本發(fā)明涉及動物多糖提取分離技術領域，具體地，涉及一種魚鰾糖胺聚糖的提取方法及其應用。

背景技術：

魚鰾，又稱魚肚或魚泡，為膠質囊狀物，是魚游泳時的水中深淺位置調節(jié)器。在我國漢代就有魚鰾作為藥材的記載，唐朝時期，魚鰾已作為貢品之一，并與燕窩、魚翅齊名，素有“海洋人參”之譽。中醫(yī)認為魚鰾具有滋陰養(yǎng)血、補腎固精、嫩膚養(yǎng)顏、抗癌等功效。我國作為世界水產第一大國，擁有豐富的魚鰾資源，但目前缺乏對魚鰾中功效因子的研究與開發(fā)。

前人研究表明魚鰾的主要營養(yǎng)成份為高級膠原蛋白、糖胺聚糖和多種維生素及鈣、鋅、鐵、硒等多種微量元素，其中糖胺聚糖含量豐富，約占魚鰾干重的8.9%。目前，國內外對魚鰾的研究主要集中在營養(yǎng)成分分析及膠原蛋白提取等方面，對魚鰾中糖胺聚糖的分離提取及其性質研究未見報道。糖胺聚糖作為海洋生物中含量豐富的生物活性物質，已經發(fā)現(xiàn)其在抗癌、抗腫瘤、抗病毒、抗血栓等方面表現(xiàn)較強的活性，展現(xiàn)出良好的應用開發(fā)前景，有望成為新型的海洋藥物和功能性保健食品的原料來源。

因此，研究一種魚鰾糖胺聚糖的提取方法具有重大意義。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種魚鰾糖胺聚糖的提取方法，本發(fā)明采用酶解法提取魚鰾糖胺聚糖，提取率較高，提取工藝流程簡單、快速高效、成本較低。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述提取方法提取得到的魚鰾糖胺聚糖作為吸濕劑或保濕劑在功能食品或化妝品中的應用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

一種魚鰾糖胺聚糖的提取方法，所述提取方法包括如下步驟：

s1：酶法提取

將魚鰾干燥粉碎后加水和酶，于ph為7～9、溫度為40～60℃的條件下提取3～5h；然后滅酶活，離心取上清液即為糖胺聚糖提取液；

s2：乙醇沉淀

濃縮s1所得提取液，然后加入乙醇至體積分數(shù)為50～70%，攪拌并靜置；

s3：sevag法脫蛋白

取s2靜置后所得沉淀加水溶解得糖胺聚糖溶液，離心去沉淀；然后將糖胺聚糖溶液與sevag試劑混合并劇烈振搖，離心脫蛋白并用水透析；

s4：二次沉淀

濃縮s3透析后所得糖胺聚糖溶液，加入乙醇至體積分數(shù)為50～70%，攪拌并靜置；

s5：有機溶劑洗滌

將s4所得沉淀用有機溶劑洗滌，冷凍干燥后即得精制糖胺聚糖。

本發(fā)明以魚鰾為原料，采用酶法提取糖胺聚糖，并對其提取工藝進行優(yōu)化，提高糖胺聚糖的提取率。本發(fā)明提供的方法工藝流程簡單、快速高效、成本較低、所用原料魚鰾來源豐富，具有較高的藥食兩用價值并且安全性高。本發(fā)明提供的方法提取得到的糖胺聚糖中的成分以硫酸皮膚素化合物為主，含有少量的肝素，魚鰾糖胺聚糖具有良好的吸濕保濕作用，可以將其應用于具有保濕功效的功能食品或化妝品中。

