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      BALF4多肽的克隆、表達和應(yīng)用的制作方法

      文檔序號:11245027閱讀:601來源:國知局
      BALF4多肽的克隆、表達和應(yīng)用的制造方法與工藝

      本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域,尤其是涉及一種balf4多肽的克隆、表達和應(yīng)用。



      背景技術(shù):

      eb病毒(epstein-barrvirus,ebv)屬于人類皰疹病毒第四型,于1964年由epstein和barr在研究非洲兒童惡性淋巴瘤時發(fā)現(xiàn)。eb病毒是一種嗜淋巴細胞病毒,是人類普遍感染的病毒之一,感染全球超過90%的人群。eb病毒因兼具較高感染率和致癌性,已于1997年被國際癌癥研究中心定為i類致癌物。

      eb病毒經(jīng)唾液或密切口腔接觸傳染。eb病毒主要感染b細胞和上皮細胞,其中口咽部上皮細胞是eb病毒感染與復(fù)制的首要位點。eb病毒感染主要分為四個階段:(1)通過口頭傳播的eb病毒在口咽部易感細胞(一般為鱗狀上皮細胞及侵潤b淋巴細胞)中進行復(fù)制;(2)在口咽部淋巴組織中eb病毒通過潛伏感染b細胞而定植于宿主體內(nèi);(3)大多數(shù)情況下,eb病毒以沉默的潛伏感染方式永久存在于循環(huán)的記憶b細胞群中(主要發(fā)生在健康攜帶者中);(4)eb病毒偶爾也會被激活,從潛伏感染狀態(tài)轉(zhuǎn)換至裂解感染狀態(tài),導(dǎo)致病毒再次在口咽部復(fù)制并成為傳染源。eb病毒蛋白通過模擬b細胞增殖和生存信號保障病毒復(fù)制,同時又不被宿主的免疫系統(tǒng)識別,從而建立終生感染,這種免疫逃逸方式還有利于病毒傳播。

      eb病毒通過包膜糖蛋白gp350/gp220與b細胞2型補體受體cd21(cr2)結(jié)合進入并感染b細胞。三種糖蛋白(gp42,gh和gl)組成的復(fù)合物與mhcii(主要組織相容性復(fù)合物ii)結(jié)合促進病毒包膜與細胞膜的融合。病毒進入上皮細胞是由病毒bmrf2與β1整聯(lián)蛋白的結(jié)合介導(dǎo);與b細胞膜融合過程類似,gh與gl組成的復(fù)合物也參與了病毒包膜與上皮細胞膜的融合。gp110能夠提高病毒感染靶細胞的效率。此外,eb病毒還能感染t細胞,巨紅細胞,粒細胞和自然殺傷(nk)細胞。eb病毒感染這些細胞的機制尚不明確,病毒包膜蛋白可能參與eb病毒感染t細胞及其它免疫細胞的過程。

      eb病毒感染能夠?qū)е聜魅拘詥魏思毎龆喟Y,25%以上的青少年感染者患有eb病毒誘發(fā)的傳染性單核細胞增多癥,美國每年新增約125,000例傳染性單核細胞增多癥病例。該癥患者會出現(xiàn)發(fā)熱、咽喉炎、頭痛、淋巴結(jié)腫大、肝臟及脾臟腫大等癥狀;若不及時接受治療,患者病情將進一步加重并發(fā)展為無菌性腦膜炎與重度肝炎,嚴重危害了青少年的健康。eb病毒還與淋巴細胞腫瘤及上皮細胞腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),例如,eb病毒相關(guān)的淋巴細胞腫瘤包括伯基特淋巴瘤,霍奇金氏淋巴瘤和t細胞淋巴瘤。eb病毒相關(guān)的淋巴瘤惡性程度高,發(fā)展快,并且常規(guī)化療效果差。研究顯示,全球每年新增約28,000例eb病毒相關(guān)的霍奇金淋巴瘤。eb病毒相關(guān)的上皮細胞腫瘤主要包括鼻咽癌和胃癌,數(shù)據(jù)顯示,全球每年新增約78,000例eb病毒陽性鼻咽癌病例和約84,000例eb病毒陽性胃癌病例。我國的eb病毒相關(guān)鼻咽癌的發(fā)病率較高;在我國華南地區(qū),每十萬名中年男性中有50人患eb病毒陽性鼻咽癌。此外,eb病毒還與免疫缺陷或免疫抑制病人中的惡性腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。eb病毒與艾滋病毒共感染極大地增加感染者患淋巴瘤的風(fēng)險,研究表明,30%-40%艾滋患者攜帶有eb病毒,通過抗病毒藥物治療不會降低艾滋病人中eb病毒相關(guān)淋巴瘤的發(fā)生率;因器官移植而導(dǎo)致免疫抑制病人中b細胞淋巴瘤發(fā)病率極高,且移植病人中b細胞淋巴瘤的致死率高達50%。

