本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種mirna-1268b作為肺癌診斷標(biāo)志物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
通過(guò)基因芯片、高通量測(cè)序法和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qrt-pcr)等方法發(fā)現(xiàn)血液循環(huán)中的mirna對(duì)nsclc的診斷有較高價(jià)值。其中roth等發(fā)現(xiàn)血液中的mir-361-3p和mir-625有助于從良性肺部病變中識(shí)別惡性肺癌。而血液中mir-21的上調(diào)是診斷肺鱗狀細(xì)胞癌的可靠生物學(xué)標(biāo)志，肺腺癌患者血液中mir-200b-5p、mir-502-5p、mir-629、mir-17和mir-100較肺部肉芽腫患者和健康吸煙者明顯增高。此外，rodriguez等發(fā)現(xiàn)肺部腫瘤患者血液中外泌體含有的mir-122-5p等mirna含量明顯高于支氣管肺泡灌洗液。munagala等發(fā)現(xiàn)肺癌外泌體中mir-21和mir-155升高對(duì)于肺癌復(fù)發(fā)診斷是潛在的生物學(xué)標(biāo)志。
微小rna(microrna，mirna)作為一種在某些腫瘤中異常表達(dá)的非編碼的小rna，可以作為腫瘤診斷和預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物。然而，由于依靠組織活檢來(lái)取得腫瘤組織再分析其mirna的方法具有創(chuàng)傷性，因此限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用。外泌體(exosomes)是一種直徑在50-90nm的亞細(xì)胞雙層膜顆粒，其中含有mirna，且腫瘤在生長(zhǎng)過(guò)程中還會(huì)不斷地將外泌體釋放到周圍環(huán)境中去，因此檢測(cè)體液外泌體及外泌體rna有助于腫瘤診斷和預(yù)后判斷。taylor等首先提出通過(guò)檢測(cè)血液外泌體mirna來(lái)診斷卵巢癌，并進(jìn)一步用于判斷預(yù)后。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供檢測(cè)待測(cè)樣本外泌體中mirna-1268b表達(dá)量的物質(zhì)的用途。
本發(fā)明提供了檢測(cè)待測(cè)樣本外泌體中mirna-1268b表達(dá)量的物質(zhì)在制備診斷或輔助診斷所述待測(cè)樣本是否肺癌樣本的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了檢測(cè)待測(cè)樣本外泌體中mirna-1268b表達(dá)量的物質(zhì)在制備篩查或輔助篩查所述待測(cè)樣本是否肺癌樣本的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
上述應(yīng)用中，所述待測(cè)樣本為離體血清。
所述表達(dá)量為相對(duì)表達(dá)量，為相對(duì)于內(nèi)參基因的表達(dá)量，內(nèi)參基因?yàn)閞nu6b。
上述應(yīng)用中，所述檢測(cè)待測(cè)樣本外泌體中mirna-1268b表達(dá)量的物質(zhì)包括用于擴(kuò)增mirna-1268b的引物對(duì)。
若mirna-1268b在待測(cè)樣本外泌體中的表達(dá)顯著高于在非肺癌樣本中的表達(dá)，則待測(cè)樣本為或候選為肺癌樣本，反之，則不為或候選不為。
本發(fā)明還提供了檢測(cè)待測(cè)人血清外泌體中mirna-1268b表達(dá)量的物質(zhì)在制備診斷或輔助診斷所述待測(cè)人是否肺癌患者的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了檢測(cè)待測(cè)人血清外泌體中mirna-1268b表達(dá)量的物質(zhì)在制備篩查或輔助篩查所述待測(cè)人是否肺癌患者的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
上述應(yīng)用中，所述檢測(cè)待測(cè)人血清外泌體中mirna-1268b表達(dá)量的物質(zhì)包括用于擴(kuò)增mirna-1268b的引物對(duì)。
上述應(yīng)用中，所述引物對(duì)由序列表中序列1所示的單鏈dna分子和序列表中序列2所示的單鏈dna分子組成。
上述血清為離體血清。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種產(chǎn)品。
本發(fā)明提供的產(chǎn)品，為上述檢測(cè)待測(cè)樣本外泌體中mirna-1268b表達(dá)量的物質(zhì)或所述檢測(cè)待測(cè)人血清外泌體中mirna-1268b表達(dá)量的物質(zhì)。
上述產(chǎn)品為如下1)-4)中任意一種：
1)診斷或輔助診斷所述待測(cè)樣本是否肺癌樣本的產(chǎn)品；
2)篩查或輔助篩查所述待測(cè)樣本是否肺癌樣本的產(chǎn)品；
3)診斷或輔助診斷所述待測(cè)人是否肺癌患者的產(chǎn)品；
4)篩查或輔助篩查所述待測(cè)人是否肺癌患者的產(chǎn)品。
