本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種同時(shí)敲除kras基因和egfr基因的crispr-cas9系統(tǒng)及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

肺癌是目前世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，全球肺癌的發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢(shì)。在我國，隨著工業(yè)化速度加快、環(huán)境污染嚴(yán)重及人口老齡化加劇，肺癌的癌癥負(fù)擔(dān)日益加重。根據(jù)病理組織學(xué)可將肺癌分為兩大類：非小細(xì)胞肺癌(nsclc，85％)和小細(xì)胞肺癌(sclc，15％)，其治療仍為醫(yī)療界最具挑戰(zhàn)性的任務(wù)之一。

腫瘤細(xì)胞在驅(qū)動(dòng)基因的作用下持續(xù)生長，并對(duì)驅(qū)動(dòng)基因的抑制高度敏感，其中kras和egfr是在肺癌中常見的突變驅(qū)動(dòng)基因。

已發(fā)現(xiàn)三分之一nsclc和kras基因突變直接相關(guān)，故針對(duì)kras突變的靶向治療是近年來肺癌研究的熱點(diǎn)。kras基因?qū)賠as基因家族中的一員，編碼蛋白p21，本質(zhì)為一單聚體g蛋白，位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，通過與gtp/gdp結(jié)合來調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化。正常狀態(tài)下p21和gdp結(jié)合處于靜止?fàn)顟B(tài)，當(dāng)受到生長因子刺激時(shí)，p21被激活為gtp結(jié)合狀態(tài)，信號(hào)系統(tǒng)開放，同時(shí)p21具有的gtp酶活性使gtp水解成為gdp，p21重新和gdp結(jié)合后失活，信號(hào)系統(tǒng)關(guān)閉。正常kras基因可抑制腫瘤生長，突變的kras蛋白p21僅有微弱的gtp活性，不能迅速分解gtp，因此ras信號(hào)傳導(dǎo)蛋白“鎖密”在gtp結(jié)合的激活狀態(tài)，使細(xì)胞得到持續(xù)生長信號(hào)的刺激，募集受體信號(hào)傳播所需蛋白，傳遞細(xì)胞外信號(hào)，影響細(xì)胞的增殖、存活和分化等過程，持續(xù)刺激細(xì)胞生長，打亂生長規(guī)律，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。

表皮生長因子受體(egfr)基因位于第7號(hào)染色體p13～q22區(qū)，由28個(gè)外顯子組成，編碼1186個(gè)氨基酸。該基因編碼的是一種跨膜的蛋白受體，為egfr家族成員之一。egfr突變率在不同人種中存在顯著差異。突變熱點(diǎn)主要是在其酪氨酸激酶的編碼區(qū)，大多數(shù)集中在18～21外顯子，最常見的突變是位于19外顯子的缺失突變(約占egfr突變的44％)和位于21外顯子的l858r點(diǎn)突變(約占egfr突變的41％)。

表皮生長因子(egf)是體外最強(qiáng)的促表皮細(xì)胞分裂因子，可以與某些細(xì)胞分泌的轉(zhuǎn)化因子(tgfa)競(jìng)爭性結(jié)合egfr，而后激活受體酪氨酸蛋白激酶，后者使自身及胞漿中多種蛋白質(zhì)底物磷酸化，觸發(fā)一系列信號(hào)傳遞，將信息傳至細(xì)胞核內(nèi)，促進(jìn)蛋白質(zhì)和酶的合成及細(xì)胞的分裂增殖。人類的許多腫瘤都檢測(cè)到egfr表達(dá)，并通過自分泌、旁分泌作用促進(jìn)腫瘤生長，肺癌中egfr的表達(dá)量明顯高于正常組織，表明其在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中有著重要作用。