      鑒于eb病毒及其誘發(fā)的相關(guān)疾病的危害,現(xiàn)有的研究主要集中在抗eb病毒感染及其誘發(fā)腫瘤治療兩方面。針對抗病毒感染的策略主要為抗病毒藥物治療方法,抗eb病毒藥物多為廣譜性抗皰疹藥物。eb病毒誘發(fā)腫瘤的治療策略包括應(yīng)用eb病毒特異性細胞毒性t淋巴細胞(ctl)的治療方法和采用單克隆抗體的治療方法。t細胞介導(dǎo)的抗腫瘤治療策略是通過將ctl注入患者體內(nèi),激活機體免疫系統(tǒng),從而達到殺傷腫瘤的效果;cd20單克隆抗體療法對eb病毒誘發(fā)的cd20陽性惡性腫瘤具有較好的治療效果。然而,抗病毒藥物不能有效治療eb病毒誘發(fā)腫瘤;eb病毒相關(guān)腫瘤的治療方法尚處于研究階段,eb病毒特異性ctl對于器官移植后病毒誘發(fā)的惡性腫瘤治療效果不理想,cd20單克隆抗體療法的有效性還有待明確。因此,抗病毒疫苗成為防治eb病毒及其誘發(fā)疾病的最佳策略。

      抗eb病毒疫苗以包膜糖蛋白gp350為研究重點。gp350是eb病毒及其感染細胞表面最豐富的糖蛋白,也是中和抗體的首要靶標,是抗eb病毒感染的關(guān)鍵分子?,F(xiàn)有研究表明,gp350能夠有效誘導(dǎo)中和抗體反應(yīng),并能夠保護免疫動物免于病毒感染及其相關(guān)腫瘤的發(fā)生。為了驗證gp350的預(yù)防保護效果,美國國立衛(wèi)生研究院(nih)開展了gp350疫苗的臨床試驗,結(jié)果顯示,重組gp350能夠誘導(dǎo)gp350特異性抗體產(chǎn)生,并具有較好的安全性和免疫原性。另一項gp350疫苗的i期臨床試驗表明,該疫苗能夠誘導(dǎo)igg抗體與中和抗體產(chǎn)生。ii期臨床試驗結(jié)果顯示,gp350疫苗能夠保護78%的接種者免于eb病毒誘發(fā)的傳染性單核細胞增多癥,并在98.7%的接種者血清中檢測到gp350特異性抗體;而在疫苗接種18周后,仍能在接種者血清中檢測到特異性抗體。然而,該gp350疫苗雖然能夠有效降低傳染性單核細胞增多癥的發(fā)生率,但不能預(yù)防eb病毒的感染。

      綜上所述,eb病毒疫苗的研制已取得一定進展,然而在疫苗研發(fā)過程中仍存在一些問題。eb病毒疫苗對實驗動物具有較好的保護效果,但其臨床試驗結(jié)果并不理想。因此,亟需研制能夠增強抗eb病毒疫苗預(yù)防保護效果的免疫佐劑。



      技術(shù)實現(xiàn)要素:

