本發(fā)明涉及蛋白分子表達(dá)和純化技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種二氫硫辛酸脫氫酶lpd的表達(dá)和純化方法。

背景技術(shù)：

二氫硫辛酸脫氫酶e3（lipoatedehydrogenaselipoamidedehydrogenase，lpda基因編碼），即lpd，是大腸桿菌的丙酮酸脫氫酶復(fù)合體pdh（pyruvatedehydrogenasecomplex）的重要組成部分，它同丙酮酸脫羧酶e1（pyruvatedecarboxylase，acee基因編碼)，硫辛酸乙酰轉(zhuǎn)移酶e2(lipoatetransacetylase，acef基因編碼)共同構(gòu)成一個大小約為4.6md的復(fù)合體蛋白。其核心單位由e2組成，核心外分別被e1和e3包裹，三者比例為24：24：12。其中e3－lpd主要催化以下反應(yīng)：

丙酮酸脫氫酶復(fù)合體是生物體進(jìn)行糖代謝的樞紐，其催化和活性調(diào)節(jié)過程非常復(fù)雜。真核生物中，丙酮酸脫氫酶pdh是通過磷酸化和去磷酸的的作用進(jìn)行調(diào)節(jié)的，而在細(xì)菌特別是大腸桿菌中卻截然不同：

首先aceef-lpda基因受到了pdhr操縱子在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)：當(dāng)細(xì)胞內(nèi)沒有丙酮酸存在時，pdhr蛋白結(jié)合在pdhr的操作子區(qū)域，阻礙整個pdhr-aceef-lpda基因的轉(zhuǎn)錄。盡管lpda基因也有自己的啟動子，并且能夠獨立轉(zhuǎn)錄，但由于丙酮酸脫氫酶復(fù)合體pdh跟α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體α-kdpg共用lpd蛋白，故被廣泛認(rèn)為是lpda在進(jìn)行單獨轉(zhuǎn)錄和翻譯時，lpd更多的是出于α-kdpg裝配合成的目的。

再者，糖酵解過程中的中間化合如葡萄糖-6-p，果糖-1，6-p和甘油酸-3-p等對pdh的活性有正向調(diào)節(jié)作用，gtp（atp）則對pdh的活性有抑制作用。此外，pdh的催化產(chǎn)物乙酰-coa和nadh對pdh活性具有競爭性抑制作用，主要是表現(xiàn)為他們同酶的作用底物coa和nad^＋競爭活性部位，其中乙酰-coa抑制e2，而e3：lpd則受到nadh的強(qiáng)烈抑制。越來越多的研究揭示，pdh特別是lpd的活性對細(xì)胞內(nèi)nadh濃度特別敏感，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)nadh濃度或者nadh/nad^＋的比率增高時，lpd的活性會受到明顯的抑制，反之，酶的活性則較高。研究顯示，大腸桿菌好氧跟厭氧生長時體內(nèi)的的nadh/nad^＋比值約為0.19：0.34，也有人報道為0.03：0.70。因而在厭氧狀態(tài)下，由于lpd活性受到了高濃度nadh的抑制，使得pdh雖然能夠正常表達(dá)，但活性卻受到抑制。最近，更有研究者發(fā)現(xiàn)，lpd某些氨基酸位點的改變，可使lpd乃至整個pdh復(fù)合體的酶學(xué)性質(zhì)發(fā)生了改變，使得缺失厭氧生長途徑的大腸桿菌出現(xiàn)了厭氧生長性狀恢復(fù)。這說明lpd蛋白是大腸桿菌進(jìn)行pdh活性調(diào)節(jié)的物質(zhì)基礎(chǔ)，lpd的變化將對整個pdh蛋白復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生重要的影響。研究lpd蛋白的結(jié)構(gòu)生物學(xué)特征對于揭示lpd蛋白與e1和e2組分的乃至真?zhèn)€pdh蛋白相互作用機(jī)制將會有積極的推動意義。

