖3-1所示，給藥21天以后，tɑ1給藥組小鼠乳腺癌平均腫瘤體積為0.996±0.224cm3，與陰性對(duì)照pbs組小鼠無(wú)顯著性差異；tɑ1-fc給藥組小鼠乳腺癌平均腫瘤體積為0.758±0.105cm3，與陰性對(duì)照pbs組小鼠有顯著性差異(p<0.05)，由此可以初步推斷tɑ1-fc具有腫瘤抑制作用且其抗腫瘤效果強(qiáng)于tɑ1。將小鼠處死取出腫瘤組織后稱重如圖3-2所示，tɑ1給藥組小鼠乳腺癌平均腫瘤重量為1.5998±0.5035g，tɑ1-fc組腫瘤重量均值為1.3445±0.2691g，陽(yáng)性對(duì)照組腫瘤均值為1.2131±0.4996g，陰性對(duì)照組(pbs)腫瘤均值重量為1.8475±0.6462g。其中與陰性對(duì)照組(pbs)相比，tɑ1組無(wú)顯著性差異；tɑ1-fc(p<0.05)和陽(yáng)性對(duì)照組(p<0.01)均有顯著性差異。由此可見(jiàn)，tɑ1-fc比tɑ1有著更好腫瘤抑制作用。1.2elisa檢測(cè)細(xì)胞因子ifn-γ和il-2的變化。用荷瘤4t1的balb/c小鼠，分對(duì)照組、給藥組，給藥持續(xù)21天，處死小鼠，取血，室溫靜置30min，4000rpm離心5分鐘，收集上清血清，保存于-70℃冰箱；配制標(biāo)準(zhǔn)品，分別按梯度稀釋1000pg/ml，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.2pg/ml和空白孔，每孔加入50μl待測(cè)樣品血清。空白孔加相同體積pbs；封板膜封板，置恒溫培養(yǎng)箱37℃孵育30min。棄去液體甩干，每孔加洗滌液300μl，靜置30s，甩干，重復(fù)5次；除空白孔外，其他每孔加入50μlhrp標(biāo)記的抗體，封板膜封板，置恒溫培養(yǎng)箱37℃孵育30min，棄去液體甩干，每孔加洗滌液300μl，靜置30s，甩干，重復(fù)5次；每孔加入顯色液(a和b)100μl，置恒溫培養(yǎng)箱37℃避光孵育10min；每孔加終止液50μl，此時(shí)藍(lán)色立馬轉(zhuǎn)為黃色。以空白孔調(diào)零，450nm波長(zhǎng)下測(cè)od值，由一系列梯度的標(biāo)準(zhǔn)品od值計(jì)算出il-2和ifn-γ的標(biāo)準(zhǔn)曲線，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣品的il-2和ifn-γ的濃度，如表1-1所示，與陰性對(duì)照組pbs相比，融合蛋白tɑ1-fc的ifn-γ和il-2含量顯著提高，結(jié)果顯示tɑ1-fc比tɑ1具有更好的免疫調(diào)節(jié)效果。表1-1.tɑ1-fc對(duì)小鼠乳腺癌4t1模型中ifn-γ和il-2的影響組別ifn-γ(ng/l)il-2(ng/l)pbs44.395±22.878.88±13.04tɑ1119.153±13.91*102.88±17.14tɑ1-fc151.181±5.64**293.03±99.95*紫杉醇78.091±3.08256.06±93.84**p<0.05；**p<0.012.構(gòu)建裸鼠乳腺癌腫瘤模型利用裸鼠活體腫瘤模型，檢測(cè)融合蛋白對(duì)人乳腺癌的治療效果。購(gòu)買實(shí)驗(yàn)用裸鼠balb/c，在其前肢左側(cè)皮下注射人乳腺癌細(xì)胞mcf-7，至成瘤80mm3-100mm3時(shí)，在前肢右側(cè)皮下注射tɑ1-fc融合蛋白或tɑ1，劑量為0.082umol/kg，每日一次，陽(yáng)性對(duì)照為注射紫杉醇(docetaxel)，劑量為10mg/kg，每二日一次；陰性對(duì)照注射pbs，每天注射一次，給藥21天，每隔一天測(cè)量腫瘤大小，觀察腫瘤變化趨勢(shì)。腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)，獲得足夠量的mcf-7細(xì)胞。操作步驟同上；胰酶消化收集人乳腺癌mcf-7細(xì)胞，1000rpm離心5分鐘，pbs清洗三次，用生理鹽水(0.9％nacl)重懸細(xì)胞，在顯微鏡下用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，稀釋成5×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。在每只balb/c小鼠前肢左側(cè)皮下注射0.1ml細(xì)胞懸液，十天左右，接瘤處出現(xiàn)80mm3-100mm3腫瘤塊；測(cè)量小鼠腫瘤大小，同上；小鼠頸椎脫臼，剖出腫瘤稱量，4％多聚甲醛固定保存腫瘤組織；統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)：腫瘤體積公式：體積＝0.5×長(zhǎng)×寬2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4-1所示，給藥12天后，與陰性對(duì)照組相比，給藥組tɑ1和tɑ1-fc均表現(xiàn)出一定的腫瘤抑制作用，而陽(yáng)性對(duì)照組(紫杉醇組)具有較好的腫瘤抑制作用，但其小鼠體重開(kāi)始減輕，27后，小鼠平均體重降至14.2g。因人乳腺癌腫瘤生長(zhǎng)緩慢，給藥周期為27天，27天后，陰性對(duì)照組腫瘤體積為0.716±0.258cm3，tɑ1組腫瘤體積為0.468±0.164cm3，與陰性對(duì)照組相比，腫瘤抑制率為34.6％；tɑ1-fc組腫瘤體積為0.373±0.129cm3，與陰性對(duì)照組相比，腫瘤抑制率為47.9％，與陰性對(duì)照組有顯著性差異(p<0.05)，可以顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)；陽(yáng)性對(duì)照組腫瘤體積為0.269±0.048cm3，與陰性對(duì)照組相比，腫瘤抑制率為62.4％，與陰性對(duì)照組有顯著性差異(p<0.01)。