mirna-1268b作為肺癌診斷標(biāo)記物中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
本發(fā)明為了建立利用外泌體進(jìn)行肺癌診斷和預(yù)后判斷生物標(biāo)志物的方法，采用永生化的人支氣管上皮細(xì)胞bep2d及α粒子輻射誘發(fā)該細(xì)胞發(fā)生癌變的細(xì)胞系berp35t44-1，分離外泌體，并利用mirna芯片技術(shù)獲得了在癌變細(xì)胞系berp35t44-1細(xì)胞外泌體中表達(dá)明顯增高的mirna，通過(guò)在肺癌細(xì)胞系a549致癌小鼠血液外泌體的驗(yàn)證，確定了mirna-1268b有望成為臨床肺癌診斷的生物標(biāo)志物。進(jìn)一步在31例臨床肺癌病人的血清中進(jìn)行了檢測(cè)，與正常人群相比，mirna-1268b表達(dá)均顯著增高。mirna-1268b為臨床肺癌診斷奠定基礎(chǔ)，可用于制備診斷試劑盒。
附圖說(shuō)明
圖1為mir-1268b在人肺癌血清中高表達(dá)。
具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
實(shí)施例1、與肺癌細(xì)胞相關(guān)的mirna的發(fā)現(xiàn)
永生化的人支氣管上皮細(xì)胞bep2d記載在如下文獻(xiàn)中：、樓鐵柱、項(xiàng)曉瓊、吳德昌.238puα粒子誘發(fā)人支氣管上皮細(xì)胞bep2d轉(zhuǎn)化的初步研究.中國(guó)肺癌雜志，2000，3(6)：428-431.2；
腫瘤細(xì)胞berp35t44-1具有較高的血清抗性，較強(qiáng)的錨著獨(dú)立生長(zhǎng)能力，較快的增殖速度，且具有一定的遷移能力，記載在如下文獻(xiàn)中：α粒子輻射誘發(fā)人支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化成瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性研究；胡迎春；軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，2003年中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院的碩士論文。
1.細(xì)胞培養(yǎng)：bep2d細(xì)胞和berp35t44-1細(xì)胞培養(yǎng)于lhc-8無(wú)血清培養(yǎng)基中，置37c、5％co培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。
2.外泌體的提?。菏杖?07生長(zhǎng)狀態(tài)良好的bep2d及berp35t44-1細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用多步差速離心法分離外泌體：4℃，300g離心10分鐘去除細(xì)胞；4℃，2000g離心20分鐘和4℃，10000g離心30分鐘去除細(xì)胞碎片；最后，4℃，100000g超速離心60分鐘所獲得的沉淀即為外泌體。
3.外泌體的電鏡分析：向外泌體沉淀中加入1mlpbs，吹打溶解后取20μl滴加于載樣銅網(wǎng)上，室溫靜置1分鐘，用濾紙從側(cè)面吸干液體，再滴加2％磷鎢酸溶液(ph6.8)30μl于銅網(wǎng)上，室溫負(fù)染1分鐘。濾紙吸干負(fù)染液，白熾燈下烤2分鐘，透射電鏡下觀察照相。
4.外泌體rna的提?。合蛲饷隗w沉淀中加入500μltrizol試劑(美國(guó)invitrogen公司)提取總rna，得到bep2d細(xì)胞外泌體rna和berp35t44-1細(xì)胞外泌體rna。
用超微量分光光度計(jì)測(cè)定總rna濃度。以a260nm/a280nm比值評(píng)估純度。為了確定提取出的總rna中有mirna存在，選用rnu6b為內(nèi)參，利用實(shí)時(shí)熒光定量pcr的方法對(duì)總rna中的mirna進(jìn)行檢測(cè)。
5.mirna芯片實(shí)驗(yàn)：bep2d、berp35t44-1兩種細(xì)胞的外泌體，共2個(gè)總rna樣品進(jìn)行mirna芯片實(shí)驗(yàn)。mirna芯片實(shí)驗(yàn)由lcsciences公司采用人的lcsciencesmicrornamicroarray-single基因表達(dá)譜芯片完成。
用人的lcsciencesmicrornamicroarray-single基因表達(dá)譜芯片(由杭州聯(lián)川生物信息技術(shù)有限公司提供)檢測(cè)bep2d細(xì)胞外泌體rna和berp35t44-1細(xì)胞外泌體rna，經(jīng)檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)rna質(zhì)量完好，進(jìn)行標(biāo)記雜交試驗(yàn)。雜交芯片經(jīng)掃描儀掃描，數(shù)據(jù)信號(hào)提取，lowess過(guò)濾進(jìn)行歸一化處理以及差異表達(dá)分析等。得到人支氣管上皮細(xì)胞bep2d外泌體基因表達(dá)譜和腫瘤細(xì)胞berp35t44-1外泌體基因表達(dá)譜。
比較兩個(gè)基因表達(dá)譜，結(jié)果，與人支氣管上皮細(xì)胞bep2d基因表達(dá)譜相比，腫瘤細(xì)胞berp35t44-1基因表達(dá)譜表達(dá)上調(diào)的mirna有140個(gè)，表達(dá)下調(diào)的mirna有169個(gè)。