據(jù)文獻(xiàn)報道，目前有關(guān)二氫硫辛酸脫氫酶（lpd）的表達(dá)和純化，幾乎全部都是利用誘導(dǎo)方式表達(dá)的。如果誘導(dǎo)獲得帶有純化標(biāo)簽的lpd融合蛋白，還需使用能識別特異性的氨基酸位點的蛋白酶將純化標(biāo)簽剪除，方可純化的lpd蛋白。在實際工作中，利用此種方式表達(dá)和純化lpd蛋白前，首先需要對lpd蛋白的表達(dá)條件進(jìn)行摸索，且純化后期還要經(jīng)過透析換液等步驟去除標(biāo)簽酶，整個過程相對較繁瑣，操作不當(dāng)極易引起目的蛋白的失活或降解。因此，要進(jìn)行l(wèi)pd蛋白的研究，迫切需要一種能簡捷，快速表達(dá)和純化高活性lpd蛋白的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，以解決現(xiàn)有技術(shù)中采用誘導(dǎo)方式表達(dá)純化lpd過程繁瑣且易引起目的蛋白失活或降解的問題，本發(fā)明提供了一種二氫硫辛酸脫氫酶lpd的表達(dá)和純化方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：

一種二氫硫辛酸脫氫酶lpd的表達(dá)方法，克隆二氫硫辛酸脫氫酶的全部基因，并與克隆載體體外構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，然后將構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主大腸桿菌，表達(dá)二氫硫辛酸脫氫酶lpd。

作為優(yōu)選方案，所述二氫硫辛酸脫氫酶的全部基因核苷酸序列如seqidno：1所示。

序列表中seqidno.1由2347個核苷酸組成；第330-414位核苷酸序列為lpda基因的啟動子序列，第2008-2036位核苷酸序列為lpda基因的終止子序列；第555-1978位核苷酸序列為lpda基因的編碼序列，其中555-557位核苷酸序列為lpda基因的起始密碼子。seqidno.1第1-330位核苷酸序列為lpda基因的上游序列，即acef基因的部分序列；seqidno.1第2036-2347位核苷酸序列為lpda基因的下游序列，即yach基因的部分序列。

二氫硫辛酸脫氫酶的氨基酸序列如seqidno：2所示。

作為優(yōu)選方案，所述克隆載體為pbr322質(zhì)粒。

進(jìn)一步地，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒時，通過限制性內(nèi)切酶位點nhei和avai構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。

作為優(yōu)選方案，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒時，保留了pbr322的amp抗性編碼序列，剔除了kan抗性編碼區(qū)域。

作為優(yōu)選方案，所述克隆載體為剔除了啟動子的pet表達(dá)載體。

作為優(yōu)選方案，所述宿主大腸桿菌為bl21（de3）菌株。

作為優(yōu)選方案，還包括對二氫硫辛酸脫氫酶lpd的純化。

進(jìn)一步地，破菌液上清采用羥基磷灰石層析柱以磷酸緩沖溶液作為洗脫液洗脫純化。

進(jìn)一步地，所述磷酸緩沖溶液的ph為7.5，濃度為50-500mmol/l。

本發(fā)明中純化方法中選用對目的蛋白有極強(qiáng)的阻留能力，對雜蛋白阻留能力較弱的羥基磷灰石填料層析柱，通過選用ph為7.5、濃度為50-500mmol/l的磷酸緩沖溶液梯度洗脫，使雜蛋白與目的蛋白分離；純化效果非常好，所得lpd純度高。

本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明的方法在利用大腸桿菌在制備lpd方面具有表達(dá)穩(wěn)定、操作簡便、成本低、效率高的優(yōu)點，由于此種方式獲得的lpd蛋白不含任何的標(biāo)簽，很好地保持了目的蛋白的天然構(gòu)象和活性，可為lpd蛋白研究提供優(yōu)質(zhì)材料。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖。

圖1為重組質(zhì)粒psn1；

圖2為pbr322與psn1轉(zhuǎn)化bl21（de3）后的表達(dá)情況；m：蛋白marker；1：bl21（de3）/pbr322表達(dá)情況；2：bl21（de3）/psn1表達(dá)情況。