      本發(fā)明的第一個目的在于提供編碼balf4多肽的核苷酸序列,本發(fā)明的第二個目的在于提供重組表達載體,本發(fā)明的第三個目的在于提供重組細胞,本發(fā)明的第四個目的在于提供balf4多肽,本發(fā)明的第五個目的在于提供balf4多肽的表達方法,本發(fā)明的第六個目的在于提供balf4多肽的應(yīng)用,以緩解現(xiàn)有技術(shù)中抗eb病毒疫苗免疫原性差的技術(shù)問題。

      本發(fā)明提供了一種編碼balf4多肽的核苷酸序列,所述核苷酸序列包含如seqidno.1所示的序列。

      另外,本發(fā)明還提供了包含所述核苷酸序列的重組表達載體。

      進一步的,所述重組表達載體源始于真核表達載體,優(yōu)選的,源始于ppiczαa。

      另外,本發(fā)明還提供了包含所述重組表達載體的重組細胞。

      進一步的,所述重組細胞源始源真核細胞,優(yōu)選的,源始于畢赤酵母。

      另外,本發(fā)明還提供了一種balf4多肽,所述balf4多肽具有如seqidno.2所示的序列。

      進一步的,所述balf4多肽具有b細胞抗原表位和t細胞抗原表位,其中所述balf4多肽中的19-26位氨基酸序列,34-41位氨基酸序列,70-81位氨基酸序列,112-137位氨基酸序列,146-172位氨基酸序列,257-264位氨基酸序列以及279-288位氨基酸序列為b細胞抗原表位;所述balf4多肽中的22-30位氨基酸序列,32-40位氨基酸序列,68-76位氨基酸序列,91-107位氨基酸序列,171-179位氨基酸序列,185-193位氨基酸序列,216-224位氨基酸序列,311-319位氨基酸序列,287-295位氨基酸序列以及328-336位氨基酸序列為t細胞抗原表位。

      進一步的,所述balf4多肽具有免疫原性。

      另外,本發(fā)明還提供了所述balf4多肽的表達方法,所述表達方法包括以下步驟:

      (a)優(yōu)化基因得到編碼balf4多肽的核苷酸序列,所述核苷酸序列包含如seqidno.1所示的序列;

      (b)將所述核苷酸序列插入ppiczαa載體中,得到重組表達載體;

      (c)將所述重組表達載體導(dǎo)入畢赤酵母中,得到重組酵母細胞;

      (d)培養(yǎng)并誘導(dǎo)所述重組酵母細胞,并采用親和層析方法純化得到所述balf4多肽。

      另外,本發(fā)明還提供了所述的balf4多肽作為免疫佐劑的應(yīng)用。

      本發(fā)明通過優(yōu)化基因,得到了優(yōu)化的編碼balf4多肽的核苷酸序列,構(gòu)建了重組balf4多肽高效表達的酵母細胞,優(yōu)化了純化方法,最終得到了balf4多肽;本發(fā)明提供的balf4多肽能夠刺激高水平抗原特異抗體產(chǎn)生,誘導(dǎo)小鼠脾臟淋巴細胞增殖反應(yīng),能夠有效刺激機體免疫系統(tǒng),具有較強的免疫原性,能夠作為免疫佐劑,用于制作疫苗,從而達到防治eb病毒及其相關(guān)疾病的目的。

      附圖說明

      為了更清楚地說明本發(fā)明具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案,下面將對具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹,顯而易見地,下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實施方式,對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講,在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下,還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

      圖1為ppiczαa-balf4287-623的菌液pcr檢測結(jié)果;

      圖2為western雜交方法檢測重組balf4287-623的表達;

      圖3a為elisa檢測balf4287-623免疫小鼠血清的igg水平;

      圖3b為elisa檢測balf4287-623免疫小鼠血清的igm水平;

      圖4為mtt方法檢測balf4287-623誘導(dǎo)的小鼠脾臟淋巴細胞增殖反應(yīng)。

      具體實施方式

      下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述,顯然,所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例,而不是全部的實施例?;诒景l(fā)明中的實施例,本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例,都屬于本發(fā)明保護的范圍。