從上調(diào)mirna中選擇mirna-1268b：
mirna-1268b的核苷酸序列(5’端到3’端)：cgggcgugguggugggggug；進(jìn)行qpcr驗(yàn)證，具體如下：
分別將bep2d細(xì)胞外泌體rna和berp35t44-1細(xì)胞外泌體rna反轉(zhuǎn)錄得到cdna作為模板，用引物(表1所示的序列)進(jìn)行qpcr，結(jié)果如表2所示，可以看出，與bep2d細(xì)胞相比，mirna-1268b在berp35t44-1細(xì)胞外泌體中表達(dá)增高(表2)。
表1實(shí)時(shí)熒光定量pcr引物序列
qpcr具體條件：
反轉(zhuǎn)錄體系為：①在3μl的反應(yīng)體系中加入總rna200ng、特異性引物(2μm)0.5μl，65℃孵育10min，冰浴3min；②再加入5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液1μl、反轉(zhuǎn)錄混合液(invitrogen公司)0.4μl、無(wú)rna酶水0.6μl至總體積為5μl。反轉(zhuǎn)錄條件為：42℃，15min；85℃，5sec；4℃，保存。
實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)體系包括：①cdna，0.5μl；②2×sybrgreenmix，10μl；③引物混合物(10μm)，0.8μl；④無(wú)rna酶水8.7μl至總體積為20μl。反應(yīng)條件：50℃，2min；95℃，2min；95℃，15sec；60℃，30sec；共40個(gè)循環(huán)。用rnu6b做為內(nèi)參照基因，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以2-△△ct表示。
表2實(shí)時(shí)熒光定量pcr驗(yàn)證結(jié)果
實(shí)施例2、mirna-1268b在a549成瘤裸鼠血清外泌體中高表達(dá)
1.動(dòng)物模型：肺癌細(xì)胞a549(
2.血清收集：采用眼眶取血的方法收集成瘤小鼠及對(duì)照裸鼠的全血并分離血清。
3.qpcr檢測(cè)mirna-1268b的表達(dá)
分別提取成瘤小鼠血清和對(duì)照裸鼠血清外泌體的rna反轉(zhuǎn)錄得到cdna作為模板，qpcr檢測(cè)方法與實(shí)施例1相同，結(jié)果如表3所示，可以看出，與對(duì)照裸鼠相比，mirna-1268b均在成瘤裸鼠血清中表達(dá)上調(diào)。
表3為mirna在成瘤裸鼠血清中表達(dá)情況
因此，mirna-1268b的表達(dá)情況可以作為肺癌診斷的輔助標(biāo)準(zhǔn)，若mirna-1268b待測(cè)樣本外泌體中的表達(dá)顯著高于(變化倍數(shù)大于為2即為顯著升高，本實(shí)驗(yàn)中變化倍數(shù)為5.1)非肺癌樣本，則待測(cè)樣本為或候選為肺癌樣本，反之，則不為或候選不為。
實(shí)施例3、mirna-1268b的表達(dá)量在診斷肺癌患者中的應(yīng)用
一、提取rna
肺癌患者血清來(lái)源：肺癌患者血清全部由解放軍總醫(yī)院提供，均為首診肺癌，患者尚未接受過(guò)任何包括手術(shù)及放化療等治療。診斷明確，病理清楚。
正常對(duì)照血清來(lái)源：正常對(duì)照血清全部由解放軍總醫(yī)院體檢中心提供，均為健康人群常規(guī)查體獲得。
分別提取肺癌患者血清外泌體rna和正常對(duì)照血清外泌體的rna。
二、qpcr檢測(cè)
將上述肺癌患者血清外泌體rna和正常對(duì)照血清外泌體rna作為模板，用實(shí)施例1的qpcr檢測(cè)方法檢測(cè)mirna-1268b在不同樣本的表達(dá)。
結(jié)果如表4所示，可以看出，與正常對(duì)照血清相比，31例肺癌患者血清中的mirna-1268b表達(dá)量均上調(diào)，且顯著提高。
表4為各樣本中目的基因的表達(dá)量(相對(duì)于rnu6b的相對(duì)表達(dá)量)
用grampad軟件表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果如圖1所示。
用sas軟件對(duì)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果如下表5-6所示：
表5為31例肺癌病人組mirna-1268b結(jié)果
表6為5例正常對(duì)照組mirna-1268b結(jié)果
不滿足正態(tài)性，本例采用成組設(shè)計(jì)定量資料的秩和檢驗(yàn)：z＝-3.4307，p＝0.0006，兩組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
序列表
<110>中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所
<120>mirna-1268b作為肺癌診斷標(biāo)志物的應(yīng)用
<160>2
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>17
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
caacgggcgtggtggtg17
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
cagtgcagggtccgaggtat20