近年來，基因組編輯工具廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，而成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(crispr)技術(shù)已成為基因組編輯的熱點(diǎn)。crispr是自然存在于細(xì)菌dna中的序列，與crispr相關(guān)核酸酶(cas)結(jié)合，具有指導(dǎo)rnas保護(hù)細(xì)菌基因組免受侵入性噬菌體中檢測(cè)到的靶向特異性序列攻擊的作用。crispr/cas9技術(shù)被nature、science雜志分別評(píng)為2013年前10位的明星技術(shù)之一，并位居2015年科學(xué)雜志評(píng)選出來的十大發(fā)現(xiàn)之首。該項(xiàng)技術(shù)將成為功能基因組學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)領(lǐng)域中強(qiáng)有力的研究工具。

crispr/cas9是一種rna介導(dǎo)的dna內(nèi)切酶，通過一個(gè)與目標(biāo)序列互補(bǔ)的單引導(dǎo)rna(singleguiderna，sgrna)引導(dǎo)定位到基因組的目標(biāo)序列上，此目標(biāo)序列必須與一個(gè)以ngg或nag形式的pam序列相鄰。crispr/cas9在與目標(biāo)序列結(jié)合后，在特定基因組區(qū)域產(chǎn)生雙鏈斷裂。從而激活機(jī)體的nhej(非同源末端連接，non-homologousendjoining)dna突變修復(fù)機(jī)制。在該修復(fù)機(jī)制下由于沒有模板，因此dna只是隨機(jī)修復(fù)以恢復(fù)其雙鏈結(jié)構(gòu)，這勢(shì)必會(huì)造成修復(fù)結(jié)果與原基因組序列不同形成突變—基因敲除。

crispr-cas9具有突變率高，操作簡單，成本低的特點(diǎn)。基于crispr-cas9的基因工程操作，可實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病關(guān)鍵基因的定向修飾，以實(shí)現(xiàn)減緩或治愈疾病的目的。

目前肺癌的治療方法主要有：手術(shù)治療、放療、化療和分子靶向治療。化療是一個(gè)相當(dāng)廣譜的治療方法，但是對(duì)病人的體質(zhì)有要求，體質(zhì)相對(duì)較差或者有合并癥的患者是化療的禁忌，且化療有一定的副作用。近幾年分子靶向治療的問世對(duì)這一點(diǎn)是比較大的突破，一些分子靶向藥物在肺癌的臨床治療上取得了效果，但是靶向治療不同于化療，有一個(gè)特定的獲益人群。隨著腫瘤分子生物學(xué)，腫瘤免疫學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，使得針對(duì)腫瘤的基因診斷、靶向治療逐漸成為可能，基因治療作為一種特異性強(qiáng)、靶向性好的新型臨床治療方法，越來越被廣大的肺癌醫(yī)學(xué)者所重視。

針對(duì)基因的靶向抑制，目前常用的sirna可有效地抑制基因表達(dá)，但是sirna的使用具有藥物的遞送效率低，要持續(xù)給藥，并不能夠徹底根治，而且用藥復(fù)雜，不適宜大規(guī)模推廣。zfns和talen技術(shù)表達(dá)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，而crispr-cas9具有更快速、簡便、高效、多位點(diǎn)、特異性靶向敲除基因的優(yōu)勢(shì)。目前未見同時(shí)敲除kras基因和egfr基因的crispr-cas9系統(tǒng)的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種同時(shí)敲除kras基因和egfr基因的crispr-cas9系統(tǒng)及其應(yīng)用，以解決現(xiàn)有技術(shù)的不足。

本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種同時(shí)敲除kras基因和egfr基因的crispr-cas9系統(tǒng)，包括特異性靶向kras基因的sgrna和特異性靶向egfr基因的sgrna；特異性靶向kras基因的sgrna對(duì)應(yīng)的dna序列如seqidno.1或/和seqidno.2所示，特異性靶向egfr基因的sgrna對(duì)應(yīng)的dna序列如seqidno.11或/和seqidno.12所示。

