本發(fā)明涉及單細(xì)胞水平食源性致病菌的顯微觀測(cè)方法，特別涉及一種基于固體或固液雙層培養(yǎng)基的食源性致病菌單細(xì)胞個(gè)體生長(zhǎng)過(guò)程的顯微觀測(cè)方法。

背景技術(shù)：

常見(jiàn)的食源性致病菌有沙門(mén)氏菌、副溶血性弧菌、單增李斯特氏菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、臘樣芽孢桿菌等。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外由食源性致病菌引起的食物中毒事件越來(lái)越受到人們的廣泛關(guān)注。而多數(shù)食物中毒事件是由低菌量污染食品而引起的，所以在食源性致病菌生長(zhǎng)規(guī)律研究中，食源性致病菌單細(xì)胞個(gè)體研究顯得極為重要。

目前食源性致病菌單細(xì)胞水平研究中，觀測(cè)方法十分重要，但現(xiàn)有的觀測(cè)方法仍有很多不足。常用的探究微生物單細(xì)胞水平下生長(zhǎng)規(guī)律的方法有比濁法和顯微觀測(cè)法。其中比濁法的檢測(cè)指標(biāo)是菌懸液的渾濁度，無(wú)法直接觀測(cè)到細(xì)胞個(gè)體的生長(zhǎng)及分裂過(guò)程。而基于光學(xué)顯微鏡從單細(xì)胞水平來(lái)研究食源性致病菌單細(xì)胞個(gè)體的真實(shí)生長(zhǎng)分裂過(guò)程的方法仍存在一些問(wèn)題。比如，kelly等[1]將接種好的瓊脂薄膜置于定時(shí)拍照顯微鏡下觀察酵母細(xì)胞分裂的過(guò)程，其中瓊脂薄片可防止酵母細(xì)胞無(wú)序運(yùn)動(dòng)，定時(shí)拍照則可以記錄酵母單細(xì)胞個(gè)體的分裂過(guò)程。然而在長(zhǎng)時(shí)間觀測(cè)過(guò)程中，細(xì)胞個(gè)體會(huì)由于生長(zhǎng)環(huán)境營(yíng)養(yǎng)不足而停止生長(zhǎng)或死亡，進(jìn)而影響對(duì)其生長(zhǎng)的連續(xù)觀測(cè)。同時(shí)，隨著時(shí)間增長(zhǎng)，瓊脂薄片易產(chǎn)生脫水現(xiàn)象。當(dāng)觀測(cè)基質(zhì)為液體[2]時(shí)，分裂的子代細(xì)胞被流動(dòng)的營(yíng)養(yǎng)液帶走，導(dǎo)致觀測(cè)過(guò)程中無(wú)法觀測(cè)到食源性致病菌單細(xì)胞個(gè)體的整個(gè)生長(zhǎng)分裂過(guò)程。

因此，目前尚未有合適的方法對(duì)食源性致病菌單細(xì)胞個(gè)體開(kāi)展觀測(cè)工作。

參考文獻(xiàn)：

[1]、kellycd,rahno.thegrowthrateofindividualbacterialcells[j].journalofbacteriology,1932,23(2):147-153

[2]、elfwinga,lemarcy,baranyij,etal.observinggrowthanddivisionoflargenumbersofindividualbacteriabyimageanalysis[j].appliedandenvironmentalmicrobiology,2004,70(2):675-678。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種食源性致病菌單細(xì)胞個(gè)體生長(zhǎng)過(guò)程的顯微觀測(cè)方法，該觀測(cè)方法選用了適用于所有食源性致病菌的固體培養(yǎng)基或固液雙層培養(yǎng)基，因此該方法適用于所有食源性致病菌單細(xì)胞個(gè)體過(guò)程的觀測(cè)，并可不間斷直接觀測(cè)細(xì)胞個(gè)體的分裂過(guò)程。選用固體培養(yǎng)基作為食源性致病菌個(gè)體的固定介質(zhì)時(shí)，可避免具有鞭毛的食源性致病菌個(gè)體自由運(yùn)動(dòng)的問(wèn)題。用固/液雙層培養(yǎng)基時(shí)，該方法即固定了細(xì)菌，同時(shí)避免了因長(zhǎng)時(shí)間觀測(cè)而導(dǎo)致生長(zhǎng)環(huán)境營(yíng)養(yǎng)不足及固體培養(yǎng)基脫水的問(wèn)題。