      本發(fā)明提供了編碼balf4多肽的核苷酸序列,編碼balf4多肽的核苷酸序列包含seqidno.1所示的序列。本發(fā)明提供的編碼balf4多肽的核苷酸序列可包括:僅seqidno.1所示的序列,或者在seqidno.1所示的序列的5’端或者3’端添加起始密碼子、終止密碼子、蛋白純化標簽或者酶切位點等序列得到的核苷酸序列。即,編碼balf4多肽的核苷酸序列可能不僅包含seqidno.1所示的序列,還可能包含其他的功能性核苷酸序列。

      另外,本發(fā)明還提供了包含編碼balf4多肽的核苷酸序列的重組表達載體。重組表達載體的制備方法包括,通過在seqidno.1所示的序列的5’端與3’端分別添加起始密碼子和終止密碼子,并引入特異性酶切位點等操作,然后將編碼balf4多肽的核苷酸序列連接到表達載體上,得到重組表達載體。此處涉及的表達載體,表示尚不包含seqidno.1所示序列的載體。其中,表達載體可以是真核表達載體,優(yōu)選的,表達載體是ppiczαa。

      另外,本發(fā)明還提供了包含上述重組表達載體的重組細胞。重組細胞通過將上述重組表達載體導(dǎo)入到表達宿主中制備而成。表達宿主可以是真核細胞,優(yōu)選的,表達宿主是畢赤酵母。

      發(fā)明人通過研究發(fā)現(xiàn),將編碼balf4多肽的核苷酸序列連接到ppiczαa載體,并導(dǎo)入畢赤酵母中,得到的重組細胞能夠高效表達具有較強免疫原性的balf4多肽。

      另外,本發(fā)明還提供了balf4多肽,balf4多肽包含如seqidno.2所示的序列。其中,seqidno.2所示的氨基酸序列,由seqidno.1所示的核苷酸序列編碼。此外,本發(fā)明中涉及的“重組balf4多肽”與“balf4多肽”意義相同。

      本發(fā)明提供的balf4多肽具有b細胞和t細胞抗原表位,且具有較強的免疫原性。

      另外,本發(fā)明還提供了balf4多肽的表達方法,發(fā)明人通過研究發(fā)現(xiàn),將編碼balf4多肽的核苷酸序列連接到ppiczαa載體,并導(dǎo)入畢赤酵母中,得到的重組細胞能夠高效表達具有較強免疫原性的balf4多肽。

      由于本發(fā)明提供的balf4多肽能夠刺激高水平抗原特異抗體產(chǎn)生,誘導(dǎo)小鼠脾臟淋巴細胞增殖反應(yīng),具有較好的免疫原性,因此本發(fā)明提供的balf4多肽能夠用作免疫佐劑,用于治療eb病毒引起的相關(guān)疾病。

      為了有助于更清楚的理解本發(fā)明,現(xiàn)通過具體的實施例對本發(fā)明的內(nèi)容進行詳細的介紹。如未明確指出,以下實施例中涉及的實驗操作方法為常用的分子生物學(xué)操作方法,涉及的試劑、儀器為常規(guī)的市售試劑或者儀器。

      實施例1重組蛋白的表達及純化

      一、試劑

      大腸桿菌dh5α:在5ml含50-100mg/ml卡那霉素的lb中培養(yǎng)過夜,取0.85ml培養(yǎng)液加0.15ml滅菌甘油完全混勻,轉(zhuǎn)入凍存瓶中,凍在液氮或干冰/酒精浴中,存于-80℃。

      畢赤酵母重組表達載體ppiczαa:在seqidno.1所示序列的5’端加上his6標簽,3’端加上終止密碼子,在5’端和3’端分別引入ecori和xbai酶切位點;α-factor分泌信號分泌表達目的蛋白。表達時,目的基因插入信號序列起始密碼的讀碼框中。