圖3是羥基磷灰石柱純化后的lpd蛋白sds-page電泳分析，m：蛋白marker；1：純化后的lpd蛋白。

具體實施方式

以下實施例僅用于說明本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

以下實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)條件，如《分子克?。簩嶒炇沂謨浴?newyork：coldspringharborlaboratorypress,1989）中所述的條件進(jìn)行。

實施例1

二氫硫辛酸脫氫酶lpd的表達(dá)方法和純化方法，包括步驟：

1、二氫硫辛酸脫氫酶lpd的克隆及重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1）lpda基因的pcr擴(kuò)增

通過lpda基因和載體pbr322的酶切圖譜分析，設(shè)計引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

上游引物為：

（劃線部分為酶切位點nhei）；

下游引物為：

（劃線部分為酶切位點avai）。

以e.colik-12mg1655的基因組dna為模板，按以下程序：98℃預(yù)變性3min；98℃變性20sec，45℃退火20sec，72℃延伸1min15sec，5個循環(huán)；98℃變性20sec，54℃退火20sec，72℃延伸1min15sec，30個循環(huán)；72℃延伸10min進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到一段包含lpda啟動子,結(jié)構(gòu)基因和終止子在內(nèi)的整個lpda表達(dá)框，大小約為2.3kb。

2）lpda和pbr322載體的酶切連接

pcr產(chǎn)物（整個lpda基因）經(jīng)過qiagen核酸純化試劑盒純化后，與質(zhì)粒pbr322一起用限制性內(nèi)切酶nhei和avai切割，膠回收試劑盒純化回收酶切產(chǎn)物，t4ligase16℃過夜連接。

3）連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化及陽性克隆的篩選

將連接產(chǎn)物cacl2法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌top10，涂布抗性平板，影印接種法篩選具有amp抗性無kan抗性的陽性克隆。提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗證，最后通過測序確保基因無突變發(fā)生。、

2、二氫硫辛酸脫氫酶lpd蛋白的表達(dá)

將測序正確的重組質(zhì)粒命名為psn1（如圖1所示），將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主bl21（de3），lb＋amp平板挑選陽性克隆。分別挑取bl21（de3）/pbr322和bl21（de3）/psn1單菌落過夜培養(yǎng)，以1％接種量接種m9培養(yǎng)基，以37°c，200rpm培養(yǎng)至od420＝1.0時，5,000×g離心10min收集菌體，菌體經(jīng)超聲破菌后，將上清進(jìn)行sds-page電泳，檢測lpd蛋白表達(dá)的情況，結(jié)果如圖2所示。

3、二氫硫辛酸脫氫酶lpd蛋白的純化

a．將羥基磷灰石柱子（hydroxyapatitecolumn；1.5×12.0cm;bio-rad)連接蛋白純化檢測儀器，并用5-10倍柱床體積的ph7.5的磷酸緩沖溶液平衡至基線；

b．菌體重懸于磷酸緩沖溶液中，同時加入復(fù)合蛋白酶抑制劑proteaseinhibitorcocktail和100μg/mldnasei和rnasea后，用frenchpressurecell(20,000lb.in²)進(jìn)行機(jī)械破碎；

c.破菌液經(jīng)100,000×g4°c離心1h，上清用0.45μm濾膜過濾，用等體積磷酸緩沖溶液稀釋樣品并以0.2ml/min的流速上樣，收集穿透峰；

d.以50mmph7.5的磷酸緩沖溶液平衡層析柱至基線，用50-500mmph7.5的磷酸緩沖溶液進(jìn)行線性梯度洗脫，2ml/管收集蛋白峰，收集具有l(wèi)pd活性的組分，并用sds-page檢測蛋白的純度，結(jié)果如圖3所示。

將純化后所得lpd蛋白進(jìn)行活性分析

純化后的lpd蛋白應(yīng)立即進(jìn)行酶活力的測定及酶動力學(xué)分析。

lpd蛋白的活性分析按正向和逆向兩個反應(yīng)分別進(jìn)行測定：

正向反應(yīng)：每1.0ml的反應(yīng)體系中分別含有：0.1mkh2po4(ph7.5)，3mmnad⁺，3mmdl-dihydrolipoicacid，1.5mmedta，及適量的酶樣品，反應(yīng)在室溫下進(jìn)行。