優(yōu)選地，s1中，所述酶為胰蛋白酶和枯草中性蛋白酶的混合物。

優(yōu)選地，s1中，所述胰蛋白酶和枯草中性蛋白酶的質量比為3:5。

優(yōu)選地，s1中，所述酶的質量分數(shù)為4～8%。

優(yōu)選地，s1中，所述魚鰾和水的料液比為1:10～30。

在本發(fā)明的s1中，酶解結束后于80～100℃的水浴中加熱5～20min滅酶活，并于5000r/min轉速下離心10～30min。

優(yōu)選地，s2中，將s1所得提取液濃縮至原始體積的1/2～1/10。

優(yōu)選地，s2和s4中，所述靜置為于4℃靜置1～3天。

優(yōu)選地，s2中攪拌時間為20min。

優(yōu)選地，s3中，所述糖胺聚糖溶液的質量分數(shù)為1～3%。

優(yōu)選地，s3中，所述糖胺聚糖溶液和sevag試劑的體積比為3～5:1。

在本發(fā)明中，所述sevag試劑為氯仿和正丁醇按照體積比為3～5:1的比例混合所得。

在本發(fā)明的s3中，所述劇烈振搖的時間為20min；所述離心的條件為3600r/min，離心10min；所述透析時間為48h。

優(yōu)選地，s4中，濃縮糖胺聚糖溶液至原始體積的1/5～1/10。

在本發(fā)明的s5中，所述有機溶劑為無水乙醇和/或丙酮，洗滌2次。

上述提取方法提取得到的魚鰾糖胺聚糖作為吸濕劑或保濕劑在功能食品或化妝品中的應用。經測試，本發(fā)明提取得到的魚鰾糖胺聚糖的吸濕性能優(yōu)于殼聚糖、海藻酸鈉，保濕性能和丙三醇、殼聚糖、海藻酸鈉相當，可以將其應用于具有保濕功效的功能食品或化妝品中。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明以魚鰾為原料，采用酶法提取糖胺聚糖，并對其提取工藝進行優(yōu)化，提高糖胺聚糖的提取率。本發(fā)明提供的方法所用原料魚鰾來源豐富，具有較高的藥食兩用價值并且安全性高。本發(fā)明提供的方法提取得到的糖胺聚糖中的成分以硫酸皮膚素化合物為主，含有少量的肝素，魚鰾糖胺聚糖具有良好的吸濕保濕作用，經測試，本發(fā)明提取得到的魚鰾糖胺聚糖的吸濕性能優(yōu)于殼聚糖、海藻酸鈉，保濕性能和丙三醇、殼聚糖、海藻酸鈉相當；可以將其應用于具有保濕功效的功能食品或化妝品中。本發(fā)明提供的方法工藝流程簡單、快速高效、成本較低，具有較大的推廣應用價值。

附圖說明

圖1為實施例1提供的相對濕度為43%時魚鰾糖胺聚糖組分和常規(guī)保濕劑的吸濕率對比圖；

圖2為實施例1提供的相對濕度為81%時魚鰾糖胺聚糖組分和常規(guī)保濕劑的吸濕率對比圖；

圖3為實施例1提供的魚鰾糖胺聚糖組分和常規(guī)保濕劑的保濕率對比圖；

圖4為實施例1提供的魚鰾糖胺聚糖組分的傅立葉紅外吸收光譜圖；

圖5為實施例1提供的魚鰾糖胺聚糖組分的醋酸纖維素薄膜電泳圖。

具體實施方式

下面結合具體說明書附圖和實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下例實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照本領域常規(guī)條件或按照制造廠商建議的條件。本領域的技術人員在本發(fā)明的基礎上所做的任何非實質性的變化及替換均屬于本發(fā)明所要求保護的范圍。

實施例1魚鰾糖胺聚糖的提取

稱取已粉碎的魚鰾粉100g，加入1l蒸餾水，總酶的添加量為1%（胰蛋白酶和枯草中性蛋白酶比例為3:5），酶解ph8、溫度50℃、提取時間4h，酶解結束后在100℃水浴中加熱10min滅酶活，離心（5000r/min，20min）取上清液即為糖胺聚糖提取液；將提取液濃縮至原始體積的1/3后，緩慢加入乙醇至體積分數(shù)為60%，持續(xù)攪拌20min后置于4℃靜置24h；取沉淀，用蒸餾水配置成質量分數(shù)為3%的糖胺聚糖溶液，離心（6000r/min，10min）去沉淀，用氯仿：正丁醇=4:1混合物，按糖胺聚糖溶液：sevage試劑=4:1的比例劇烈振搖20min，離心（3600r/min，10min）脫蛋白，蒸餾水透析48h；將透析后的溶液濃縮至原始體積的1/10，加入乙醇至體積分數(shù)為60%，持續(xù)攪拌20min后置于4℃靜置1天；將二次醇沉得到的沉淀用無水乙醇和丙酮分別交替洗滌2次后冷凍干燥，得到糖胺聚糖吸濕保濕劑。

實施例2魚鰾糖胺聚糖的提取

稱取已粉碎的魚鰾粉100g，加入2l蒸餾水，總酶的添加量為6%（胰蛋白酶和枯草中性蛋白酶比例為3:5），酶解ph8、溫度60℃、提取時間4h，酶解結束后在100℃水浴中加熱10min滅酶活，離心（5000r/min，20min）取上清液即為糖胺聚糖提取液；將提取液濃縮至原始體積的1/3后，緩慢加入乙醇至體積分數(shù)為60%，持續(xù)攪拌20min后置于4℃靜置24h；取沉淀，用蒸餾水配置成質量分數(shù)為3%的糖胺聚糖溶液，離心（6000r/min，10min）去沉淀，用氯仿：正丁醇=4:1混合物，按糖胺聚糖溶液：sevage試劑=4:1的比例劇烈振搖20min，離心（3600r/min，10min）脫蛋白，蒸餾水透析48h；將透析后的溶液濃縮至原始體積的1/10，加入乙醇至體積分數(shù)為60%，持續(xù)攪拌20min后置于4℃靜置1天；將二次醇沉得到的沉淀用無水乙醇和丙酮分別交替洗滌2次后冷凍干燥，得到糖胺聚糖吸濕保濕劑。