進(jìn)一步地，所述crispr-cas9系統(tǒng)還包括cas9。

進(jìn)一步地，特異性靶向kras基因的sgrna或特異性靶向egfr基因的sgrna和cas9存在同一質(zhì)粒中或分別存在質(zhì)粒中。

進(jìn)一步地，所述crispr-cas9系統(tǒng)還包括2種帶不同抗性標(biāo)記及熒光標(biāo)記的cas9骨架載體。

進(jìn)一步地，所述cas9骨架載體為有u6啟動(dòng)子表達(dá)的cas9骨架載體。

上述同時(shí)敲除kras基因和egfr基因的crispr-cas9系統(tǒng)在制備kras基因和egfr基因同時(shí)敲除的細(xì)胞模型或動(dòng)物模型中的應(yīng)用。

上述同時(shí)敲除kras基因和egfr基因的crispr-cas9系統(tǒng)在制備治療癌癥藥物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，所述癌癥包括肺癌、肝癌或胰腺癌。

本發(fā)明的有益效果：

1、本發(fā)明crispr-cas9系統(tǒng)可同時(shí)高效敲除在肺癌中高度表達(dá)的兩個(gè)癌癥驅(qū)動(dòng)因子kras及egfr，該系統(tǒng)操作簡單，敲除效率高，有望在肺癌的治療中得到應(yīng)用。egfr和kras是在肺癌、肝癌和胰腺癌等多種癌癥中都異常表達(dá)的基因，并參與著腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，本發(fā)明系統(tǒng)適用于egfr和kras異常表達(dá)的多種癌癥。

2、本發(fā)明通過質(zhì)粒改造，分別選用2個(gè)帶不同抗性標(biāo)記及熒光標(biāo)記的cas9骨架載體，通過共轉(zhuǎn)化方式實(shí)現(xiàn)雙基因同時(shí)敲除，加速基因敲除研究的進(jìn)程。

3、crispr-cas9系統(tǒng)操作簡單，靶位點(diǎn)選擇較多，且靶向精確，脫靶率低，敲除的效率可達(dá)90％以上。本發(fā)明選用crispr-cas9系統(tǒng)，相比較傳統(tǒng)打靶系統(tǒng)，操作簡便且打靶效率高。

附圖說明

圖1：crispr-cas9靶序列在kras基因中的位置。

圖2：crispr-cas9靶序列在egfr基因中的位置。

圖3：t7en1酶切電泳圖

其中，1號(hào)泳道和3號(hào)泳道是未處理組dna；2號(hào)泳道和4號(hào)泳道是處理組dna；m表示marker，從上到下條帶分別為600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp。

圖4：kras蛋白相對(duì)表達(dá)量。

圖5：egfr蛋白相對(duì)表達(dá)量。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做更進(jìn)一步地解釋。下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，但并不用來限定本發(fā)明的實(shí)施范圍。

實(shí)施例1

1.sgrna設(shè)計(jì)

根據(jù)genebank中給出的人kras基因序列(sequenceid:nm_033360.3)與egfr基因序列(sequenceid:nm_201282.1)分別設(shè)計(jì)10條sgrna(對(duì)應(yīng)的dna序列分別如seqidno.1-10所示和seqidno.11-20所示)。兩個(gè)基因的sgrna都靶定在其外顯子區(qū)域上，在ucsc或ncbi中用blast進(jìn)行比對(duì)，確保其靶序列的唯一性。分別設(shè)計(jì)的10條sgrna中，只有2條能有效地敲除kras和egfr，選取第一條kras-sg1(對(duì)應(yīng)的dna序列如seqidno.1所示)和egfr-sg1(對(duì)應(yīng)的dna序列如seqidno.11所示)進(jìn)行詳細(xì)講解，如圖1和圖2所示。

