本發(fā)明涉及干細胞培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種細胞培養(yǎng)液和誘導(dǎo)骨骼肌干細胞向軟骨細胞分化的方法。

背景技術(shù)：

骨關(guān)節(jié)炎是骨科臨床的常見疾病，由于退行性病變、創(chuàng)傷等造成的關(guān)節(jié)軟骨缺損，已成為導(dǎo)致殘廢、影響生活質(zhì)量的重要原因。關(guān)節(jié)軟骨是一種無血管組織，軟骨細胞主要靠關(guān)節(jié)滑液及細胞周圍的基質(zhì)供給營養(yǎng)以無氧酵解供能，其自身的修復(fù)能力很有限。關(guān)節(jié)軟骨一旦損傷，就會引起關(guān)節(jié)疼痛、不穩(wěn)和僵硬，會加速關(guān)節(jié)的骨化，細胞外基質(zhì)降解的速度大于新基質(zhì)的合成，則遺留永久性病變，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。傳統(tǒng)的治療方法如軟骨下骨鉆孔術(shù)、軟骨移植、骨膜或軟骨膜移植、軟骨細胞移植等因修復(fù)組織以纖維軟骨為主，缺少正常透明軟骨的力學(xué)性能及耐用性，故不能取得滿意效果。因此，如何微創(chuàng)修復(fù)損傷的軟骨，緩解病人的痛苦、提高生活質(zhì)量長期以來就是骨科醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的重點方向之一。

采用軟骨細胞修復(fù)損傷的軟骨組織是近年來用于替代上述傳統(tǒng)治療方法的新手段，然而軟骨細胞的來源是本領(lǐng)域技術(shù)人員的研究重點。骨骼肌肌源性干細胞(muscle-derivedstemcells,mdscs)是成年動物或人肌肉組織中特有的干細作為中胚層起源的一種成體間充質(zhì)干細胞，具有自我更新能力和多項分化的潛能，可在體外分化為軟骨細胞、血細胞、內(nèi)皮細胞和神經(jīng)細胞，這種功能特性極大地吸引了來自基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的研究者，給基礎(chǔ)科學(xué)的研究者們提供了一種研究發(fā)展生物學(xué)的模式，骨骼肌干細胞所具有的修復(fù)、替代和再生能力也為臨床醫(yī)學(xué)提供了一個發(fā)展新療法的機會。因此，提供一種誘導(dǎo)mdscs成軟骨分化的方法，是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的技術(shù)問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種細胞培養(yǎng)液和誘導(dǎo)骨骼肌干細胞向軟骨細胞分化的方法，所述細胞培養(yǎng)液能夠有效促進骨骼肌干細胞向軟骨細胞分化，其分化周期短，分化效率高。

本發(fā)明提供了一種細胞培養(yǎng)液，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、轉(zhuǎn)化生長因子-β3、胰島素樣生長因子、地塞米松、l-抗壞血酸和its⁺premix。

優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)化生長因子-β3的濃度為5～15μg/l；所述胰島素樣生長因子的濃度為50～100μg/l。

優(yōu)選地，所述地塞米松的濃度為0.5×10^-7～1×10^-7mol/l；所述l-抗壞血酸的濃度為50～100μmol/l。

優(yōu)選地，所述its⁺premix的體積分數(shù)為1％。

優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)化生長因子-β3的濃度為10μg/l；

所述胰島素樣生長因子的濃度為100μg/l；

所述地塞米松的濃度為1μm；

所述l-抗壞血酸的濃度為100μm；

所述its⁺premix的體積分數(shù)為1％。

優(yōu)選地，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為高糖dmem培養(yǎng)液。

本發(fā)明還提供了一種誘導(dǎo)骨骼肌干細胞向軟骨細胞分化的方法，采用上述任意一項所述的細胞培養(yǎng)液作為誘導(dǎo)液誘導(dǎo)骨骼肌干細胞向軟骨細胞分化。