本發(fā)明的技術(shù)方案

一種食源性致病菌單細(xì)胞個(gè)體生長(zhǎng)過(guò)程的顯微觀測(cè)方法，即在食源性致病菌上覆蓋適應(yīng)食源性致病菌生長(zhǎng)的固體培養(yǎng)基或固液雙層培養(yǎng)基，然后再用顯微鏡進(jìn)行觀測(cè)食源性致病菌單細(xì)胞個(gè)體生長(zhǎng)過(guò)程；

所述的覆蓋固液雙層培養(yǎng)基，即從下到上，依次為固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基；

當(dāng)在食源性致病菌上覆蓋適應(yīng)食源性致病菌生長(zhǎng)的固體培養(yǎng)基時(shí)，采用正置型或倒置型顯微鏡進(jìn)行觀測(cè)；

當(dāng)在食源性致病菌上覆蓋適應(yīng)食源性致病菌生長(zhǎng)的固液雙層培養(yǎng)基時(shí)，采用倒置型顯微鏡進(jìn)行觀測(cè)。

上述的一種食源性致病菌單細(xì)胞個(gè)體生長(zhǎng)過(guò)程的顯微觀測(cè)方法，具體包括如下步驟：

（1）、培養(yǎng)基的制備

本發(fā)明的實(shí)施例中僅以單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌（listeriamonocytogenesatcc13932，以下簡(jiǎn)稱(chēng)單增李斯特菌，上海理工大學(xué)劉箐教授贈(zèng)送（贈(zèng)送人地址：上海市楊浦區(qū)軍工路516號(hào)上海理工大學(xué)，聯(lián)系方式：13916919896）為例進(jìn)行說(shuō)明，但并不限制本觀測(cè)方法在其他食源性致病菌的使用，只是采用其他食源性致病菌時(shí)，對(duì)適應(yīng)該食源性致病菌生長(zhǎng)的固體培養(yǎng)基或固液雙層培養(yǎng)基要做適應(yīng)性的調(diào)整；

所述的適應(yīng)該食源性致病菌即單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932生長(zhǎng)的固體培養(yǎng)基為tsa-ye培養(yǎng)基，其原料組成，按每升計(jì)算，由17g胰蛋白胨、3g多價(jià)胨、6g酵母膏、5g氯化鈉、2.5g磷酸氫二鉀、2.5g葡萄糖、15g瓊脂和余量的水組成；

上述tsa-ye培養(yǎng)基通過(guò)包括如下步驟方法制備而成：

參考gb4789.30-2016：在容器中依次加入胰蛋白胨、多價(jià)胨、酵母膏、氯化鈉、磷酸氫二鉀、葡萄糖和瓊脂，然后加水定容至1升，然后加熱攪拌至完全溶解，調(diào)節(jié)ph至7.2±0.2，分裝，121℃高壓滅菌15min，然后放于50℃的恒溫箱中備用；

所述的適應(yīng)該食源性致病菌即單增李斯特菌生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)基為tsb-ye培養(yǎng)基，其原料組成，按每升計(jì)算，由17g胰蛋白胨、3g多價(jià)胨、6g酵母膏、5g氯化鈉、2.5g磷酸氫二鉀、2.5g葡萄糖和余量的水組成；

上述tsb-ye培養(yǎng)基通過(guò)包括如下步驟方法制備而成：

參考gb4789.30-2016：在容器中依次加入胰蛋白胨、多價(jià)胨、酵母膏、氯化鈉、磷酸氫二鉀和葡萄糖，然后加水定容至1升，然后加熱攪拌至完全溶解，用調(diào)節(jié)ph至7.2±0.2，分裝，121℃高壓滅菌15min，然后放于超凈工作臺(tái)備用；

