本發(fā)明涉及對蝦肝腸胞蟲，尤其是涉及對蝦肝腸胞蟲海藻糖-6-磷酸合成酶基因的檢測與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

對蝦肝腸胞蟲(enterocytozoonhepatopenaei，ehp)又稱腸胞蟲，是近年來發(fā)現(xiàn)于對蝦中的微孢子蟲，主要感染凡納濱對蝦(litopenaeusvannamei)、斑節(jié)對蝦(penaeusmonodon)等重要養(yǎng)殖蝦類^[1]。它于2009年在泰國養(yǎng)殖的生長緩慢的斑節(jié)對蝦(penaeusmonodon)中首次被分離和命名^[2]。

近年，在我國浙江、廣東、福建等多省的對蝦苗種和養(yǎng)殖蝦中檢測到較高的ehp陽性蝦，且檢出率逐年增加^[3]。對蝦感染對蝦肝腸胞蟲后一般不出現(xiàn)立即死亡，蝦可正常攝食，體色、腸、胃均明顯異常，個(gè)別感染蝦可出現(xiàn)白便，使得該病很難早期發(fā)現(xiàn)。通常養(yǎng)殖30～45天以上才可發(fā)現(xiàn)生長緩慢，嚴(yán)重影響了對蝦的養(yǎng)殖生產(chǎn)，且造成該病這幾年在對蝦養(yǎng)殖地區(qū)迅速流行和傳播。對蝦肝腸胞蟲寄生于細(xì)胞內(nèi)，蟲體長度為0.75～1μm^[2]，用光學(xué)顯微鏡常規(guī)鏡檢很難發(fā)現(xiàn)。目前，已經(jīng)報(bào)道的用于ehp檢測方法包括pcr方法^[4]、地高辛標(biāo)記核酸探針原位雜交法^[4]以及l(fā)amp檢測方法^[5]。但這些檢測方法也存在缺點(diǎn)，包括只能對該種病原微生物進(jìn)行定性描述，無法進(jìn)行定量研究，靈敏度和特異性不足等^[6]。因此，建立快速、可靠的ehp檢測方法，對及時(shí)發(fā)現(xiàn)ehp攜帶和感染對蝦，減少病原傳播擴(kuò)散有積極的意義。

海藻糖是一種非還原性二糖，由兩個(gè)葡萄糖分子以α,α-1,1-糖苷鍵構(gòu)成的。它在自然界的動植物與微生物中廣泛存在，包括原核生物、藻類、細(xì)菌、真菌、低等植物以及無脊椎動物。海藻糖具有保護(hù)生物膜、保持蛋白質(zhì)等大分子不被變性失活等性質(zhì)，由此來維持生命體的生命過程和生物特征，幫助生物體抵御許多逆性環(huán)境，如干燥脫水、高溫、冷凍、高滲等狀態(tài)等。在海藻糖合成途徑中，海藻糖-6-磷酸合成酶是其中的關(guān)鍵酶，對實(shí)現(xiàn)海藻糖在生物體內(nèi)的富集起著重要作用。目前，研究人員已對許多物種(如煙草、酵母、蟹等)的海藻糖-6-磷酸合成酶基因進(jìn)行了克隆和研究。

參考文獻(xiàn)：

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[5]suebsingr,prombunp,srisalaj,etal.loop-mediatedisothermalamplificationcombinedwithcolorimetricnanogoldfordetectionofthemicrosporidianenterocytozoonhepatopenaeiinpenaeidshrimp[j].japplmicrobiol,2013,114(5):1254-1263.

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[7]薩姆布魯克,拉塞爾(著),黃培堂(譯),《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》,科學(xué)出版社,2002年,第三版.

