本發(fā)明涉及植物源殺菌劑,具體的說是一種別異歐前胡內(nèi)酯衍生物的制備及其應(yīng)用。
背景技術(shù):
蘋果是我國的主要經(jīng)濟(jì)作物,尤其膠東蘋果享譽(yù)全國,給當(dāng)?shù)貛砭薮蠼?jīng)濟(jì)效益,但同時(shí),蘋果病害對(duì)蘋果品質(zhì)與產(chǎn)量的影響也日趨嚴(yán)重。蘋果腐爛病能夠直接侵害果樹皮層,使蘋果樹日漸衰弱,嚴(yán)重的甚至枯死;蘋果輪紋病又名粗皮病、輪紋爛果病,在我國蘋果園區(qū)普遍發(fā)生,常與蘋果炭疽病等混合發(fā)病。蘋果輪紋病與蘋果炭疽病不但危害蘋果的生長(zhǎng)過程,也能夠影響蘋果采后儲(chǔ)藏,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
近年來,隨著化學(xué)農(nóng)藥大量使用,上述蘋果病害抗藥性日益嚴(yán)重,隨之也帶來農(nóng)殘超標(biāo)、環(huán)境污染甚至人畜中毒等問題。與化學(xué)農(nóng)藥相比,植物源農(nóng)藥具有選擇性高、毒性較低、易于降解及病蟲害不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn),成為未來綠色友好農(nóng)藥發(fā)展的重要方向。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的是提供一種別異歐前胡內(nèi)酯衍生物的制備及其應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:
一種別異歐前胡內(nèi)酯衍生物,別異歐前胡內(nèi)酯衍生物結(jié)構(gòu)如式(一)所示。
一種別異歐前胡內(nèi)酯衍生物的制備方法,其特征在于:
1)取羌活notopterygiumincisumtingexh.chang的干燥根莖,粉碎,過篩,并經(jīng)有機(jī)溶劑提取,獲得提取物,待用;
2)將上述提取物進(jìn)行硅膠柱層析,以石油醚–乙酸乙酯及氯仿–甲醇進(jìn)行梯度洗脫,收集洗脫液,洗脫液經(jīng)薄層層析檢測(cè);
3)將上述步驟2)中石油醚–乙酸乙酯體積比1:1梯度的洗脫組分,依次進(jìn)行反相硅膠柱層析、sephadexlh-20凝膠柱層析與制備高效液相色譜法分離純化,收集保留時(shí)間tr值為14.1-16.1min的組分,即得式(一)所示別異歐前胡內(nèi)酯衍生物。
所述步驟3)收集保留時(shí)間tr值為15.3min的組分,即得式(一)所示別異歐前胡內(nèi)酯衍生物。
所述步驟1)羌活notopterygiumincisumtingexh.chang的干燥根莖,粉碎,過20~30目篩,經(jīng)甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、水中的一種或幾種作為有機(jī)溶劑進(jìn)行提取,獲得提取物。
所述步驟2)中石油醚–乙酸乙酯洗脫梯度為80:1至1:1,氯仿–甲醇洗脫梯度為40:1至1:1。
所述步驟3)中反向硅膠柱層析洗脫液為體積比4:1的甲醇–水,sephadexlh-20凝膠柱層析洗脫液為丙酮,制備高效液相色譜條件為體積比3:2的乙腈–水,流速為3ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm。
一種別異歐前胡內(nèi)酯衍生物的應(yīng)用,所述式(一)所示別異歐前胡內(nèi)酯衍生物可用于防治蘋果病害的活性先導(dǎo)化合物或新農(nóng)藥成分的制備。
所述蘋果病害為蘋果腐爛病菌、蘋果輪紋病菌或蘋果炭疽病菌。
本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn):式(一)所示別異歐前胡內(nèi)酯衍生物對(duì)蘋果腐爛病菌、蘋果輪紋病菌與蘋果炭疽病菌等蘋果主要病害具有較好抑制活性,最小抑制濃度分別為0.256、0.128與0.128mg/ml,可以用于防治蘋果病害的活性先導(dǎo)化合物或新農(nóng)藥成分的制備;式(一)所示別異歐前胡內(nèi)酯衍生物由羌活notopterygiumincisumtingexh.chang的干燥根莖經(jīng)提取、分離得到,作為植物源天然產(chǎn)物,具有不易產(chǎn)生抗藥性、對(duì)非靶標(biāo)生物安全、環(huán)境相容性好等優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施方式
為闡明對(duì)本發(fā)明特征的理解,下面結(jié)合一些非限定性的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述。
實(shí)施例1:別異歐前胡內(nèi)酯衍生物如式(一)所示(結(jié)構(gòu)中的阿拉伯?dāng)?shù)字為碳原子的標(biāo)位)。
