本發(fā)明屬于干細胞領(lǐng)域，涉及干細胞的定向誘導分化，具體涉及誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向肝細胞分化的人工多肽及其生物制品。
背景技術(shù)：
：肝細胞移植是治療終末期肝功能衰竭的最有效的方法之一，卻受到細胞來源缺乏、體外難以大量增殖、傳代后不能保持其原有特性、免疫排斥等因素的限制而影響其臨床應用。隨著組織工程的研究進展，干細胞治療終末期肝病已經(jīng)成為最具前景的發(fā)展方向。骨髓間充質(zhì)干細胞是由feriedenstein等于20世紀70年代初首先報道發(fā)現(xiàn)的一類非造血干細胞。因該類細胞呈紡錘形，集落方式類似成纖維細胞，故在研究之初被稱為成纖維細近年來，誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向肝細胞的分化備受關(guān)注。胞集落形成單位或骨髓基質(zhì)成纖維細胞。后來，caplan于1991年把這類來源于骨髓，具有高度的自我更新和分化潛能，并且最終可分化為間充質(zhì)細胞的細胞群，統(tǒng)一命名為骨髓間充質(zhì)干細胞。在不同條件下，該類細胞不僅可被誘導成為骨細胞、肌腱細胞、骨髓基質(zhì)細胞、脂肪細胞等間充質(zhì)細胞，還有可能分化成為心肌細胞、神經(jīng)細胞等實質(zhì)性細胞。研究發(fā)現(xiàn)bmscs體外培養(yǎng)或是體內(nèi)移植均具有分化為神經(jīng)細胞的潛能。lee等成功在體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞中發(fā)現(xiàn)分化的不同亞型神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞。satake等在sci大鼠的腰椎處注射入帶有綠色熒光標記的bmscs，培養(yǎng)數(shù)日后，發(fā)現(xiàn)大鼠的運動和神經(jīng)功能得到一定程度的改善，鏡下觀察到部分移植細胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)樣細胞。zurita等的實驗研究發(fā)現(xiàn)bmscs注射到sci大鼠12個月后，有大量的神經(jīng)組織再生，包括神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞等。如何誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向肝細胞分化也已成為研究熱點。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向肝細胞分化的人工多肽及其生物制品。實現(xiàn)本發(fā)明上述目的技術(shù)方案如下：一種包含式(ⅳ)氨基酸序列的多肽：lgenqpdak(xa)pcfqedpma(xb)gtdctlmeiwn；(ⅳ)其中，xa和xb選自m,y,l,v,w或e。優(yōu)選地，xa和xb選自m或w。優(yōu)選地，所述多肽的氨基酸序列如下：lgenqpdakmpcfqedpmamgtdctlmeiwn(seqidno.1)；lgenqpdakwpcfqedpmawgtdctlmeiwn(seqidno.2)；lgenqpdakmpcfqedpmawgtdctlmeiwn(seqidno.3)；lgenqpdakwpcfqedpmamgtdctlmeiwn(seqidno.4)。優(yōu)選地，多肽n和/或c末端被化學修飾。優(yōu)選地，所述多肽的n末端被乙?；揎?，c末端被酰胺化修飾。優(yōu)選地，所述多肽為游離形式或藥學上可以接受的成鹽形式，包括鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、磺酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽和酒石酸鹽。上述多肽在誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向肝細胞分化方面的應用。一種生物制品，含有上述的多肽和藥學上可以接受的輔料。上述生物制品在誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向肝細胞分化方面的應用。本發(fā)明的突出優(yōu)點：本領(lǐng)域人員知道，聯(lián)合應用酸性成纖維細胞生長因子、肝細胞生長因子和抑瘤素m具有很強的誘導骨髓間充質(zhì)干細胞分化為肝細胞的能力，從本實驗也可以看出，酸性成纖維細胞生長因子、肝細胞生長因子和抑瘤素m聯(lián)用組成的陽性對照組中，誘導培養(yǎng)14天后，細胞中甲胎蛋白mrna和白蛋白mrna均呈明顯的陽性表達，而甲胎蛋白和白蛋白為肝細胞的特異性標志物，證明骨髓間充質(zhì)干細胞在酸性成纖維細胞生長因子、肝細胞生長因子和抑瘤素m聯(lián)合作用下定向分化為肝細胞。