2.構(gòu)建sgrna的寡聚核苷酸雙鏈

將確定的kras靶序列上游引物5＇端添加cacc，下游引物5＇端添加aaac，這樣退火后形成的雙鏈dna粘性末端與px458-neo-gfp骨架載體經(jīng)bbsi酶切后形成的粘性末端互補(bǔ)，便于后期載體的構(gòu)建連接。載體px458-neo-gfp具有新霉素抗性及gfp熒光標(biāo)記。值得注意的是，靶序列的第一位堿基需為g，便于載體上u6啟動(dòng)子識(shí)別。

forwarcoigo→5′-caccnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3′

3′-nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnncaaa-5′←reverseoligo

將確定的egfr靶序列上游引物5＇端添加caccg，下游引物5＇端添加aaac，3′端加c，這樣退火后形成的雙鏈dna粘性末端與px260-puro-rfp骨架載體經(jīng)bbsi酶切后形成的粘性末端互補(bǔ)，便于后期載體的構(gòu)建連接。載體px260-puro-rfp具有嘌呤霉素抗性及rfp熒光標(biāo)記。值得注意的是，靶序列的第一位堿基需為g，便于載體上u6啟動(dòng)子識(shí)別。

forwardoligo→5′-caccgnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3′

3′-cnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnncaaa-5′←reverseoligo

將合成的sgrna寡聚核苷酸的forwardoligo和reverseoligo成對(duì)變性、退火，退火之后形成可以連入u6真核表達(dá)載體的雙鏈。將合成的上下游引物用1×annealbuffer溶解，使其濃度為100μm，分別取2.5μl的上下游引物混勻，加入1μlnebbuffer，4μl無菌水，按照如下touchdown程序退火，使其形成雙鏈dna，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

退火程序：

3.crispr載體構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶bbsi對(duì)載體進(jìn)行酶切，體系如表1所示：

表1

按順序加入200μl的pcr管中，37℃恒溫6h后，用濃度為0.8％的瓊脂糖凝膠電泳回收目的載體片段。

將上述純化的線性化質(zhì)粒與退火形成的雙鏈靶位點(diǎn)寡核苷酸重新連接形成特異性打靶載體px458-neo-gfp-kras-sg1和px260-puro-rfp-egfr-sg1。連接體系如下：雙鏈寡核苷酸0.2pmol，線性化質(zhì)粒20ng，10×t4連接酶緩沖液1μl，t4連接酶1μl，加水至10μl，22℃連接1.5小時(shí)。

將酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到100μl的dh5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布相應(yīng)抗性抗生素平板，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落用通用u6引物測(cè)序驗(yàn)證陽性克隆。

u6：atggactatcatatgcttaccgta

挑取陽性克隆37℃搖菌培養(yǎng)過夜，用試劑盒分別提取質(zhì)粒px458-neo-gfp-kras-sg1和px260-puro-rfp-egfr-sg1。

4.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞

接種a549細(xì)胞于6孔板，待細(xì)胞密度為70％，按照lipofectaminetm2000transfectionreagent(invitrogen,11668-019)的操作手冊(cè)，共轉(zhuǎn)染3μgpx458-neo-gfp-kras-sg1和3μgpx260-puro-rfp-egfr-sg1重組質(zhì)粒，6.5h后換液，加入新霉素和嘌呤霉素篩選培養(yǎng)48h后，收集存活細(xì)胞。

5.篩選同時(shí)敲除kras基因和egfr基因的a549穩(wěn)定細(xì)胞株。

流式細(xì)胞儀篩選：

將存活細(xì)胞進(jìn)行無菌流式分選，篩選出同時(shí)發(fā)綠色熒光和紅色熒光的細(xì)胞，并收集。

本實(shí)施例中，所用的載體可以替換為有u6啟動(dòng)子表達(dá)的cas9骨架載體，如px330等；所用的新霉素，嘌呤霉素可替換為除氨芐霉素以外的其他抗生素；且gfp和rfp可替換為其他不同熒光。

實(shí)施例2

t7en1酶切實(shí)驗(yàn)：

將實(shí)施例1收集的細(xì)胞進(jìn)行裂解，用試劑盒抽提基因組dna，最后溶于50μl去離子水中。

根據(jù)genbank公布的kras基因序列和egfr基因序列，用primer5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，如表2所示：

