本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是一種抗m6a單克隆抗體的制備方法。

背景技術(shù)：

人類dna和蛋白質(zhì)上存在著豐富的化學(xué)修飾，其動(dòng)態(tài)變化發(fā)揮著重要的作用，通過參與基因表達(dá)調(diào)控，決定細(xì)胞的狀態(tài)，影響細(xì)胞的分化和發(fā)育。最新的研究表明，rna中的化學(xué)修飾與dna和蛋白質(zhì)中的化學(xué)修飾相似，也在調(diào)控個(gè)體生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要的作用。其中，m6a是真核生物中最常見的rna轉(zhuǎn)錄后修飾形式，也是近年來表觀遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)。m6a是發(fā)生在堿基a第六位n原子上的甲基化修飾形式，其導(dǎo)致了超過80％的rna堿基甲基化。越來越多的研究證實(shí)，基于m6a修飾的rna甲基化調(diào)控通過調(diào)節(jié)mrna及mirna的剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝，參與機(jī)體發(fā)育、代謝及繁殖的整個(gè)過程，并與多種疾病密切相關(guān)。目前，人們對(duì)rna甲基化的動(dòng)態(tài)變化的檢測及在轉(zhuǎn)錄組中的分布研究主要依賴于基于m6a單克隆抗體的elisa和merip技術(shù)，因此，制備具有高特異性、高親和力的m6a單克隆抗體十分重要。

m6a的分子量小于1000da，屬于僅有反應(yīng)原性而無免疫原性的半抗原，難以通過常規(guī)的動(dòng)物免疫制備抗體。目前，制備小分子半抗原抗體的一般方法是：通過共價(jià)鍵使半抗原與大分子質(zhì)量蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)，制備人工免疫原，經(jīng)動(dòng)物免疫程序制備特異性抗體。其中，涉及半抗原的設(shè)計(jì)，連接臂的引入及活性基團(tuán)的選擇等多個(gè)技術(shù)環(huán)節(jié)，工藝復(fù)雜。

因此，提供一種簡單、易行的適用于m6a的抗體制備方法具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種抗rna表觀遺傳修飾m6a的單克隆抗體的制備方法，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中通過載體蛋白偶聯(lián)m6a來制備m6a抗體技術(shù)工藝復(fù)雜成本高的問題。

本發(fā)明的第一方面，提供一種抗m6a單克隆抗體的制備方法，包括：步驟一，活化載體納米磁珠；步驟二，以所述納米磁珠為載體，通過與核苷偶聯(lián)制備免疫原；步驟三，利用所述的免疫原制備m6a抗體；

其中，所述的核苷是m6a，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下式所示；

所述的載體納米磁珠：平均粒徑為300-1000nm；表面氨基基團(tuán)含量在～200μm；磁核為fe3o4。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的載體納米磁珠選自由蘇州海貍生物醫(yī)學(xué)工程有限公司生產(chǎn)的nhs磁珠。

所述的步驟一活化載體納米磁珠的步驟包括：磁珠預(yù)處理，充分混勻磁珠后，取100μl磁珠到1mlep管中，磁吸去除上清液，用200μlpbs溶液洗滌3次，磁吸去上清；戊二醛活化，加入新鮮配制的質(zhì)量體積比為15％的戊二醛溶液到ep管中，渦旋混勻，避光反應(yīng)1h；活化后洗滌，磁珠活化后，磁吸去上清，用pbs緩沖液洗滌3次。

所述的步驟二納米磁珠與核苷偶聯(lián)制備免疫原的步驟包括：向裝有磁珠的ep管中加入200μgm6a，輕柔混勻，避光反應(yīng)3h；將ep管置于磁分離架上磁性分離去除上清液，加入200-1000μlpbs溶液重懸磁珠，反應(yīng)1h；將ep管置于雌性分離架上磁性分離去除上清液，用pbs洗滌3次后，重新懸浮于保存溶液中。

所述的步驟三利用所述的免疫原制備m6a抗體的步驟包括：將上述納米磁珠與核苷偶聯(lián)物作為免疫原免疫小鼠；獲取免疫小鼠的脾細(xì)胞，與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合；經(jīng)過多輪篩選獲得分泌識(shí)別m6a單分子的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；通過在小鼠體內(nèi)接種上述雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)腹水抗體，將腹水進(jìn)行純化，得到所述的抗m6a單克隆抗體。

本發(fā)明的第二方面，提供一種m6a偶聯(lián)復(fù)合物，包括核苷及其偶聯(lián)的載體納米磁珠，其中核苷是m6a，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下式所示；所述的載體納米磁珠：平均粒徑為300-1000nm；表面氨基基團(tuán)含量在～200μm；磁核為fe3o4；