      畢赤酵母gs115菌株購自takara。

      rpmi-l640培養(yǎng)基,反轉(zhuǎn)錄試劑盒,pcr試劑,限制性內(nèi)切酶、t4連接酶、質(zhì)粒提取試劑盒、pcr產(chǎn)物回收試劑盒、膠回收試劑盒等均購自takara。

      ypd培養(yǎng)基:1.0%酵母粉,2.0%蛋白胨,2.0%葡萄糖,1.5%瓊脂,121℃滅菌20min,畢赤酵母培養(yǎng)用。

      lb培養(yǎng)基:1.0%胰蛋白胨,0.5%酵母粉,1.0%nacl,1.5%瓊脂,ph7.0,121℃滅菌20min,加入100mg/ml的卡那霉素。

      bmgy培養(yǎng)基:1%酵母粉,2%蛋白胨,0.34%酵母氮源堿,1%(nh4)2so4,100mmol/l磷酸鉀緩沖液(ph6.0),1%甘油。

      bmmy固體培養(yǎng)基:1%酵母粉,2%蛋白胨,0.34%酵母氮源堿,1%(nh4)2so4,100mmol/l磷酸鉀緩沖液(ph6.0),1%甲醇,1.5%瓊脂。

      主要溶液:

      1)質(zhì)粒抽提溶液?。?0mmol/l葡萄糖,5mmol/ltris-hcl(ph8.0)10mmol/ledta(ph8.0);

      2)質(zhì)粒抽提溶液ⅱ:1體積0.4mmol/lnaoh,1體積2%sds,8體積水,使用前混合;

      3)質(zhì)粒抽提溶液ⅲ:5mol/lkac(60ml),hac(11.5ml),水(28.5ml)

      4)te緩沖液:10mmol/ltris-hcl,1mmol/ledta(ph8.0);

      5)50×tae電泳緩沖液:tris堿242g,冰醋酸57.1ml,0.5mol/ledta(ph8.0)100ml用雙蒸水定容至1000ml,室溫儲存,用時再稀釋50倍;

      6)裂解緩沖液:200mmol/ltris-hcl,ph8.5;0.5%(w/v)sds,250mmol/lnacl,25mmol/l,edta;

      7)dna抽提緩沖液:100mmol/ledtana2,100mmol/ltris-hcl,1.5mol/lnacl,ph8.0;

      8)depc處理的水(簡稱depc水):雙蒸水按0.1%(v/v)的量加入depc于4℃儲存過夜,高壓滅菌后備用;

      9)tb緩沖液:10mmol/lpipes,55mmol/lmncl2,15mmol/lcacl2,250mmol/lkcl,用koh調(diào)ph至6.7;

      10)畢赤酵母轉(zhuǎn)化用buffera:1.0mol/l山梨糖醇,10mmol/lbicine(ph8.35),30%(v/v)乙二醇;

      11)畢赤酵母轉(zhuǎn)化用bufferb:40%(w/v)peg1000,0.2mol/lbicine(ph8.35);

      12)畢赤酵母轉(zhuǎn)化用bufferc:0.15mol/lnacl,10mmol/lbicine(ph8.35);

      13)2×sds凝膠加樣緩沖液:0.5mol/ltris-hcl(ph6.8,2ml);甘油2ml;20%sds(2ml);0.1%溴酚藍(0.5ml);β-巰基乙醇(1.0ml);雙蒸水(2.5ml);

      14)5×sds-page電泳緩沖液:tris7.5g;甘氨酸36g;sds2.5g;溶于500ml雙蒸水,使用時用去離子水稀釋5倍;

      15)sds-page膠染色液:0.25g考馬斯亮藍r250溶于90ml甲醇:水(1:1,v/v)和10ml冰乙酸中,濾紙過濾備用;

      16)sds-page膠脫色液:90ml甲醇:水(1:1,v/v)和10ml冰乙酸;

      17)誘導(dǎo)劑:甲醇。

      二、實驗

      1.序列優(yōu)化與合成

      1)使用mega4分析balf4蛋白序列的同源性,選定保守balf4序列,下載其核苷酸序列(genbank序列號:ln831023.1);