表2

用試劑盒提取部分細(xì)胞基因組dna，以上述提取的細(xì)胞基因組dna為模板，利用表2中設(shè)計(jì)的特異性引物擴(kuò)增目的片段。擴(kuò)增體系：2×pcrmix10μl，基因組dna1μl，上、下游引物各1μl，加ddh2o至20μl。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸35秒，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10分鐘；4℃保存。

取100ng純化后的pcr產(chǎn)物在nebbuffer2中變性、復(fù)性后，用t7核酸內(nèi)切酶(neb，m0302l)37℃孵育40min，然后用2％的瓊脂糖凝膠電泳分離。t7核酸內(nèi)切酶能夠識(shí)別不完全配對(duì)的雙鏈dna并進(jìn)行切割，如果crispr-cas9對(duì)靶點(diǎn)造成了突變，將能夠被該酶識(shí)別并造成雙鏈dna斷裂。因此，電泳后顯示除pcr以外的其他條帶說明靶點(diǎn)dna存在突變。如圖3所示，處理組經(jīng)酶切后均出現(xiàn)了2條新的條帶，說明處理組確實(shí)引入了突變。將上述步驟獲得的pcr純化回收產(chǎn)物進(jìn)行ta克隆，步驟：取1ul產(chǎn)物與pmd19-tvector連接并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞dh5α，挑取單克隆以通用引物u6序列atggactatcatatgcttaccgta測(cè)序，確保得到穩(wěn)定敲除kras和egfr的a549突變株。

實(shí)施例3

免疫印跡實(shí)驗(yàn)：

將肺癌細(xì)胞kras和egfr敲除前后的細(xì)胞各取1x10⁶細(xì)胞，收集后加入20μl裂解液(50mmhepes，ph7.0，1％np-40，5mmedta，450mmnacl，10mmnapyrophosphate和50mmnaf)，裂解液中加入各種新鮮抑制劑(1mmnaorthovanadate，1mmpmsf，10μg/mlaprotinin，leupeptin，胃酶抑素)。室溫下超聲處理后加入1％巰基乙醇，100℃中放置5min煮沸變性，在sds-page膠中，每孔上樣10μl。電泳后轉(zhuǎn)膜將蛋白樣品轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用tbst洗膜一次，用5％脫脂奶粉封閉1小時(shí)，用tbst洗膜一次，將稀釋后的一抗與膜室溫雜交2小時(shí)或4℃過夜。用ttbs洗滌三次后將稀釋后的二抗與膜室溫雜交1小時(shí)，用tbst洗膜3次，加入ecl顯影試劑顯色，用蛋白灰度分析軟件分析結(jié)果。

圖4和圖5定量分析結(jié)果顯示，與未處理組相比，處理組kras的相對(duì)蛋白表達(dá)量為0.107±0.025，egfr的相對(duì)蛋白表達(dá)量為0.081±0.023，表示egfr和kras蛋白表達(dá)都被有效地抑制了。

實(shí)施例4

增殖實(shí)驗(yàn)：

將肺癌細(xì)胞kras和egfr敲除前后的細(xì)胞分別接種于96孔板中，另設(shè)只有培養(yǎng)液的空白組，每組設(shè)6個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)24h、48h、72h后每孔加入20μlmtt溶液，37℃孵育2h，酶標(biāo)儀上讀取每孔460nm吸光度值，并計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。數(shù)據(jù)以表示，采用spss16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩者比較采用t檢驗(yàn)，p＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果如表3所示：

表3

注：*與a549-con相比，p＜0.05

mtt法測(cè)定細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：單獨(dú)抑制kras的表達(dá)(a549-kras組)或單獨(dú)抑制egfr(a549-egfr組)的表達(dá)，細(xì)胞的增殖都會(huì)受到抑制；kras和egfr被同時(shí)沉默后(a549-double組)，a549的細(xì)胞增殖明顯受到抑制。

sequencelisting

<110>浙江衛(wèi)未生物醫(yī)藥科技有限公司

<120>一種同時(shí)敲除kras基因和egfr基因的crispr-cas9系統(tǒng)及其應(yīng)用

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