本發(fā)明提供的多肽ⅳ-1～ⅳ-4具有相同的作用，證明本發(fā)明提供的多肽ⅳ-1～ⅳ-4具有誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向肝細胞分化的作用，可以制成誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向肝細胞分化的生物制品。附圖說明圖1為誘導14天各組細胞甲胎蛋白mrna和白蛋白mrna相對內(nèi)參表達量。具體實施方式下面就結(jié)合實施例具體介紹本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，由于篇幅原因，實驗過程的描述無法做到非常詳細，凡是實驗中未詳細描述的部分均為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)操作。一、實驗材料本發(fā)明涉及的多肽通過本領(lǐng)域公知的標準多肽固相合成技術(shù)合成，采用芴甲氧羰基(fmoc)n端保護策略。按照樹脂固相合成的方法依次連接相應氨基酸，期間依次脫去fmoc-保護基團，然后切肽，獲得粗品，粗品經(jīng)c18柱分離純化，即可制得式(ⅳ)所示的多肽。hplc和ms檢測確證了本發(fā)明多肽的結(jié)構(gòu)，且純度均≥98％。多肽ⅳ-1至多肽ⅳ-4的氨基酸序列如下(n末端→c末端)，末端未經(jīng)化學修飾：lgenqpdakmpcfqedpmamgtdctlmeiwn(多肽ⅳ-1，seqidno.1)；lgenqpdakwpcfqedpmawgtdctlmeiwn(多肽ⅳ-2，seqidno.2)；lgenqpdakmpcfqedpmawgtdctlmeiwn(多肽ⅳ-3，seqidno.3)；lgenqpdakwpcfqedpmamgtdctlmeiwn(多肽ⅳ-4，seqidno.4)。動物和試劑：3～4周齡清潔級雄性wistar大鼠，80～100g，購于南京大學模式動物中心；低糖dmem培養(yǎng)基(l-dmem)購于gibco；胎牛血清購于杭州四季青；紅細胞裂解液、dapi熒光染料購于碧云天；兔抗大鼠cd44、cd45、cd90、dab試劑盒購于南京建成生物。rna抽提試劑盒，購自上海華舜生物工程有限公司；cdna合成試劑盒，revertaidtmfirststrandcdnasynthesiskit，fermentas公司產(chǎn)品；實時熒光定量pcr試劑盒sybrpremixextaq，為takara公司產(chǎn)品；引物由上海生工合成。二、實驗方法1、骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)及純化頸椎脫臼法處死大鼠，無菌條件下取四肢骨，用磷酸鹽緩沖液反復沖洗骨髓腔，加入紅細胞裂解液獲得單個核細胞，加入含10％胎牛血清的l-dmem，調(diào)節(jié)細胞密度為2×109/l，接種于37℃、體積分數(shù)為5％的co2飽和濕度培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，3d后首次換液，以后每兩三天換液1次，待細胞生長至瓶底80％～90％融合時，用2.5g/l胰蛋白酶消化，按1:2～1:3傳代后繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中在倒置相差顯微鏡下動態(tài)觀察細胞生長情況。用免疫熒光染色的方法進行鑒定。2、骨髓間充質(zhì)干細胞向肝細胞誘導分化取第4代骨髓間充質(zhì)干細胞，用2.5g/l胰蛋白酶消化，以5×107/l接種于人纖維連接蛋白包被6孔板中(200ng/cm2)。分6組：第1組加入多肽ⅳ-1；第2組加入多肽ⅳ-2；第3組加入多肽ⅳ-3；第4組加入多肽ⅳ-4；第5組作為陰性對照，不加多肽ⅳ-1～多肽ⅳ-4；第6組為陽性對照，加入肝細胞生長因子、酸性成纖維細胞生長因子、抑瘤素m，三者終末濃度均為20μg/l。多肽組所加入的各多肽終末濃度均為10μm。3、肝細胞特異性標志物檢測(基因水平)誘導第14天取各組細胞，檢測白蛋白、甲胎蛋白的基因表達水平。采用實時熒光定量pcr檢測。rna抽提試劑盒提取細胞總rna，根據(jù)說明書方法逆轉(zhuǎn)錄合成cdna。采用25μl反應系統(tǒng)進行實時定量pcr反應，程序設(shè)定為：95℃，預變性60s，95℃15s，60℃60s，×40循環(huán)。目的基因與內(nèi)參照基因在相同反應條件下，同時擴增。將pcr所得的ctsybr值輸入excel，采用相對定量2-δδct法分析結(jié)果。