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供對蝦肝腸胞蟲(enterocytozoonhepatopenaei)海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供對蝦肝腸胞蟲(enterocytozoonhepatopenaei)海藻糖-6-磷酸合成酶蛋白序列。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供對蝦肝腸胞蟲(enterocytozoonhepatopenaei)海藻糖-6-磷酸合成酶的基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測方法。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供對蝦肝腸胞蟲(enterocytozoonhepatopenaei)海藻糖-6-磷酸合成酶基因在對蝦肝腸胞蟲病害檢測中的應(yīng)用。

所述對蝦肝腸胞蟲(enterocytozoonhepatopenaei)海藻糖-6-磷酸合成酶基因，編碼對蝦肝腸胞蟲(enterocytozoonhepatopenaei)海藻糖-6-磷酸合成酶的核苷酸序列，記為ehptps；

所述對蝦肝腸胞蟲(enterocytozoonhepatopenaei)海藻糖-6-磷酸合成酶基因ehptps的分子類型為cdna，序列特征：長度為1392bp，類型為核酸，鏈性為雙鏈，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)為線性，所述對蝦肝腸胞蟲(enterocytozoonhepatopenaei)海藻糖-6-磷酸合成酶基因ehptps的序列如下所示，記為seqidno.1：

所述對蝦肝腸胞蟲(enterocytozoonhepatopenaei)海藻糖-6-磷酸合成酶基因，其核苷酸序列采用以下方法獲得：提取感染對蝦肝腸胞蟲的對蝦的總rna，并將rna反轉(zhuǎn)錄成cdna，以cdna為模板，經(jīng)pcr擴(kuò)增得到seqidno.1的序列；相關(guān)的核苷酸序列通過預(yù)測獲得基因編碼的多肽seqidno.2。

所述對蝦肝腸胞蟲(enterocytozoonhepatopenaei)海藻糖-6-磷酸合成酶，所述對蝦肝腸胞蟲(enterocytozoonhepatopenaei)海藻糖-6-磷酸合成酶ehptps的分子類型為蛋白質(zhì)，序列特征：長度為463aa，類型為氨基酸，所述對蝦肝腸胞蟲enterocytozoonhepatopenaei海藻糖-6-磷酸合成酶ehptps的序列如下所示，記為seqidno.2：

所述對蝦肝腸胞蟲(enterocytozoonhepatopenaei)海藻糖-6-磷酸合成酶基因ehptps的檢測方法包括以下步驟：

一個(gè)感染對蝦肝腸胞蟲病的對蝦總rna的提取的步驟；

一個(gè)感染對蝦肝腸胞蟲病的對蝦cdna反轉(zhuǎn)錄的步驟；

一個(gè)感染對蝦肝腸胞蟲病的對蝦中對蝦肝腸胞蟲enterocytozoonhepatopenaei海藻糖-6-磷酸合成酶基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測步驟。

本發(fā)明通過提取感染對蝦肝腸胞蟲的對蝦的總rna，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，通過引物擴(kuò)增和鑒定了1個(gè)海藻糖-6-磷酸合成酶基因，根據(jù)該序列信息，設(shè)計(jì)最佳的引物，用于實(shí)時(shí)定量pcr方法，為檢測該基因在對蝦中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平提供了基礎(chǔ)。通過實(shí)時(shí)定量pcr方法檢測對蝦肝腸胞蟲ehp海藻糖-6-磷酸合成酶基因在對蝦中的轉(zhuǎn)錄水平，可以將其應(yīng)用于對蝦肝腸胞蟲檢測，為對蝦病害防治提供信息和方法。

本發(fā)明以感染對蝦肝腸胞蟲的對蝦為研究材料，通過轉(zhuǎn)錄組序列分析，獲得了一個(gè)對蝦肝腸胞蟲ehp海藻糖-6-磷酸合成酶基因。研究發(fā)現(xiàn)該基因在感染對蝦肝腸胞蟲的對蝦中轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平高，特異性好，對對蝦肝腸胞蟲的檢測具有很好的應(yīng)用前景。