優(yōu)選地，所述骨骼肌干細胞為第三代至第五代的骨骼肌干細胞。

綜上所述，本發(fā)明提供了一種細胞培養(yǎng)液和誘導(dǎo)骨骼肌干細胞向軟骨細胞分化的方法。本發(fā)明提供的培養(yǎng)液中包含轉(zhuǎn)化生長因子-β3、胰島素樣生長因子、地塞米松、l-抗壞血酸和its⁺premix，各組分配伍合理，協(xié)同促進了誘導(dǎo)骨骼肌干細胞向軟骨細胞分化，提高了骨骼肌干細胞向軟骨細胞分化的數(shù)量并縮短了分化的時間。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)提供的附圖獲得其他的附圖。

圖1為第二代骨骼肌干細胞形態(tài)圖，其中圖1a為放大40倍的第二代骨骼肌干細胞形態(tài)圖，圖1b為放大100倍的第二代骨骼肌干細胞形態(tài)圖；

圖2為實施例2中番紅o-快綠染色的實驗結(jié)果；

圖3為實施例2中ii型膠原免疫組化的實驗結(jié)果；

圖4為對比例1中番紅o-快綠染色的實驗結(jié)果；

圖5為對比例1中ii型膠原免疫組化的實驗結(jié)果。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明說明書附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例只是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，對本發(fā)明的具體實施例進行修改或者對部分技術(shù)特征進行同等替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明保護的范圍中。

本發(fā)明采用的材料和儀器皆為普通市售品，皆可于市場購得。其中，its⁺premix包含：insulin(5μg/ml)、transferrin(5μg/ml)和seleniousacid(5ng/ml)，其品牌為life，貨號為354350。

下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明：

實施例1

1、取材

取成人正常顳肌標本(取自于開顱手術(shù)患者)，用含雙抗的pbs緩沖液沖洗后轉(zhuǎn)入無菌培養(yǎng)皿中，用眼科剪剪成1mm³左右大小的碎塊，然后移入50ml離心管中，pbs緩沖液吹打沖洗3次，靜置1分鐘后棄上層液及漂浮組織。

2、酶解

向上述獲得的肌肉碎塊加入2倍體積的混合酶，包括2.4mg/mldispaseii、1％i型膠原酶和2.5mmcacl2，混勻后置37℃恒溫搖床中消化60min左右，直到試管中的肌肉碎塊消化為肌糜、肉眼看不到肌塊為止。消化結(jié)束后，1000r/min離心5min，棄上清。加入2～3倍體積的0.25％胰蛋白酶-edta，混勻后置37℃恒溫搖床中消化15min，消化結(jié)束后，1000r/min離心5min，棄上清。加入適量pbs重懸，1000r/min離心5min，棄上清。加入約3倍肌糜體積的pbs反復(fù)吹打后經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾，收集的濾液再1000r/min離心5min，棄上清。再采用生長培養(yǎng)基(含20％fbs的dmem/f12)重懸細胞。

3、分離與純化

采用差速貼壁分離技術(shù)對mdscs進行分離純化，將細胞懸液接種于25ml培養(yǎng)瓶中，放置于37℃、體積分數(shù)為5％的co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2h后的貼壁細胞記為pp1，其中未貼壁細胞吸出后移入新的培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)，并記為pp2。24h后將pp2中未貼壁的細胞吸出后移入新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，標記為pp3。以后每24h進行差速貼壁培養(yǎng)，直到獲得pp6，期間根據(jù)細胞的生長情況進行換液。pp6培養(yǎng)3天后換液，之后每隔3天換液一次，倒置顯微鏡下觀察記錄細胞生長以及形成集落后每日擴增情況，待細胞生長融合至70～80％后傳代培養(yǎng)。

4、mdscs的傳代培養(yǎng)

