本專利屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及從土壤中分離到一株對多種植物病原細菌具有抑菌作用的假單胞菌株，并對番茄青枯菌進行了效果顯著的防治應(yīng)用。

背景技術(shù)：

在田間自然生態(tài)中，農(nóng)作物面臨多種病原物的侵染威脅，創(chuàng)制廣譜高效的新型農(nóng)藥是病害控制的一個有效策略。而我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上病害的綜合控制技術(shù)有待提高，還有很大的提升空間，主要在于（1）常用的殺菌劑專一性強，往往是“摁下葫蘆浮起瓢”，作物流行性的病害隔年交替爆發(fā)；（2）噴施以化學(xué)農(nóng)藥為主的殺菌劑，造成土壤環(huán)境污染嚴(yán)重，長期累積的農(nóng)藥殘留已經(jīng)進入農(nóng)畜產(chǎn)品，污染了食品，對我們的身體健康造成很大的影響。

土壤環(huán)境中的假單胞菌是一種革蘭氏陰性植物根圍促生細菌，可優(yōu)先利用根分泌物和根際土壤中的養(yǎng)料，得競爭優(yōu)勢，占居根際生態(tài)位，減少病原菌生長所必須的營養(yǎng)物質(zhì)，從而抑制病原菌生長。假單胞菌還能產(chǎn)生吩嗪、硝吡咯菌素、藤黃綠膿菌素、氫氰酸等抗生素，在植物病害生物防治中發(fā)揮重要作用。本發(fā)明從花生根圍土壤中分離到一株對多種植物病原細菌都有抑菌作用的假單胞菌株，這些病原菌侵染主要糧食作物水稻、重要果樹柑橘以及蔬菜番茄，顯示所分離的菌株具有廣譜的殺菌和抑菌效果，市場應(yīng)用前景巨大。通過全基因組測序分析，分離的假單胞菌株與已經(jīng)報道的所有假單胞菌的遺傳信息接近，但又存在很大的區(qū)別，是一個新的細菌種，具有專利保護價值。

茄科作物青枯病是由青枯勞爾氏細菌引起的一種具有毀滅性的土傳病害，該病原菌從寄主植物的根部，入侵木質(zhì)部導(dǎo)管，通過維管束系統(tǒng)迅速擴張到植物的地上部分，引發(fā)植物萎蔫，導(dǎo)致植物死亡。青枯菌的特殊病害循環(huán)及侵染途徑，造成病害的傳播和侵染性極強，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上缺乏有效的控制手段?；瘜W(xué)藥劑雖然能在一定程度上抑制病害的發(fā)生，但很難對青枯菌形成持續(xù)的作用，防治效果不理想。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一株用于細菌病害防治的假單胞菌及應(yīng)用。

本發(fā)明從花生根圍土壤中分離和鑒定了一株對植物病原細菌有抑制作用的假單胞菌株a1，通過全基因組測序確定為一個新的細菌菌株，在植物細菌病害的生態(tài)防治中具有極大的應(yīng)用前景；通過溫室盆栽試驗，該假單胞菌可有效控制番茄青枯病的為害。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

所述的假單胞菌(pseudomonassp.)a1，已于2017年4月14日于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心保藏，保藏號為cgmccno.14027。地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。

假單胞菌a1在nb和lb固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)后，沒有明顯的多糖產(chǎn)生，菌落顏色呈暗褐色。因為在nb固體平板上生長相對較好，顏色稍深。菌株不能使用半乳糖，甘露糖醇或阿多糖醇作為唯一的碳源，但具有利用果聚糖，果糖，肌醇和海藻糖的能力。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：本發(fā)明的生防菌株可以對青枯菌具有20天以上的持續(xù)作用，獲得優(yōu)異的防治效果。同時，運用本生防菌株，更接近田間自然生態(tài)，減少化學(xué)藥劑在土壤中的殘留，保證土壤質(zhì)量，是一個經(jīng)濟有效的綠色防控措施。

附圖說明

圖1、基于假單胞菌16srrna序列的進化樹分析。

圖2、分離的假單胞菌在平板上的生長及其對碳源的利用。

圖3、假單胞菌a1對植物病原細菌的抑制作用。

圖4、假單胞菌a1對番茄青枯病的防治效果。

具體實施方式

實施例1

（1）假單胞菌a1的分離和鑒定

從安徽省全椒縣的花生種植地采集土壤樣品，按3%的接種量接種到富集培養(yǎng)基中,經(jīng)30℃12h增殖培養(yǎng)；取上清2ml轉(zhuǎn)接到10ml新鮮的nb培養(yǎng)基中30℃24h培養(yǎng)。將富集培養(yǎng)物通過梯度濃度平板涂布，分離獲得培養(yǎng)基中的細菌培養(yǎng)物單菌落，其中的一個單菌落即為本發(fā)明的假單胞菌株，命名為a1。