引物如下：白蛋白上游引物：5’-aagaaacctgggaagagtgggc-3’；白蛋白下游引物：5’-tcgctcactggggtcttctca-3’；甲胎蛋白上游引物：5’-gggtgtttagaaaaccagctatctg-3’；甲胎蛋白下游引物：5’-gagtctggagcggtcttcttgc-3’；β-actin上游引物：5’-acgcaccccaactacaactc-3’；β-actin下游引物：5’-tctccttaatgtcacgcacga-3’。4、數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)分析采用spss20.0軟件進行，數(shù)據(jù)表示方法為均值±標準差，組間比較采用t檢驗，p<0.05認為有統(tǒng)計學差異。三、實驗結(jié)果1、形態(tài)學變化誘導前骨髓間充質(zhì)干細胞呈梭形或紡錘形，隨著誘導時間延長，陽性對照組和多肽ⅳ-1～ⅳ-4組均出現(xiàn)異形細胞，且數(shù)量有增多趨勢，誘導后細胞生長速度較誘導前變慢，細胞有聚集趨勢，1:2傳代后約1～2周鋪滿瓶底。陰性對照組始終未出現(xiàn)細胞形態(tài)及增殖速度的改變。2、細胞生長曲線的測定陽性對照組和多肽ⅳ-1～ⅳ-4誘導組骨髓間充質(zhì)干細胞傳代培養(yǎng)潛伏期約為24～48h，第3天進入對數(shù)增殖期，第5～6天進入平臺期。與陰性對照組比較，陽性對照組和多肽誘導組細胞生長增殖速度增快(p<0.05)。3、肝細胞特異性標志物檢測誘導0、14d，陰性對照組細胞中甲胎蛋白mrna和白蛋白mrna均呈陰性表達；陽性對照組和多肽ⅳ-1～ⅳ-4誘導組誘導培養(yǎng)14天后，細胞中甲胎蛋白mrna和白蛋白mrna呈顯著陽性表達。表1和圖1為誘導14天后各組細胞中甲胎蛋白mrna和白蛋白mrna相對內(nèi)參表達量。表1誘導14天各組細胞甲胎蛋白mrna和白蛋白mrna相對內(nèi)參表達量甲胎蛋白mrna/β-actinmrna白蛋白mrna/β-actinmrna多肽ⅳ-1誘導組1.241.35多肽ⅳ-2誘導組1.381.19多肽ⅳ-3誘導組1.211.23多肽ⅳ-4誘導組1.271.31陰性對照組00陽性對照組1.171.08本領(lǐng)域人員知道，聯(lián)合應用酸性成纖維細胞生長因子、肝細胞生長因子和抑瘤素m具有很強的誘導骨髓間充質(zhì)干細胞分化為肝細胞的能力，從本實驗也可以看出，酸性成纖維細胞生長因子、肝細胞生長因子和抑瘤素m聯(lián)用組成的陽性對照組中，誘導培養(yǎng)14天后，細胞中甲胎蛋白mrna和白蛋白mrna均呈明顯的陽性表達，而甲胎蛋白和白蛋白為肝細胞的特異性標志物，證明骨髓間充質(zhì)干細胞在酸性成纖維細胞生長因子、肝細胞生長因子和抑瘤素m聯(lián)合作用下定向分化為肝細胞。本發(fā)明提供的多肽ⅳ-1～ⅳ-4具有相同的作用，證明本發(fā)明提供的多肽ⅳ-1～ⅳ-4具有誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向肝細胞分化的作用，可以制成誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向肝細胞分化的生物制品。上述實施例是對本發(fā)明實質(zhì)性內(nèi)容的體現(xiàn)，用于更好地解釋本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應當知曉，不應將本發(fā)明的保護范圍局限于上述具體的實施例。sequencelisting<110>南京蓋斯夫醫(yī)藥科技有限公司<120>誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向肝細胞分化的人工多肽及其生物制品<130>1<160>4<170>patentinversion3.3<210>1<211>31<212>prt<213>人工序列<400>1leuglygluasnglnproaspalalysmetprocyspheglngluasp151015prometalametglythraspcysthrleumetgluiletrpasn202530<210>2<211>31<212>prt<213>人工序列<400>2leuglygluasnglnproaspalalystrpprocyspheglngluasp151015prometalatrpglythraspcysthrleumetgluiletrpasn202530<210>3<211>31<212>prt<213>人工序列<400>3leuglygluasnglnproaspalalysmetprocyspheglngluasp151015prometalatrpglythraspcysthrleumetgluiletrpasn202530<210>4<211>31<212>prt<213>人工序列<400>4leuglygluasnglnproaspalalystrpprocyspheglngluasp151015prometalametglythraspcysthrleumetgluiletrpasn202530當前第1頁12