      2)通過生物信息學(xué)分析,選定balf4多肽(287-623位氨基酸,命名為balf4287-623)作為候選抗原,進行后續(xù)檢測分析。

      3)根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性,使用jcat程序?qū)alf4287-623核苷酸序列進行密碼子優(yōu)化,得到seqidno.1所示的序列;

      4)設(shè)計并合成balf4287-623序列:在seqidno.1所示序列的5’端加上his6標簽,3’端加上終止密碼子,在優(yōu)化序列的5’端和3’端分別引入ecori和xbai酶切位點,并將合成序列連接到puc57上獲得重組載puc57-balf4287-623。

      2.真核表達載體的構(gòu)建

      1)載體酶切體系(50μl)如下:

      反應(yīng)條件:37℃,酶切過夜。

      2)酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確認酶切完全后,回收純化酶切產(chǎn)物;

      3)連接反應(yīng)體系(40μl)如下:

      反應(yīng)條件:22℃,連接1h。

      3.重組表達載體的鑒定

      1)取5μl連接產(chǎn)物加入100μl感受態(tài)細胞中,輕輕混勻,冰上放置30min;

      2)42℃熱激90s,立即于冰上放置1-2min;

      3)加入500μllb液體培養(yǎng)基,37℃,150rpm搖菌50min;

      4)離心,收集菌體沉淀,重懸菌體;

      5)在超凈工作臺中,將細胞懸液均勻涂布在含25μg/mlzeocin的低鹽lb平板上,37℃培養(yǎng)過夜。

      4.重組質(zhì)粒的提取與鑒定

      1)挑取轉(zhuǎn)化單菌落,接種至5mllb液體培養(yǎng)基中(含25μg/mlzeocin),37℃,300rpm培養(yǎng)8h;

      2)取150μl細菌懸液接種至100ml液體lb中擴大培養(yǎng),37℃,300rpm培養(yǎng)12-16h;

      3)提取重組質(zhì)粒,經(jīng)質(zhì)粒雙酶切和測序分析鑒定重組表達載體(如圖1)。

      5.重組多肽在畢赤酵母中的誘導(dǎo)表達

      挑取待表達的重組畢赤酵母單菌落于25mlbmgy液體培養(yǎng)基中(按10%裝瓶),28℃,200rpm搖床培養(yǎng)至od600=4-6。收集菌體,去上清,細胞沉淀全部轉(zhuǎn)移至25mlbmmy液體培養(yǎng)基中,200rpm,25℃搖床培養(yǎng)。每隔24h補加甲醇至終濃度5%進行誘導(dǎo),0,12h,24h,36h,48h,72h,96h取樣分析表達水平,以確定最佳誘導(dǎo)時間。結(jié)果表明誘導(dǎo)72h小時表達水平最佳。

      6.sds-page和western雜交方法檢測重組多肽的表達

      待重組畢赤酵母經(jīng)誘導(dǎo)表達后,取少許培養(yǎng)上清,離心,取上清,通過sds-page和western雜交方法檢測重組蛋白表達。

      7.重組蛋白的純化

      將已鑒定的重組畢赤酵母進行甲醇誘導(dǎo)表達后,離心收集上清液,加入80%飽和度硫酸銨沉淀過夜。4℃,10000rpm離心10min,棄上清,蛋白沉淀用0.1倍體積的0.05m磷酸緩沖液(ph6)溶解,并采用0.05m磷酸緩沖液(ph6)進行透析去鹽。將蛋白液過濾后,上到ni-nta親和層析柱(gehealthcare)中。采用0.05m磷酸緩沖液(ph6)進行平衡,再采用含200mm咪唑的0.05m磷酸緩沖液進行梯度洗脫,收集目的蛋白,重組蛋白的純化結(jié)果如圖2所示。