（2）、稀釋后的單細(xì)胞單增李斯特菌菌懸液的制備

取增菌后的待測(cè)單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932菌懸液，將其用步驟（1）所配制的tsb-ye培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋至單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932菌體濃度達(dá)到3cfu/ml(cfu(colony-formingunits，菌落形成單位)，即得稀釋后的單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932菌懸液，其中cfu/ml指的是每毫升稀釋后的單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932菌懸液中含有的單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932的菌落總數(shù)；

（3）、基于固體培養(yǎng)基或固液雙層培養(yǎng)基的用于觀測(cè)單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932單細(xì)胞個(gè)體生長(zhǎng)過(guò)程的樣本的制備

首先，取20μl步驟（2）稀釋后的單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932菌懸液至無(wú)菌的35mm的玻底培養(yǎng)皿中，并緩慢旋搖，使稀釋后的單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932菌懸液平鋪在玻底培養(yǎng)皿的底部，靜置5min；

然后吸取100μl步驟（1）滅菌后的tsa-ye培養(yǎng)基稍冷卻后，加入到玻底培養(yǎng)皿中稀釋后的單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932菌懸液上，靜置直至tsa-ye培養(yǎng)基完全凝固，然后蓋上玻底培養(yǎng)皿的上蓋，即得基于固體培養(yǎng)基用于觀測(cè)單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932單細(xì)胞個(gè)體生長(zhǎng)過(guò)程的樣本；

或者首先吸取100μl步驟（1）滅菌后的tsa-ye培養(yǎng)基稍冷卻后，加入到玻底培養(yǎng)皿中稀釋后的單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932菌懸液上，靜置直至tsa-ye培養(yǎng)基完全凝固，再吸取100-200μl步驟（1）滅菌后的tsb-ye培養(yǎng)基，覆蓋于上述凝固后的tsa-ye培養(yǎng)基之上，然后蓋上玻底培養(yǎng)皿的上蓋，即得基于固液雙層培養(yǎng)基的用于觀測(cè)單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932單細(xì)胞個(gè)體生長(zhǎng)過(guò)程的樣本；

（4）、顯微鏡進(jìn)行觀測(cè)

采用正置型或倒置型顯微鏡的100倍物鏡，在玻底培養(yǎng)皿的底部對(duì)應(yīng)于稀釋后的單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932菌懸液的觀測(cè)窗處，通過(guò)調(diào)節(jié)分辨率、視野亮度、焦距，找到步驟（3）所得的基于固體培養(yǎng)基的用于觀測(cè)單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932單細(xì)胞個(gè)體生長(zhǎng)過(guò)程的樣本中的單細(xì)胞個(gè)體，然后進(jìn)行觀測(cè)單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932單細(xì)胞的分裂過(guò)程及細(xì)胞分裂隨時(shí)間變化的過(guò)程；

或采用倒置型顯微鏡的100倍物鏡，在玻底培養(yǎng)皿的底部對(duì)應(yīng)于稀釋后的單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932菌懸液的觀測(cè)窗處，通過(guò)調(diào)節(jié)分辨率、視野亮度、焦距，找到步驟（3）所得的基于固液雙層培養(yǎng)基的用于觀測(cè)單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932單細(xì)胞個(gè)體生長(zhǎng)過(guò)程的樣本中的單細(xì)胞個(gè)體，然后進(jìn)行觀測(cè)單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932單細(xì)胞的分裂過(guò)程及細(xì)胞分裂隨時(shí)間變化的過(guò)程。

本發(fā)明的有益技術(shù)效果

本發(fā)明的一種基于固體培養(yǎng)基或基于固液雙層培養(yǎng)基的用于觀測(cè)食源性致病菌單細(xì)胞個(gè)體生長(zhǎng)過(guò)程的方法，由于選用了適用于待觀測(cè)的食源性致病菌的固體培養(yǎng)基或固液雙層培養(yǎng)基對(duì)菌體觀測(cè)的全過(guò)程進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)供給，因此對(duì)食源性致病菌單細(xì)胞個(gè)體生長(zhǎng)過(guò)程進(jìn)行觀測(cè)時(shí)，可不間斷直接觀測(cè)細(xì)胞個(gè)體的分裂過(guò)程。