實施例3魚鰾糖胺聚糖的提取

稱取已粉碎的魚鰾粉100g，加入2l蒸餾水，總酶的添加量為7%（胰蛋白酶和枯草中性蛋白酶比例為3:5），酶解ph7.5、溫度50℃、提取時間4h，酶解結束后在100℃水浴中加熱10min滅酶活，離心（5000r/min，20min）取上清液即為糖胺聚糖提取液；將提取液濃縮至原始體積的1/3后，緩慢加入乙醇至體積分數(shù)為60%，持續(xù)攪拌20min后置于4℃靜置24h；取沉淀，用蒸餾水配置成質量分數(shù)為3%的糖胺聚糖溶液，離心（6000r/min，10min）去沉淀，用氯仿：正丁醇=4:1混合物，按糖胺聚糖溶液：sevage試劑=4:1的比例劇烈振搖20min，離心（3600r/min，10min）脫蛋白，蒸餾水透析48h；將透析后的溶液濃縮至原始體積的1/10，加入乙醇至體積分數(shù)為60%，持續(xù)攪拌20min后置于4℃靜置1天；將二次醇沉得到的沉淀用無水乙醇和丙酮分別交替洗滌2次后冷凍干燥，得到糖胺聚糖吸濕保濕劑。

實施例4魚鰾糖胺聚糖的提取

稱取已粉碎的魚鰾粉100g，加入2l蒸餾水，總酶的添加量為6%（胰蛋白酶和枯草中性蛋白酶比例為3:5），酶解ph8.5、溫度55℃、提取時間4h，酶解結束后在100℃水浴中加熱10min滅酶活，離心（5000r/min，20min）取上清液即為糖胺聚糖提取液；將提取液濃縮至原始體積的1/3后，緩慢加入乙醇至體積分數(shù)為60%，持續(xù)攪拌20min后置于4℃靜置24h；取沉淀，用蒸餾水配置成質量分數(shù)為3%的糖胺聚糖溶液，離心（6000r/min，10min）去沉淀，用氯仿：正丁醇=4:1混合物，按糖胺聚糖溶液：sevage試劑=4:1的比例劇烈振搖20min，離心（3600r/min，10min）脫蛋白，蒸餾水透析48h；將透析后的溶液濃縮至原始體積的1/10，加入乙醇至體積分數(shù)為60%，持續(xù)攪拌20min后置于4℃靜置1天；將二次醇沉得到的沉淀用無水乙醇和丙酮分別交替洗滌2次后冷凍干燥，得到糖胺聚糖吸濕保濕劑。

采用阿利新藍法測試并計算上述各實施例提取得到的糖胺聚糖的提取率，提取方法如下，提取結果見下表1。

準確稱取0.10g肝素鈉標準品，用蒸餾水定容至100ml，配制成1mg/ml的肝素鈉標準溶液。向15%h3po4與2%h2so4的混合溶液中加入0.110g阿利新藍，充分溶解后定容至100ml。

分別吸取0、20、40、60、80、100μl肝素鈉標準溶液于試管中，補水至100ul，加入1.5ml阿利新藍染色液進行染色，室溫靜置10min，在波長490nm處比色測定吸光度，得到標準曲線回

歸方程為：y=0.002x-0.0011，r²=0.9999；y為吸光度，x為肝素鈉含量/（μg/ml）。

魚鰾糖胺聚糖提取率的公式如下所示：

魚鰾糖胺聚糖提取率=100×糖胺聚糖質量（g）/魚鰾粉質量（g）

表1實施例1～4的提取方法提取的糖胺聚糖的提取率

性能測試

（1）魚鰾糖胺聚糖的吸濕保濕性能測試

對上述各實施例提取得到的糖胺聚糖的吸濕保濕性能進行測試并評價，旨在為魚鰾糖胺聚糖作為天然保濕因子應用于功能食品和化妝品中提供一定的理論依據(jù)。

①魚鰾糖胺聚糖的吸濕性能測試

魚鰾糖胺聚糖的吸濕性測定在恒溫恒濕條件下進行，具體測試方法如下：

將碳酸鉀飽和溶液和硫酸銨飽和溶液分別置于干燥器內，控制環(huán)境溫度為20℃，制成相對濕度分別為43%和81%的環(huán)境。將魚鰾糖胺聚糖、海藻酸鈉、殼聚糖及數(shù)個規(guī)格相同的稱量瓶在50℃條件下干燥至質量恒定。精確稱取0.1g樣品置于在稱量瓶中，以丙三醇、殼聚糖、海藻酸鈉為對照，將稱量瓶敞口放置在相對濕度分別為43%和81%的干燥器中，密封干燥器，放置3、6、12、24、36、48、60、72h后稱量其質量變化。測試結果分別見圖1和圖2。