      實施例2重組表達蛋白免疫刺激活性檢測

      一、試劑

      elisa包被緩沖液(ph9.6,1l):溶解1.59gna2co3和2.93gnahco3于1l雙蒸水中。

      elisa洗滌緩沖液(ph7.4,1l):稱取0.2g固體kh2po4,2.9gna2hpo4·12h2o,8gnacl和0.2gkcl溶解于1l雙蒸水中,再加入0.5ml吐溫20,混勻備用。

      二、實驗

      1.小鼠免疫實驗

      balb/c小鼠(雌性,4-6周齡)購自青島市食品藥品檢驗所,按照山東省動物管理條例在青島大學(xué)動物中心飼養(yǎng),動物實驗室為spf級。將小鼠分為三組,每組10只,第一組為對照組,每隔兩周每只小鼠皮下注射100μlpbs一次,共免疫三次;第二組為balf4287-623免疫組,每隔兩周每只小鼠皮下注射10μgbalf4287-623(溶于100μlpbs)一次,共免疫三次;第三組為balf4287-623+fa免疫組,第一次每只小鼠皮下注射10μgbalf4287-623(溶于50μlpbs)與等體積弗式完全佐劑(sigma)混合液,此后每隔兩周每只小鼠皮下注射10μgbalf4287-623(溶于50μlpbs)與等體積弗式不完全佐劑(sigma)混合液,免疫兩次。每次免疫前及最后一次免疫兩周后采集小鼠血樣。

      2.elisa檢測

      采用elisa檢測小鼠免疫血清中igg和igm水平,結(jié)果如圖3a和圖3b所示。

      1)包被抗原:包被緩沖液稀釋抗原至濃度為50ngbalf4287-623/100μl,每孔加入100μl,4℃孵育過夜;

      2)洗滌:移去包被液,加入250μl洗滌緩沖液,洗板3次,每次5min;

      3)封閉:每孔加入200μl3%bsa,37℃封閉1h;

      4)洗滌:加入250μl洗滌緩沖液洗板5次,每次4min;

      5)加入待檢測血清:每孔加入100μlpbst稀釋的待測血清,置于37℃孵育1-2h;

      6)洗滌:同步驟(4);

      7)加入二抗,37℃孵育1h;

      8)洗滌:同步驟(4);

      9)顯色:加入tmb顯色液,室溫顯色5-20min,加入2m硫酸終止反應(yīng),酶標儀下測定od450。

      3.小鼠脾臟淋巴細胞的分離與培養(yǎng)

      1)最后一次免疫兩周后,每組取3-5只小鼠,頸椎脫臼處死小鼠,在75%酒精中浸泡小鼠后,無菌條件下取出小鼠脾臟;

      2)將脾臟置于200目尼龍網(wǎng)上充分研磨至1ml淋巴細胞分離液中,將分離液轉(zhuǎn)至干凈離心管中,并沿管壁緩慢加入200μlrpmi-1640培養(yǎng)基;

      3)4℃,800×g離心30min后,吸取中間淋巴細胞層;

      4)加入rpmi-1640培養(yǎng)基充分清洗細胞后計數(shù);

      5)將淋巴細胞懸液加至96孔板中,加入相應(yīng)抗原后進行體外培養(yǎng)。

      4.淋巴細胞增殖實驗

      采用mtt檢測小鼠脾臟淋巴細胞增殖反應(yīng)(如圖4),具體步驟如下:

      1)小鼠脾臟淋巴細胞按照1×106細胞/孔的密度,取100μl細胞懸液加至96孔板中,加入相應(yīng)抗原后,將96孔板置于37℃,5%co2無菌培養(yǎng)箱中;

      2)培養(yǎng)72h后,每孔加入10μlmtt溶液(5mg/ml,pbs配制),繼續(xù)培養(yǎng)4h;

      3)1,000rpm離心10min,小心吸去上清,每孔加入100μldmso后置于搖床低速振蕩10min,使結(jié)晶物充分溶解;