進(jìn)一步，本發(fā)明的基于固體培養(yǎng)基的用于觀測(cè)食源性致病菌單細(xì)胞個(gè)體生長(zhǎng)過(guò)程的方法，由于選用固體培養(yǎng)基作為食源性致病菌個(gè)體的固定介質(zhì)時(shí)，因此可避免具有鞭毛的食源性致病菌個(gè)體自由運(yùn)動(dòng)的問(wèn)題。并且，本發(fā)明中的固體培養(yǎng)基為適應(yīng)于食源性致病菌生長(zhǎng)的固體培養(yǎng)基，在觀測(cè)過(guò)程中，可為食源性致病菌提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

進(jìn)一步，基于固液雙層培養(yǎng)基的用于觀測(cè)食源性致病菌單細(xì)胞個(gè)體生長(zhǎng)過(guò)程的方法，由于固/液雙層培養(yǎng)基的使用，該方法即固定了細(xì)菌，同時(shí)避免了因長(zhǎng)時(shí)間觀測(cè)而導(dǎo)致生長(zhǎng)環(huán)境營(yíng)養(yǎng)不足及固體培養(yǎng)基脫水的問(wèn)題。

進(jìn)一步，本發(fā)明的固體培養(yǎng)基或基于固液雙層培養(yǎng)基的用于觀測(cè)食源性致病菌單細(xì)胞個(gè)體生長(zhǎng)過(guò)程的方法，可根據(jù)顯微鏡系統(tǒng)的類(lèi)型（正置型或倒置型顯微鏡系統(tǒng)）來(lái)選擇所需要的觀測(cè)體系，固體單層培養(yǎng)基體系適于正置型與倒置型顯微鏡系統(tǒng)的觀測(cè)，而固液雙層培養(yǎng)基體系適于倒置型顯微系統(tǒng)的長(zhǎng)時(shí)間觀測(cè)。

附圖說(shuō)明

1、基于固液雙層培養(yǎng)基的用于觀測(cè)單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932單細(xì)胞個(gè)體生長(zhǎng)過(guò)程的樣本的結(jié)構(gòu)示意圖；

2、基于固液雙層培養(yǎng)基的單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932單細(xì)胞裂變的生長(zhǎng)過(guò)程示意圖；

3、以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以裂變后的細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)繪圖，所得的單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932單細(xì)胞裂變后的細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化情況的示意圖。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步闡述，但并不限制本方法在其他類(lèi)似觀測(cè)系統(tǒng)中的應(yīng)用。

以下的實(shí)施例中僅以單增李斯特氏菌listeriamonocytogenesatcc13932，上海理工大學(xué)劉箐教授贈(zèng)送（贈(zèng)送人地址：上海市楊浦區(qū)軍工路516號(hào)上海理工大學(xué)，聯(lián)系方式：13916919896）為舉例進(jìn)行說(shuō)明，但并不限制本方法在其他食源性致病菌單細(xì)胞個(gè)體生長(zhǎng)過(guò)程觀測(cè)中的應(yīng)用。

實(shí)施例中所用的正置型顯微鏡是bx41tf-5型生物顯微鏡，購(gòu)于日本奧林巴斯株式會(huì)社；

倒置型顯微鏡是ts100倒置型生物顯微鏡，購(gòu)于日本奧林巴斯株式會(huì)社。

本發(fā)明各實(shí)施例中所用的胰蛋白胨、多價(jià)胨、酵母膏、氯化鈉、磷酸氫二鉀、葡萄糖和瓊脂均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

實(shí)施例1

一種食源性致病菌即單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932單細(xì)胞個(gè)體生長(zhǎng)過(guò)程的顯微觀測(cè)方法，即在單增李斯特氏菌listeriamonocytogenesatcc13932上覆蓋適應(yīng)單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932生長(zhǎng)的固液雙層培養(yǎng)基，然后采用倒置型顯微鏡進(jìn)行觀測(cè)單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932單細(xì)胞個(gè)體生長(zhǎng)過(guò)程；

所述的適用單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932生長(zhǎng)的固液雙層培養(yǎng)基，即從下到上，依次為固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基。

所述的固體培養(yǎng)基為tsa-ye培養(yǎng)基，其原料組成，按每升計(jì)算，由17g胰蛋白胨、3g多價(jià)胨、6g酵母膏、5g氯化鈉、2.5g磷酸氫二鉀、2.5g葡萄糖、15g瓊脂和余量的水組成；