所述的m6a偶聯(lián)復(fù)合物的制備方法，包括以下步驟：

a)磁珠預(yù)處理，充分混勻磁珠后，取100μl磁珠到1mlep管中，磁吸去除上清液，用200μlpbs溶液洗滌3次，磁吸去上清；

b)戊二醛活化，加入新鮮配制的戊二醛溶液(15％)到ep管中，渦旋混勻，避光反應(yīng)1h；

c)活化后洗滌，磁珠活化后，磁吸去上清，用pbs緩沖液洗滌3次；

d)向裝有磁珠的ep管中加入200μgm6a，輕柔混勻，避光反應(yīng)3h；

e)將ep管置于磁分離架上磁性分離去除上清液，加入200-1000μlpbs溶液重懸磁珠，反應(yīng)1h；

f)將ep管置于雌性分離架上磁性分離去除上清液，用pbs洗滌3次后，重新懸浮于保存溶液中。

本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：

本發(fā)明提供一種制備抗rna表觀遺傳修飾m6a抗體簡易、高效、廉價(jià)的方法，通過納米磁珠偶聯(lián)的m6a來制備單克隆抗體，解決了小分子化合物免疫原性差的問題，制備了具有更加的親和力和特異性的m6a單克隆抗體。本發(fā)明方法制備的單克隆抗體可特異性識(shí)別吸附在硝酸纖維素膜上的變性狀態(tài)下的m6a分子，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、靈敏地監(jiān)測rna的甲基化水平的動(dòng)態(tài)變化及m6a在rna轉(zhuǎn)錄物的分布，可用于研究rna甲基化修飾對(duì)人類器官發(fā)育和腫瘤發(fā)生等生理及病理過程的調(diào)控作用，對(duì)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制及相關(guān)疾病的研究具有十分重大的意義。

附圖說明

圖1是點(diǎn)雜交檢測圖，是純化獲得的抗體與不同稀釋濃度m6a結(jié)合的點(diǎn)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式作詳細(xì)說明。

實(shí)施例1.m6a偶聯(lián)復(fù)合物的制備：

本發(fā)明將抗原m6a與納米磁珠偶聯(lián)，以偶聯(lián)物作為免疫原，增強(qiáng)小分子m6a的免疫原性。具體操作步驟如下：

a)磁珠預(yù)處理，充分混勻磁珠后，取100μl磁珠到1mlep管中，磁吸去除上清液，用200μlpbs溶液洗滌3次，磁吸去上清；

b)戊二醛活化，加入新鮮配制的戊二醛溶液(15％)到ep管中，渦旋混勻，避光反應(yīng)1h；

c)活化后洗滌，磁珠活化后，磁吸去上清，用pbs緩沖液洗滌3次；

d)向裝有磁珠的ep管中加入200μgm6a，輕柔混勻，避光反應(yīng)3h；

e)將ep管置于磁分離架上磁性分離去除上清液，加入200-1000μlpbs溶液重懸磁珠，反應(yīng)1h；

f)將ep管置于雌性分離架上磁性分離去除上清液，用pbs洗滌3次后，重新懸浮于保存溶液中。

實(shí)施例2.抗m6a的單克隆抗體的制備和純化

1.抗原混合液的制備

取25ul的m6a偶聯(lián)復(fù)合物，加入25ul的生理鹽水進(jìn)行，成為50ul的抗原稀釋液，與50ul的佐劑迅速混合，即100ul的抗原混合液(此為每只babl/c小鼠的免疫用量)。

2.免疫動(dòng)物

本發(fā)明所用免疫動(dòng)物為balb/c小鼠，免疫佐劑為kx0210041，購自北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司。

1)腿部肌肉注射免疫babl/c小鼠(100ul/只)。

2)每隔一個(gè)月進(jìn)行重復(fù)免疫，免疫三次。

3.單克隆抗體的制備和純化

將成功獲得的抗原混合免疫鼠齡為8～12周的雌性balb/c健康小鼠3只。采取小鼠快速免疫方式，將3只小鼠的脾臟混合進(jìn)行融合。

免疫反應(yīng)最好的小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞(sp2/0)進(jìn)行融合，融合后的細(xì)胞經(jīng)過適當(dāng)稀釋，分置于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，培養(yǎng)10-14天進(jìn)行elisa檢測，挑選od值高的孔中的細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋法亞克隆。

具體方法如下：

1)將有限稀釋的細(xì)胞培養(yǎng)至96孔板中，待克隆生長到全孔的1/6時(shí)，標(biāo)記單克隆及多克隆，對(duì)單克隆進(jìn)行elisa檢測。

2)elisa檢測后將od值最高的單克隆再有限稀釋接入96孔板中如上法所述再次亞克隆，此過程重復(fù)數(shù)次，直至陽性孔比率為100％，即認(rèn)為此為單克隆。即通常認(rèn)為的建株成功的細(xì)胞株。

3)將篩選得到的陽性單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，細(xì)胞數(shù)按1-2×10⁶/管進(jìn)行凍存。同時(shí)收集細(xì)胞安排腹水制備。

4)細(xì)胞株采用小鼠腹腔接種法制備腹水，10-14天收集腹水，elisa檢測腹水是否制備成功。

5)腹水完成后采用proteina柱純化腹水。

實(shí)施例3.抗m6a的單克隆抗體的點(diǎn)雜交檢測

分別將含有100μg、25μg、5μg的m6a核苷溶液點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜上，待溶液吸干，加封閉液于室溫封閉至少1h；pbst洗液洗膜5次，用所制備的單克隆抗體作為一抗，4℃孵育過夜。孵育結(jié)束后用pbst洗液洗膜5次，抗體稀釋液稀釋hrp標(biāo)記的抗小鼠二抗，孵育1h，pbst洗液洗膜5次。用增強(qiáng)型hrp-dab底物顯色試劑盒進(jìn)行顯色，結(jié)果如圖1所示。

以上已對(duì)本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實(shí)施例進(jìn)行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述實(shí)施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可做出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。