設(shè)計16srrna通用引物（16sf:5′-agagtttgatcatggctca-3′;16sr:5′-ggtaccttgttacgactt-3′)，提取分離菌株ah的基因組為模板，擴增菌株的16srrna序列。pcr擴增條件為：95℃/5min+(94℃/45sec+52℃/30sec+72℃/1min30sec)×33循環(huán)+72℃/10min。pcr產(chǎn)物經(jīng)測序后與genbank數(shù)據(jù)庫登錄序列比較，確定為假單胞菌。在genbank數(shù)據(jù)庫中（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行同源性blast分析，同源序列均來自假單胞屬細菌，可以明確是假單孢屬細菌。其中，與惡臭假單胞菌和蒙氏假單胞菌的16srrna有99％的一致性相似性。對親緣關(guān)系較近的19個假單胞菌的16srrna基因序列為對象，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹揭示這些菌株之間的親緣關(guān)系（圖1）。分離的菌與假單胞菌屬細菌vlb120，pseudomonasmonteilii和pseudomonasputidas16分為一組。相比之下，與三種植物病原菌p.syringaepv.syringae，p.syringaepv.phaseolicola和p.syringaepv.tomatodc3000的親緣關(guān)系較遠。因此，分離菌株是假單孢屬細菌，命名為pseudomonassp.a1。將改菌株送至上海派森諾生物科技股份有限公司進行全基因組測序，從遺傳信息和基因結(jié)構(gòu)組成分析，明確為假單孢屬的一個細菌。

實施例2

pseudomonassp.a1在nb和lb固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)后，沒有明顯的多糖產(chǎn)生，菌落顏色呈暗褐色。因為在nb固體平板上生長相對較好，顏色稍深。同時培養(yǎng)的熒光假單胞菌在nb和lb顏色呈灰白色。正是因為所分離菌株的特殊菌落生長顏色，才引起重視（圖2a）。在基本培養(yǎng)基mmx中，分離的菌株不能使用半乳糖，甘露糖醇或阿多糖醇作為唯一的碳源，但它具有同化果聚糖，果糖，肌醇和海藻糖的能力（圖2b）。在含有果糖和果聚糖的mmx培養(yǎng)基上，菌株生長速度最快，可能是利用效率最高的碳源。平行實驗中的熒光假單胞菌除了可以利用果聚糖，果糖，肌醇和海藻糖，還可以利用半乳糖，甘露糖醇或阿多糖醇，表明分離的菌株與熒光假單胞菌不完全一樣。

實施例3

（1）假單胞菌對幾種植物病原細菌的抑菌作用

在豐富培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)植物病原細菌：水稻白葉枯病菌（xanthomonasoryzaepv.oryzae）、水稻條斑病菌（xanthomonasoryzaepv.oryzicola）、柑橘潰瘍病菌（xanthomonascitrisubsp.citri）和番茄青枯菌(ralstoniasolanacearum)，將培養(yǎng)的菌液od600值調(diào)整到1.0。在制備平板之前，按1：100比例加到na培養(yǎng)基中，搖勻后制作成帶菌平板。在平板中央加入2微升假單胞菌液（od600=1.0）；28℃靜止培養(yǎng)48小時后，觀察抑菌圈大小（圖3）。結(jié)果顯示，a1菌株對4個供試菌株都有明顯的抑制作用。

（2）假單胞菌a1對番茄青枯病的防治作用

在5-6片葉時期番茄植物的根部1cm處用刀造成傷口，在傷根部位灌注4ml假單胞菌液（od600=1.0）；在傷根處灌水作為平行對照。2天后在傷根處灌注4ml番茄青枯菌菌液（od600=1.0）。將接種后的番茄苗放入溫室內(nèi)，設(shè)定溫度28℃，光照16小時，黑暗8小時，用一個塑料袋包住植株，植株頂部將塑料袋開一小口，以保持其濕度；定期澆水，保持土壤濕潤。7天后灌水對照組接種番茄青枯菌的植物連續(xù)發(fā)病，15天后，對照組全部萎焉發(fā)病；惡臭假單胞處理的植株生長良好（圖4）。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

sequencelisting

<110>福建農(nóng)林大學(xué)

<120>一株用于細菌病害防治的假單胞菌及應(yīng)用

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