1個活力單位定義為：每min生成1μmolenadh所需要的酶蛋白量，即μmolenadh/min·mgprotein。反應(yīng)起始于dl-dihydrolipoicacid的添加，通過檢測340nm下nadh的生成量進(jìn)行換算，具體操作按照表1進(jìn)行：

表1：

a：反應(yīng)體系中加入酶樣品的體積（ul）

逆向反應(yīng)：每1.0ml的反應(yīng)體系中分別含有：0.1mkh2po4(ph7.5)，0.1mmnad⁺，0.1mmnadh,3mmdl-lipoamide，1.5mmedta和適量的酶樣品，反應(yīng)在室溫下進(jìn)行。

1個活力單位定義為每min生成氧化1μmolenadh所需要的酶蛋白量，即μmolenadh/min·mgprotein。反應(yīng)起始于nadh的添加，通過檢測340nm下nadh的生成量進(jìn)行換算，具體操作按照表2進(jìn)行：

表2：

b：反應(yīng)體系中加入酶樣品的體積（ul）

經(jīng)測定，標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下，當(dāng)反應(yīng)體系中未添加nadh時，lpd正向反應(yīng)酶活力為410.7iu；

當(dāng)體系中含有0.1mmnad^＋時，0.1mmnadh，lpd逆向反應(yīng)最大酶活力為75.38iu。

表3本發(fā)明所得ipd活力與文獻(xiàn)1、文獻(xiàn)2活力對照

a:由于文獻(xiàn)2中的未明確標(biāo)明正向及逆向反應(yīng)的酶活力，表中所顯示的數(shù)值只是根據(jù)文獻(xiàn)圖表做的估值。

由以上圖表中的數(shù)據(jù)可以看出：本發(fā)明所得到的lpd蛋白活力最高，文獻(xiàn)1次之，而文獻(xiàn)2最低。分析認(rèn)為：本發(fā)明主要是利用了lpd蛋白自身的啟動子，可以認(rèn)為是在一種接近本底表達(dá)的水平上來獲得目的蛋白，且表達(dá)的lpd蛋白不含任何標(biāo)簽，有利于表達(dá)過程中蛋白正確折疊和保持正確的構(gòu)象；此外，本發(fā)明的純化方式也較溫和，這有利于純化過程中蛋白空間結(jié)構(gòu)的維持和蛋白活性保持。反觀文獻(xiàn)1和2中的蛋白表達(dá)和純化，其蛋白表達(dá)都是通過iptg誘導(dǎo)，且在文獻(xiàn)2中l(wèi)pd蛋白的純化還增加了一個去除純化標(biāo)簽的步驟，使得目的蛋白在相對復(fù)雜的純化過程中活性保持效果不理想，故有以上實驗結(jié)果也是理所當(dāng)然。這充分說明了本發(fā)明在研究lpd蛋白，特別是有關(guān)空間構(gòu)象方面的結(jié)構(gòu)生物學(xué)方面的研究更有優(yōu)勢，且該發(fā)明純化過程也更簡便、快速，可加速實驗進(jìn)程。

文獻(xiàn)1：wei,w.,h.li,n.nemeria,andf.jordan.2003.expressionandpurificationofthedihydrolipoamideacetyltransferaseanddihydrolipoamidedehydrogenasesubunitsoftheescherichiacolipyruvatedehydrogenasemultienzymecomplex:amassspectrometricassayforreductiveacetylationofdihydrolipoamideacetyltransferase.proteinexpr.purif.28:140–150.

文獻(xiàn)2：kim,y,ingram,l.o.,shanmugam,k.t.2008.dihydrolipoamidedehydrogenasemutationaltersthenadhsensitivityofpyruvatedehydrogenasecomplexofescherichiacolik-12.j.bacteriol.190:3851-3858.

sequencelisting

<110>張吉

<120>一種二氫硫辛酸脫氫酶lpd的表達(dá)和純化方法

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380385390

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