對蝦肝腸胞蟲屬于真菌界，經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測序分析，本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)其含有海藻糖-6-磷酸合成酶，該酶在感染ehp的對蝦中表達(dá)量高，可能對ehp的寄生和宿主侵染具有重要的作用。因此，建立基于ehp海藻糖-6-磷酸合成酶的檢測方法對于及時(shí)準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)ehp攜帶和感染對蝦，提高檢測方法的靈敏度和特異性，具有重要意義。

附圖說明

圖1為對蝦肝腸胞蟲的對蝦中對蝦肝腸胞蟲(enterocytozoonhepatopenaei)海藻糖-6-磷酸合成酶基因pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖譜。在圖1中，1：dl2000dnamarker；2：以感染對蝦肝腸胞蟲的對蝦cdna為模版的pcr產(chǎn)物。

圖2為對蝦肝腸胞蟲的對蝦中對蝦肝腸胞蟲(enterocytozoonhepatopenaei)海藻糖-6-磷酸合成酶基因?qū)崟r(shí)定量pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線圖譜。在圖2中，平行兩組樣品，1.樣品1；2.樣品2，由于兩組重復(fù)性好，兩條曲線疊加，呈現(xiàn)類似黑色。

圖3為不同地區(qū)養(yǎng)殖場對蝦樣品對蝦肝腸胞蟲enterocytozoonhepatopenaei海藻糖-6-磷酸合成酶基因?qū)崟r(shí)定量pcr擴(kuò)增曲線。在圖3中，gd表示為廣東；hn表示海南；fj表示福建。應(yīng)用該方法檢測不同地區(qū)的對蝦，結(jié)果說明廣東1號樣品，海南2號和3號樣品，福建1號樣品是被肝腸胞蟲感染的對蝦。

圖4為圖3pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖譜。在圖4中，m：dl2000；1：gd-1；2：gd-2；3：hn-1；4：hn-2；5：hn-3；6：hn-4；7：hn-5；8：hn-6；9：hn-7；10：fj-1；11：fj-2。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊^[7](薩姆布魯克，拉塞爾(著)，黃培堂(譯)，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，科學(xué)出版社，2002年，第三版.)中所述的實(shí)驗(yàn)條件，或按照試劑或儀器生產(chǎn)廠商所建議的條件。

本發(fā)明的具體步驟是：

1.感染對蝦肝腸胞蟲的對蝦總rna的提取

取100mg對蝦肝胰腺組織，加入0.6mltrireagent(molecularresearchcenter公司)，用研磨棒研磨樣品，研磨后加入0.4mltrireagent，室溫靜置5min裂解細(xì)胞；加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置10min；4℃，12000g離心15min；將上層液體轉(zhuǎn)移至一新的無rnase離心管中，加入0.5ml異丙醇，混勻，室溫放置8min；4℃，12000g離心10min；棄去液體，加入1ml75％乙醇漂洗；4℃，7500g離心5min；棄去液體，沉淀稍加干燥后溶于適量rnase-free的水中；用微量紫外分光光度計(jì)測量總rna在od230、od260和od280的吸光度，判定總rna的濃度與純度。

2.感染對蝦肝腸胞蟲的對蝦cdna反轉(zhuǎn)錄

在0.5ml離心管制備cdna反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，包括2μg總rna，1μl6mer隨機(jī)引物(200ng)，1μldntp(10mm)，用depc處理過的h2o將總體積補(bǔ)至13μl；反應(yīng)體系65℃處理5min，立即放入冰浴中1min；稍離心，加入下列組分：4μl5×first-strandbuffer，1μldtt(0.1m)，1μlrnaseinhibitor(40u/μl)(takara公司)和1μlsuperscript^tmiiireversetranscriptase(200u/μl)(thermofisherscientific公司)；反應(yīng)體系輕彈混勻，稍離心；50℃溫育60min，70℃處理15min終止反應(yīng)。

3.對蝦肝腸胞蟲enterocytozoonhepatopenaei海藻糖-6-磷酸合成酶基因ehptps的pcr擴(kuò)增(圖1)