上述tsa-ye培養(yǎng)基通過(guò)包括如下步驟方法制備而成：

參考gb4789.30-2016：在容器中依次加入胰蛋白胨、多價(jià)胨、酵母膏、氯化鈉、磷酸氫二鉀、葡萄糖和瓊脂，然后加水定容至1升，然后加熱攪拌至完全溶解，調(diào)節(jié)ph至7.2±0.2，分裝，121℃高壓滅菌15min，備用；

所述的液體培養(yǎng)基為tsb-ye培養(yǎng)基，其原料組成，由按每升計(jì)算，由17g胰蛋白胨、3g多價(jià)胨、6g酵母膏、5g氯化鈉、2.5g磷酸氫二鉀、2.5g葡萄糖和余量的水組成；

上述tsb-ye培養(yǎng)基通過(guò)包括如下步驟方法制備而成：

參考gb4789.30-2016：在容器中依次加入胰蛋白胨、多價(jià)胨、酵母膏、氯化鈉、磷酸氫二鉀和葡萄糖，然后加水定容至1升，然后加熱攪拌至完全溶解，用調(diào)節(jié)ph至7.2±0.2，分裝，121℃高壓滅菌15min，備用。

上述的一種單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932單細(xì)胞個(gè)體生長(zhǎng)過(guò)程的顯微觀測(cè)方法，具體包括如下步驟：

（1）、tsa-ye培養(yǎng)基、tsb-ye培養(yǎng)基的制備

①、tsa-ye培養(yǎng)基的配制

參考gb4789.30-2016即在容器中依次加17g胰蛋白胨、3g多價(jià)胨、6g酵母膏、5g氯化鈉、2.5g磷酸氫二鉀、2.5g葡萄糖、15g瓊脂，然后加水定容至1升，然后加熱攪拌至完全溶解，調(diào)節(jié)ph至7.2±0.2，分裝，121℃高壓滅菌15min，即得tsa-ye培養(yǎng)基；

②、tsb-ye培養(yǎng)基的配制

參考gb4789.30-2016即在容器中依次加入17g胰蛋白胨、3g多價(jià)胨、6g酵母膏、5g氯化鈉、2.5g磷酸氫二鉀、2.5g葡萄糖，然后加水定容至1升，然后加熱攪拌至完全溶解，調(diào)節(jié)ph至7.2±0.2，分裝，121℃高壓滅菌15min，即得tsb-ye培養(yǎng)基，然后放于超凈工作臺(tái)上備用；

（2）、稀釋后的單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932菌懸液的制備

取增菌后的待測(cè)單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932菌懸液，將其用步驟（1）所配制的tsb-ye培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋至單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932菌體濃度達(dá)到3cfu/ml(cfu(colony-formingunits，菌落形成單位)，即得稀釋后的單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932懸液，其中cfu/ml指的是每毫升稀釋后的單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932菌懸液中含有的單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932的菌落總數(shù)；

（3）、基于固液雙層培養(yǎng)基的用于觀測(cè)單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932單細(xì)胞個(gè)體生長(zhǎng)過(guò)程的樣本的制備，所述的基于固液雙層培養(yǎng)基的用于觀測(cè)單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932單細(xì)胞個(gè)體生長(zhǎng)過(guò)程的樣本的結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示，其中1為玻底培養(yǎng)皿、2為玻底培養(yǎng)皿的上蓋、3為稀釋后的單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932菌懸液、4為tsa-ye培養(yǎng)基、5為tsb-ye培養(yǎng)基，其制備過(guò)程的具體步驟如下；

首先，取20μl步驟（2）稀釋后的單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932菌懸液3至無(wú)菌的35mm的玻底培養(yǎng)皿1中，并緩慢旋搖，使稀釋后的單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932菌懸液3平鋪在玻底培養(yǎng)皿1的底部，靜置5min；

然后吸取100μl步驟（1）滅菌后的tsa-ye培養(yǎng)基4稍冷卻后，加入到玻底培養(yǎng)皿中稀釋后的單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932菌懸液3上，靜置直至tsa-ye培養(yǎng)基4完全凝固；