吸濕率的計算公式如下：

吸濕率=100×（mt-m0）/mt，

式中：m0為吸濕前各樣品的質量/g；

mt為吸濕不同時間后各樣品的質量/g。

②魚鰾糖胺聚糖的保濕性能測試

魚鰾糖胺聚糖的保濕性測定選定在恒溫的干燥環(huán)境下進行，具體方法如下：

控制環(huán)境溫度為20℃，在干燥器底部加入200g變色硅膠。將多糖、對照品及數(shù)個規(guī)格為20ml的小燒杯置于干燥箱中，50℃干燥至質量恒定。準確稱取魚鰾糖胺聚糖、丙三醇、海藻酸鈉、殼聚糖各0.1g，分別加水10ml配制成質量濃度為1mg/ml的溶液。配制完成的溶液均敞口置于恒溫密閉硅膠干燥器中，放置4、12、24、36、48、60、72、84、96h后稱量其質量變化。測試結果見圖3。

保濕率=100×mt/m0，

式中：m0為吸濕前各樣品的質量/g；

mt為吸濕不同時間后各樣品的質量/g。

經測試，本發(fā)明提取得到的魚鰾糖胺聚糖的吸濕性能優(yōu)于殼聚糖、海藻酸鈉，保濕性能和丙三醇、殼聚糖、海藻酸鈉相當。

（2）紅外光譜法分析魚鰾糖胺聚糖的結構

魚鰾糖胺聚糖保濕吸濕劑的紅外掃描光譜見圖4，魚鰾糖胺聚糖在3406.223cm^-1處出現(xiàn)較寬的峰，說明存在糖類的-oh；在2920.171cm^-1處出現(xiàn)中等強度吸收峰是由-ch3的c-h對稱伸縮振動產生的；在2850cm^-1處出現(xiàn)弱的吸收峰是由-ch3的c-h反對稱伸縮振動產生的；1652.963cm^-1處有吸收，說明存在酰胺基的c=o伸縮振動；在1413.795cm^-1處的小峰是由糖類的c-h變角振動產生的；在1226.703cm^-1處出現(xiàn)的弱吸收峰是由磺?；膕=o伸縮振動引起的，以上符合糖胺聚糖的特征。另外，1045.298cm^-1處出現(xiàn)強的吸收峰是吡喃糖環(huán)中的醚鍵的伸縮振動和o-h鍵的變角彎曲引起的；840.9475cm^-1處出現(xiàn)吸收峰，890-900cm^-1區(qū)段無明顯吸收，表明魚鰾糖胺聚糖以α型吡喃糖苷為主。

本發(fā)明所得到的從魚鰾中提取的吸濕保濕劑和硫酸皮膚素標準品的紅外吸收光譜圖基本吻合（可參看《魚皮硫酸皮膚素的提取、純化、結構和活性研究》；2008；廖文娟），故認定該本發(fā)明提取物主要以硫酸皮膚素類化合物為主。

（3）醋酸纖維素薄膜電泳

將純化后的魚鰾糖胺聚糖以及肝素（hp）、硫酸皮膚素（ds）標準品分別配置成3mg/ml水溶液。醋酸纖維素薄膜置于0.1mol/l吡啶-0.47mol/l甲酸（ph3.0）緩沖液浸泡30min后，點樣，在7ma電流下電泳20min，將薄膜浸泡在0.5%（質量分數(shù)）阿爾新藍醋酸溶液中染色20min，再以2%醋酸溶液脫色30min。

圖5為實施例1提供的魚鰾糖胺聚糖組分的醋酸纖維素薄膜電泳圖，左圖的條帶是魚鰾糖胺聚糖的條帶圖，右圖是肝素和硫酸皮膚素的條帶圖，其中肝素在上，硫酸皮膚素在下。由圖5可以看出，魚鰾糖胺聚糖中主要以硫酸皮膚素為主，含有少量的肝素，在硫酸皮膚素的條帶下面還有一條淺色的條帶，需要進一步研究；這和魚鰾糖胺聚糖紅外光譜的結果是一樣的，說明魚鰾糖胺聚糖確實以硫酸皮膚素為主要種類。