待細胞融合度為80～90％時，用吸管吸棄舊培養(yǎng)液，加入適量0.25％胰蛋白酶-edta，消化1～3min，鏡下觀察細胞收縮變圓時，立即加入適量含20％fbs的dmem/f12培養(yǎng)液終止消化，1000r/min離心5min，棄上清，收集細胞。加入適量含20％fbs的dmem/f12培養(yǎng)液重懸，進行細胞記數(shù)，按8×10⁴cell/ml密度接種于培養(yǎng)皿中進行傳代培養(yǎng)，5％co2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，每隔3天換液一次。

5、mdscs的鑒定

(1)細胞爬片制作：將無菌蓋玻片放置于6孔培養(yǎng)板中，對數(shù)生長期細胞制備成細胞懸液，按5×10⁴cell/ml密度接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔2ml，生長培養(yǎng)基為含20％fbs的dmem/f12，培養(yǎng)24～48小時，使細胞生長于蓋玻片上。

(2)desmin、sca-1免疫細胞化學(xué)染色：將放有蓋玻片6孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)液吸出，pbs緩沖液漂洗細胞鋪片5分鐘，重復(fù)3次。用4％多聚甲醛固定15分鐘，pbs緩沖液漂洗后甩干，中性樹膠粘附于載玻片上，4℃冰箱過夜。滴加3％過氧化氫孵育15分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，pbs緩沖液漂洗5分鐘，重復(fù)3次。分別滴加一抗兔抗人結(jié)蛋白(desmin)抗體(1:200稀釋)、兔抗人sca-1抗體(1:100稀釋)，37℃濕盒內(nèi)孵育1小時，4℃過夜。次日取出后pbs緩沖液漂洗5分鐘，滴加二抗，37℃濕盒內(nèi)孵育40分鐘，pbs緩沖液漂洗5分鐘，重復(fù)3次，滴加新鮮配制的dab溶液顯色5-10分鐘，在光鏡下觀察，用自來水進行沖洗終止顯色。將片子甩干后，蘇木素復(fù)染1分鐘，分化返藍，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察，胞膜和/或胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，說明成功分離獲得mdscs，其結(jié)果如圖1所示。

實施例2mdscs的分化

取第3代mdscs，按5×10⁵cell/管接種于15ml離心管內(nèi)，1000rpm離心5min，使細胞成團聚集在離心管底部，管蓋擰松一半，放入37℃，5％co2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。

24h后吸棄舊液，添加1ml陽性對照組成軟骨誘導(dǎo)液：含10μg/ltgf-β3、100μg/l胰島素樣生長因子、10^-7mol/l地塞米松、100μmol/l抗壞血酸、1vol％its⁺premix的高糖dmem培養(yǎng)液。輕彈離心管使細胞團漂浮，管蓋擰松一半，放入37℃，5％co2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。

誘導(dǎo)分化培養(yǎng)21d后對細胞進行石蠟切片、番紅o-快綠染色及ii型膠原免疫組化等實驗。

圖2為番紅o-快綠染色的實驗結(jié)果，如圖所示，細胞切片有著色，桃紅色區(qū)域明顯，說明細胞基質(zhì)有粘多糖生成；圖3為ii型膠原免疫組化的實驗結(jié)果，顯示黃褐色區(qū)域，說明有ii型膠原合成。

對比例1

取第3代mdscs，按5×10⁵cell/管接種于15ml離心管內(nèi)，1000rpm離心5min，使細胞成團聚集在離心管底部，管蓋擰松一半，放入37℃，5％co2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。

24h后吸棄舊液，更換1ml陰性對照組培養(yǎng)基：含10％fbs的高糖dmem培養(yǎng)液。輕彈離心管使細胞團漂浮，管蓋擰松一半，放入37℃，5％co2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。

培養(yǎng)21d后對細胞進行石蠟切片、番紅o-快綠染色及ii型膠原免疫組化等實驗。

圖4為番紅o-快綠染色的實驗結(jié)果，如圖所示，細胞切片無著色，說明細胞基質(zhì)無粘多糖生成。圖5為ii型膠原免疫組化的實驗結(jié)果，顯示無著色區(qū)域，說明無ii型膠原形成。