然后再吸取100-200μl步驟（1）滅菌后的tsb-ye培養(yǎng)基5，覆蓋于上述凝固后的tsa-ye培養(yǎng)基4之上，然后蓋上玻底培養(yǎng)皿的上蓋2，即得基于固液雙層培養(yǎng)基的用于觀測(cè)單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932單細(xì)胞個(gè)體生長(zhǎng)過(guò)程的樣本；

（4）、顯微鏡進(jìn)行觀測(cè)

采用倒置型顯微鏡的100倍物鏡，在玻底培養(yǎng)皿2的底部對(duì)應(yīng)于稀釋后的單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932菌懸液3的觀測(cè)窗處，通過(guò)調(diào)節(jié)分辨率、視野亮度、焦距，找到步驟（3）所得的基于固液雙層培養(yǎng)基的用于觀測(cè)單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932單細(xì)胞個(gè)體生長(zhǎng)過(guò)程的樣本中的單細(xì)胞個(gè)體，然后進(jìn)行觀測(cè)，觀測(cè)過(guò)程記錄單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932單細(xì)胞的分裂過(guò)程及細(xì)胞分裂隨時(shí)間變化的過(guò)程。

所得的基于固液雙層培養(yǎng)基的單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932單細(xì)胞裂變的生長(zhǎng)過(guò)程示意圖如圖2所示，從圖2中可以看出食源性致病菌第一次分裂時(shí)間較之后幾次分裂時(shí)間長(zhǎng)，由此表明了細(xì)胞平均分裂時(shí)間隨分裂次數(shù)增加而逐漸減少，說(shuō)明細(xì)胞分裂速度在一定時(shí)間內(nèi)呈增加的趨勢(shì)，其與傳統(tǒng)的單細(xì)胞生長(zhǎng)流動(dòng)槽觀測(cè)單細(xì)胞分裂進(jìn)行對(duì)比，表明了本發(fā)明方法保證母代細(xì)胞與子代細(xì)胞在共存條件下生長(zhǎng)分裂，而非僅獨(dú)立地觀測(cè)母代細(xì)胞的生長(zhǎng)分裂，更加符合實(shí)際介質(zhì)中單個(gè)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程。

以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以裂變后的細(xì)胞個(gè)數(shù)隨機(jī)生成總數(shù)為縱坐標(biāo)繪圖，所得的單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932單細(xì)胞裂變后的細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化情況的示意圖如圖3所示，從圖3中可以看出，由該數(shù)據(jù)擬合得到的隨機(jī)生長(zhǎng)示意圖符合微生物生長(zhǎng)的基本規(guī)律，由此表明了本發(fā)明方法可以為微生物單細(xì)胞生長(zhǎng)模型的構(gòu)建提供數(shù)據(jù)來(lái)源。

實(shí)施例2

一種食源性致病菌即單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932單細(xì)胞個(gè)體生長(zhǎng)過(guò)程的顯微觀測(cè)方法，即在單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932上覆蓋適應(yīng)單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932生長(zhǎng)的固體培養(yǎng)基，然后用正置型或倒置型顯微鏡進(jìn)行觀測(cè)單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932單細(xì)胞個(gè)體生長(zhǎng)過(guò)程；

所述的適用單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932生長(zhǎng)所用的固體培養(yǎng)基為tsa-ye培養(yǎng)基；

所述的tsa-ye培養(yǎng)基，其原料組成，按每升計(jì)算，由17g胰蛋白胨、3g多價(jià)胨、6g酵母膏、5g氯化鈉、2.5g磷酸氫二鉀、2.5g葡萄糖、15g瓊脂和余量的水組成；

上述tsa-ye培養(yǎng)基通過(guò)包括如下步驟方法制備而成：

參考gb4789.30-2016：在容器中依次加入胰蛋白胨、多價(jià)胨、酵母膏、氯化鈉、磷酸氫二鉀、葡萄糖和瓊脂，然后加水定容至1升，然后加熱攪拌至完全溶解，調(diào)節(jié)ph至7.2±0.2，分裝，121℃高壓滅菌15min，備用。