以感染對蝦肝腸胞蟲的對蝦cdna為模板，通過引物分別擴(kuò)增得到對蝦肝腸胞蟲enterocytozoonhepatopenaei海藻糖-6-磷酸合成酶基因的開放閱讀框。

在25μl的反應(yīng)體系中含1μl模板，1μl正反引物(20μm)，2μldntp(各2.5mm)，5μl5×primerstar^tmbuffer，0.5μlprimerstar^tmhsdnapolymerase(2.5u/μl)(takara公司)，用h2o將總體積補(bǔ)至25μl。pcr反應(yīng)條件為：98℃10s、58℃10s、72℃2min(30cycles)；4℃保存。pcr產(chǎn)物經(jīng)純化后與t載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞top10中，菌落pcr后選取有dna片段的陽性克隆測序。

根據(jù)擴(kuò)增獲得的核苷酸序列推導(dǎo)出氨基酸序列，分別含有463個(gè)氨基酸的多肽，其氨基酸序列詳見seqidno.2。

4.對蝦肝腸胞蟲enterocytozoonhepatopenaei海藻糖-6-磷酸合成酶基因ehptps轉(zhuǎn)錄水平的檢測方法

正向引物：gtatgctgaatactcttttacg(seqidno.3)

反向引物：atagtcttgggggtagatagga(seqidno.4)

在20μl的反應(yīng)體系中含1μl模板，0.5μl正向引物(20μm)，0.5μl反向引物(20μm)，0.5μlpremixextaq^tm(tlirnasehplus)(2×)(takara公司)，用h2o將總體積補(bǔ)至20μl。pcr反應(yīng)條件為：95℃15s、55℃20s、72℃20s(30cycles)。

5.對蝦肝腸胞蟲enterocytozoonhepatopenaei海藻糖-6-磷酸合成酶基因ehptps在對蝦肝腸胞蟲ehp檢測中的應(yīng)用

在不同地區(qū)(廣東、福建、海南)對蝦養(yǎng)殖場收集凡納濱對蝦對蝦樣品，現(xiàn)場取肝胰腺組織放入rnalater中保存。待樣品全部收集完畢，分別從rnalater中取出組織樣品，放入trireagent中，提取樣品總rna，去除基因組dna，反轉(zhuǎn)錄為cdna，通過實(shí)時(shí)定量pcr確定不同對蝦中肝腸胞蟲enterocytozoonhepatopenaei海藻糖-6-磷酸合成酶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在若干個(gè)對蝦樣品中可以檢測到目的基因的轉(zhuǎn)錄(圖2～4)，表明這些對蝦感染了肝腸胞蟲。該基因和轉(zhuǎn)錄水平的檢測方法能夠有效應(yīng)用于對蝦肝腸胞蟲病害的檢測，準(zhǔn)確度高、特異性強(qiáng)。圖3是定量pcr擴(kuò)增曲線圖，便于實(shí)時(shí)監(jiān)測和定量目的基因的轉(zhuǎn)錄水平，反映肝腸胞蟲感染情況；圖4是對圖3pcr反應(yīng)產(chǎn)物的電泳分析，電泳條帶單一說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果特異好，具有可信性。

序列表

<110>國家海洋局第三海洋研究所

<120>對蝦肝腸胞蟲海藻糖-6-磷酸合成酶基因的檢測與應(yīng)用

<130>2017

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1392

<212>dna

<213>enterocytozoonhepatopenaei

<400>1

atgaaattagtaatttgcgcaaacagacttcctctaacaataaaacgtggaaatgatggt60

tttgaataccagtctacttctggtggtcttgtaaccggaatacgctccctttcagaacgc120

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<210>2

<211>463

<212>prt

<213>enterocytozoonhepatopenaei

<400>2

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151015

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275280285

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<210>3

<211>22

<212>dna

<213>unknown

<220>

<223>ehptps基因檢測正向引物

<400>3

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<210>4

<211>22

<212>dna

<213>unknown

<220>

<223>ehptps基因檢測反向引物序列

<400>4

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