      4)檢測od570后,計算各組刺激指數(shù)(si)。

      si計算公式如下:

      si=抗原刺激組od570平均值/陰性對照組od570平均值。

      本發(fā)明中采用畢赤酵母表達系統(tǒng)獲得重組balf4多肽,具有以下優(yōu)勢:1)成本低;2)基因操作方便;3)表達穩(wěn)定;4)生長迅速;5)產(chǎn)量高。畢赤酵母系統(tǒng)能夠?qū)⑼庠吹鞍追置谥僚囵B(yǎng)上清中,而畢赤酵母自身分泌較少的內(nèi)源蛋白,因此,重組細胞誘導(dǎo)上清中的蛋白組分主要為外源重組蛋白,便于后續(xù)的蛋白純化工作。此外,通過大規(guī)模發(fā)酵,在畢赤酵母系統(tǒng)中可獲得高產(chǎn)量的重組蛋白,從而有利于重組蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)。

      本發(fā)明從體液與細胞免疫水平檢測重組多肽的免疫原性。重組多肽能夠刺激高水平抗原特異抗體的產(chǎn)生,誘導(dǎo)小鼠脾臟淋巴細胞增殖反應(yīng)。這些結(jié)果表明,重組balf4多肽能夠有效誘導(dǎo)體液免疫和細胞免疫反應(yīng),能夠作為eb病毒疫苗佐劑,提高eb病毒疫苗的預(yù)防效果,從而達到有效預(yù)防eb病毒感染的目的。

      最后應(yīng)說明的是:以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案,而非對其限制;盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明,本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解:其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改,或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進行等同替換;而這些修改或者替換,并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的范圍。

      sequencelisting

      <110>青島大學(xué)

      <120>balf4多肽的克隆、表達和應(yīng)用

      <130>2017

      <160>2

      <170>patentinversion3.5

      <210>1

      <211>1011

      <212>dna

      <213>人工序列

      <400>1

      aaacttgagaacagaaccgcttattgtccacttcagcactggcaaacattcgactccact60

      atcgctaccgagaccggaaaatctatccattttgttactgatgaaggtacatcttccttc120

      gttactaacactacagtcggaattgagttgccagacgcttttaagtgtatcgaagagcaa180

      gttaataagacaatgcacgaaaaatacgaggccgtccaggatagatataccaaaggtcaa240

      gaagcaattacctacttcatcactagtggtggattgcttttggcatggcttccattgact300

      cctagatcattggctactgttaagaaccttacagagttgaccactccaacatcaagtcca360

      ccttcttccccttctccacctgctccacctgctgccagaggttctacttccgcagctgtt420

      ttgagaagaagaagaagagacgccggaaacgcaacaaccccagtcccacctgccgcacct480

      ggtaaatcccttggaaccttgaacaatcctgctactgttcaaattcagtttgcctacgat540

      tctcttagaagacagatcaatagaatgcttggtgacttggcaagagcttggtgtttggaa600

      caaaagagacagaacatggttcttagagagttgactaagattaacccaactacagttatg660

      tcaagtatctatggtaaagctgtcgctgccaaaagattgggagatgttatttcagtcagt720

      cagtgtgttcctgtcaaccaagccaccgttactttgagaaagtcaatgagagtcccaggt780

      agtgaaactatgtgctactccagacctttggtttctttttccttcattaacgatacaaag840

      acctatgaaggtcaacttggaactgacaacgagatctttttgacaaagaaaatgaccgaa900

      gtctgccaagctacttcccagtactatttccaatcaggaaatgagattcatgtttacaat960

      gactatcaccactttaagactatcgaacttgacggtatcgccacccttcag1011

      <210>2

      <211>337

      <212>prt

      <213>eb病毒(epsteinbarrvirus)

      <400>2

      lysleugluasnargthralatyrcysproleuglnhistrpglnthr

      1

      pheaspserthrilealathrgluthrglylysserilehispheval

      17

      thraspgluglythrserserphevalthrasnthrthrvalglyile

      33

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      49

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      65

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      81

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      97

      leuthrthrprothrserserproproserserproserproproala

      113

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      129

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      145

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      161

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      177

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      193

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      209

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      225

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      241

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      305

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