上述的一種單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932單細(xì)胞個(gè)體生長(zhǎng)過(guò)程的顯微觀測(cè)方法，具體包括如下步驟：

（1）、tsa-ye培養(yǎng)基、tsb-ye培養(yǎng)基的制備

①、tsa-ye培養(yǎng)基的配制

參考gb4789.30-2016：在容器中依次加入胰蛋白胨、多價(jià)胨、酵母膏、氯化鈉、磷酸氫二鉀、葡萄糖和瓊脂，然后加水定容至1升，然后加熱攪拌至完全溶解，調(diào)節(jié)ph至7.2±0.2，分裝，121℃高壓滅菌15min，然后放于50℃的恒溫箱中備用；

②、稀釋增菌后的待測(cè)單增李斯特菌菌懸液所用的tsb-ye培養(yǎng)基的配制

上述tsb-ye培養(yǎng)基通過(guò)包括如下步驟方法制備而成：

參考gb4789.30-2016即在容器中依次加入17g胰蛋白胨、3g多價(jià)胨、6g酵母膏、5g氯化鈉、2.5g磷酸氫二鉀、2.5g葡萄糖，然后加水定容至1升，然后加熱攪拌至完全溶解，調(diào)節(jié)ph至7.2±0.2，分裝，121℃高壓滅菌15min，即得tsb-ye培養(yǎng)基，然后放于超凈工作臺(tái)上備用；

（2）、稀釋后的單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932菌懸液的制備

取增菌后的待測(cè)單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932菌懸液，將其用tsb-ye培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋至單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932菌體濃度達(dá)到3cfu/ml(cfu(colony-formingunits，菌落形成單位)，即得稀釋后的單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932菌懸液，其中cfu/ml指的是每毫升稀釋后的單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932菌懸液中含有的單細(xì)胞單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932的菌落總數(shù)；

（3）、基于固體培養(yǎng)基的用于觀測(cè)單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932單細(xì)胞個(gè)體生長(zhǎng)過(guò)程的樣本的制備

首先，取20μl步驟（2）所得的稀釋后的單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932菌懸液至無(wú)菌的35mm的玻底培養(yǎng)皿中，并緩慢旋搖，使稀釋后的單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932菌懸液鋪平在玻底培養(yǎng)皿的底部，靜置5min；

然后，吸取100μl步驟（1）滅菌后的tsa-ye培養(yǎng)基，稍冷卻至室溫后加入到玻底培養(yǎng)皿中稀釋后的單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932菌懸液上，靜置直至tsa-ye培養(yǎng)基完全凝固，然后蓋上玻底培養(yǎng)皿的上蓋并密封，即得基于固體培養(yǎng)基的用于觀測(cè)單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932單細(xì)胞個(gè)體生長(zhǎng)過(guò)程的樣本；

（4）、顯微鏡進(jìn)行觀測(cè)

采用正置型或倒置型顯微鏡的100倍物鏡，調(diào)節(jié)分辨率、視野亮度、焦距，從玻底培養(yǎng)皿的底部向上的觀測(cè)窗進(jìn)行觀測(cè)，直至找到步驟（3）所得的基于固體培養(yǎng)基的用于觀測(cè)單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932單細(xì)胞個(gè)體生長(zhǎng)過(guò)程的樣本中的單細(xì)胞個(gè)體，記錄單增李斯特菌listeriamonocytogenesatcc13932單細(xì)胞個(gè)體細(xì)胞分裂情況及其細(xì)胞裂變隨時(shí)間變化的情況。

綜上所述，本發(fā)明的一種食源性致病菌單細(xì)胞個(gè)體生長(zhǎng)過(guò)程的顯微觀測(cè)方法，由于通過(guò)固體培養(yǎng)基將食源性致病菌單細(xì)胞個(gè)體固定于培養(yǎng)基上，因此，可觀測(cè)到食源性致病菌單細(xì)胞連續(xù)分裂的全過(guò)程，并且由于固體培養(yǎng)基的存在，觀測(cè)過(guò)程不受營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足而干擾。

以上所述內(nèi)容僅為本發(fā)明構(gòu)思下的基本說(shuō)明，而依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案所做的任何等效變換，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。