將小鼠處死取出腫瘤組織后稱重，如圖4-2所示，tɑ1給藥組平均腫瘤重量為0.454±0.174g，腫瘤抑制率為40.1％，與陰性對(duì)照組有顯著性差異(p<0.05)；tɑ1-fc組腫瘤重量均值為0.375±0.1241g，腫瘤抑制率為50.5％，與陰性對(duì)照組有強(qiáng)顯著性差異(p<0.01)；陽(yáng)性對(duì)照組腫瘤均值為0.215±0.032g，腫瘤抑制率為71.6％，與陰性對(duì)照組有顯著性差異(p<0.01)；陰性對(duì)照組(pbs)腫瘤均值重量為0.757±0.324g。結(jié)果充分表明tɑ1-fc抑制乳腺癌生長(zhǎng)的效果遠(yuǎn)優(yōu)于tɑ1。3.構(gòu)建小鼠免疫缺陷模型購(gòu)買8周齡icr雄性小鼠，按照40mg/kg的氫化可的松(hc)藥物劑量皮下注射，持續(xù)8天，每天稱量小鼠體重、觀察小鼠精神狀態(tài)。當(dāng)小鼠出現(xiàn)萎靡不振，體重下降、毛發(fā)直立無(wú)光澤等癥狀，說(shuō)明免疫損傷模型成功；將小鼠分為給藥組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組(未造模組)；持續(xù)給藥7天，小鼠眼球取血，檢測(cè)血清中相關(guān)細(xì)胞因子含量。取脾與胸腺，稱重計(jì)算臟器指數(shù)。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均明顯降低，說(shuō)明免疫抑制模型建立成功。與陰性對(duì)照組相比，給藥組(tɑ1和tɑ1-fc組)的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均升高，如表1-2所示。說(shuō)明藥物tɑ1和tɑ1-fc能升高免疫低下小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，且tɑ1-fc作用效果比tɑ1好。表1-2tɑ1-fc對(duì)免疫抑制小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響3.1elisa檢測(cè)細(xì)胞因子ifn-γ和il-2的變化。將眼眶采集的血液標(biāo)本，室溫靜置30min，4000rpm離心5分鐘，收集上層血清，保存于-70℃冰箱；配制標(biāo)準(zhǔn)品，分別按梯度稀釋1000pg/ml，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.2pg/ml和空白孔，每孔加入50μl待測(cè)樣品血清?？瞻卓准酉嗤w積pbs；封板膜封板，置恒溫培養(yǎng)箱37℃孵育30min。棄去液體甩干，每孔加洗滌液300μl，靜置30s，甩干，重復(fù)5次；除空白孔外，其他每孔加入50μlhrp標(biāo)記的抗體，封板膜封板，置恒溫培養(yǎng)箱37℃孵育30min，棄去液體甩干，每孔加洗滌液300μl，靜置30s，甩干，重復(fù)5次；每孔按順序加入顯色液a、b各50μl，置恒溫培養(yǎng)箱37℃避光反應(yīng)10min；每孔加終止液50μl，此時(shí)藍(lán)色立馬轉(zhuǎn)為黃色。以空白孔調(diào)零，450nm波長(zhǎng)下測(cè)od值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1-3所示，與陰性對(duì)照組pbs相比tɑ1和tɑ1-fc組均能促進(jìn)il-2和ifn-γ表達(dá)，并且tɑ1-fc能使外周血中il-2和ifn-γ含量分別升高38％、44％，較tɑ1效果好。結(jié)果充分表明tɑ1-fc的免疫增強(qiáng)效果優(yōu)于tɑ1。表1-3.tɑ1-fc對(duì)免疫抑制小鼠血清中ifn-γ和il-2的影響組別ifn-γ(ng/l)il-2(ng/l)pbs16.88±0.4319.98±1.76control19.41±0.2621.64±0.59tɑ121.26±0.7726.25±2.32tɑ1-fc24.27±0.6627.61±2.34<110>中國(guó)藥科大學(xué)<120>一種抗腫瘤和免疫增強(qiáng)雙重功效融合蛋白<130>2016<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>420<212>prt<213>人工序列<400>1metserasplysileilehisleuthraspaspserpheaspthraspvalleulysalaaspglyalaileleuvalaspphetrpalaglutrpcysglyprocyslysmetilealaproileleuaspgluilealaaspglutyrglnglylysleuthrvalalalysleuasnileaspglnasnproglythralaprolystyrglyileargglyileprothrleuleuleuphelysasnglygluvalalaalathrlysvalglyalaleuserlysglyglnleulysglupheleuaspalaasnleualaglyserglyserglyhismethishishishishishisserserglyleuvalproargglyserglymetlysgluthralaalaalalysphegluargglnhismetaspserproaspleuglythraspaspaspasplysmetalaseraspalaalavalaspthrsersergluilethrthrlysaspleulysglulyslysgluvalvalgluglualagluasngluprolyssercysasplysthrhisthrcysproprocysproalaprogluleuleuglyglyproservalpheleupheproprolysprolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproileglulysthrileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleuproproserargaspgluleuthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserproglylys當(dāng)前第1頁(yè)12