實(shí)施例2:別異歐前胡內(nèi)酯衍生物的制備
1)分離純化
取羌活notopterygiumincisumtingexh.chang的干燥根莖,粉碎,過20目篩,并經(jīng)乙酸乙酯超聲提取3次,合并提取液,減壓蒸餾得到提取浸膏。將其進(jìn)行硅膠vlc(vacuumliquidchromatography)快速柱層析,按照洗脫液極性遞增順序,以體積比80:1至1:1的石油醚—乙酸乙酯(流速為120ml/min),體積比40:1至1:1的氯仿—甲醇(流速為120ml/min)進(jìn)行梯度洗脫。收集洗脫液,并經(jīng)薄層層析檢測(cè),檢測(cè)時(shí)以茴香醛-濃硫酸作為顯色劑,根據(jù)rf值以及顯色情況來合并相同或類似部分。收集石油醚—乙酸乙酯體積比1:1梯度的洗脫組分,將收集的組分進(jìn)行反相硅膠柱層析,以體積比1:9至1:0的甲醇—水(流速為5ml/min)依次進(jìn)行梯度洗脫,收集體積比為4:1的甲醇—水洗脫組分。該組分經(jīng)凝膠柱層析,以丙酮為洗脫溶液(流速為1ml/min),最后經(jīng)制備高效液相色譜分離純化(色譜條件為體積比3:2的乙腈—水,流速3ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)230nm),收集保留時(shí)間tr值為15.3min的組分,即得式(一)所示別異歐前胡內(nèi)酯衍生物。
2)結(jié)構(gòu)鑒定
式(一)所示別異歐前胡內(nèi)酯衍生物,淡黃色晶體,hresimsm/z359.1155[m+na]+,提示分子式為c21h20o4,其1h-和13c-nmr數(shù)據(jù)見表1。
實(shí)施例3:抑菌活性試驗(yàn)
采用微量稀釋法,測(cè)定式(一)所示化合物對(duì)蘋果腐爛病菌、蘋果輪紋病菌與蘋果炭疽病菌的抑菌活性(《從天然產(chǎn)物到新農(nóng)藥創(chuàng)制-原理方法》,吳文君,2006,化學(xué)工業(yè)出版社)。
1)菌懸液的制備
將供試真菌接種于pda培養(yǎng)基表面于28℃培養(yǎng)72h后,吸取2ml無菌0.85%nacl溶液(含0.25%吐溫-20)洗滌培養(yǎng)物,并用玻璃刮刀將菌落輕輕刮下。吸取適量菌懸液于無菌試管中,調(diào)至0.5麥?zhǔn)媳葷幔ㄏ喈?dāng)于1.5×108cfu/ml)備用。
2)樣品的配制
取1mg待測(cè)樣品(式(一)所示化合物),溶解于100μl50%dmso中,充分混勻后,吸取50μl樣品溶液到另一只離心管中,接著加入50μl50%dmso,得到濃度減半的樣品溶液。按照此方法,得到6組濃度依次減半的樣品溶液。
3)mic測(cè)定方法
(1)采用無菌操作,將倍比稀釋后不同濃度的樣品溶液分別加到無菌的96孔聚苯乙烯板中,第1至第6孔各加5μl的樣品溶液,并以不加樣品孔作為空白對(duì)照,加5μl50%dmso溶液孔為溶劑對(duì)照。
(2)將相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)媳葷岫鹊闹甘揪鷳乙?,?jīng)pdb培養(yǎng)基稀釋1000倍后,取95μl依次加入到96孔板中,使得第1至第6孔的樣品濃度依次為512、256、128、64、32、16μg/ml。以上所有樣品均重復(fù)三次。輕輕震蕩混勻后,將96孔板密封置于28℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。
(3)在600nm波長(zhǎng)下使用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔的吸光值,以在小孔內(nèi)完全抑制指示菌生長(zhǎng)的最低樣品濃度為該化合物的mic。(注意:當(dāng)陰性對(duì)照孔內(nèi)指示菌明顯生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)才有意義;當(dāng)實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)單一的跳孔時(shí),應(yīng)記錄抑制菌株生長(zhǎng)的最高藥物濃度;如出現(xiàn)多處跳孔,則不應(yīng)報(bào)告結(jié)果,需重復(fù)實(shí)驗(yàn)。)
試驗(yàn)結(jié)果為:式(一)所示化合物對(duì)蘋果腐爛病菌、蘋果輪紋病菌與蘋果炭疽病菌等蘋果主要病害具有較好抑制活性,最小抑制濃度分別為0.256、0.128與0.128mg/ml,具有較好抑菌活性。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明本發(fā)明所涉及的化合物具有較好抑菌活性,可以用于防治蘋果病害的活性先導(dǎo)化合物或新農(nóng)藥成分的制備。