本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種多肽，尤其涉及一種多肽及其組成的疫苗和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

阿爾茨海默病(alzheimer’sdisease,ad)是一種嚴(yán)重威脅老年人生命健康的以記憶力下降為特征的神經(jīng)退行性疾病，腦內(nèi)病理特征主要表現(xiàn)為由β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，aβ)在神經(jīng)元細(xì)胞外形成的老年斑和由tau蛋白在神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，截止到2015年底，全世界共有4600多萬(wàn)癡呆病人，預(yù)計(jì)到2050年這一數(shù)字會(huì)增長(zhǎng)至1億3千萬(wàn)。隨著全球性的人口老齡化，ad的發(fā)病率及患病人數(shù)近年來(lái)呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)。然而，目前尚無(wú)特異性治療ad的藥物，因此研發(fā)能夠有效防治ad的藥物異常迫切。

研究表明，由aβ單體聚集成的寡聚體是ad發(fā)生的初始誘因，aβ寡聚體可誘發(fā)一系列毒性級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括誘發(fā)tau蛋白的聚集等，最終導(dǎo)致ad的發(fā)生。aβ是由其前體蛋白app經(jīng)順序性酶切而產(chǎn)生的多肽片段，app及aβ單體具有正常的生理功能，能夠抑制神經(jīng)突觸的過(guò)度活化而減少突觸興奮性毒性產(chǎn)生。只有當(dāng)各種因素導(dǎo)致aβ產(chǎn)生和清除之間不平衡，導(dǎo)致aβ累積后發(fā)生聚集，形成aβ寡聚體，便會(huì)引發(fā)一系列不可逆轉(zhuǎn)的ad病理變化。

因此，靶向aβ的藥物可能是治療ad的突破口。其中，利用aβ疫苗的免疫治療發(fā)展迅速。目前已有多種aβ疫苗經(jīng)歷過(guò)治療ad的臨床試驗(yàn)，包括an1792，cad106，acc001，ub311，affitopead02等。這些aβ疫苗在臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段都表現(xiàn)出良好的治療效果，能夠減少老年斑形成并改善動(dòng)物認(rèn)知水平。但在ad臨床試驗(yàn)中由于嚴(yán)重的副作用或者治療效果欠佳，至今仍沒(méi)有一種疫苗或者抗體通過(guò)iii期臨床試驗(yàn)。an1792是由合成的人源aβ1-42多肽在體外聚集而成，使用qs-21作為免疫佐劑，在臨床ii期試驗(yàn)中由于引發(fā)了嚴(yán)重的腦膜炎等副作用而被迫終止臨床試驗(yàn)。隨后分析表明，aβ42本身攜帶的t細(xì)胞表位引發(fā)的t細(xì)胞反應(yīng)是引發(fā)腦膜炎的主要原因。隨后，cad106，acc001，ub311，affitopead02等第二代aβ疫苗在設(shè)計(jì)時(shí)主要是以aβ42n端的b細(xì)胞表位片段作為半抗原偶聯(lián)至載體，制備疫苗。它們的特點(diǎn)是去除了aβ42的t細(xì)胞表位區(qū)，從而減少aβ導(dǎo)致的t細(xì)胞活化，以達(dá)到減少炎癥反應(yīng)的效果。

但是，系統(tǒng)的分析可以發(fā)現(xiàn)，目前所研發(fā)的aβ疫苗都不是特異性地針對(duì)致病性的aβ寡聚體。以aβ全長(zhǎng)或者aβ的n端b細(xì)胞表位區(qū)制備的疫苗免疫產(chǎn)生的抗體可同時(shí)結(jié)合aβ單體、寡聚體和纖維以及app。這或許降低有限的抗體靶向寡聚體的能力。再者，靶向具有正常生理功能的aβ和app可導(dǎo)致副作用的發(fā)生，這種副作用可部分或全部抵消抗體或疫苗的治療作用。

基于以上分析，如何找到一種能夠特異針對(duì)致病性aβ寡聚體的疫苗可能起到較好的治療ad的作用是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種多肽及其組成的疫苗和應(yīng)用，該多肽為aβ42寡聚體的構(gòu)象模擬表位，其免疫產(chǎn)生的抗體能夠特異性的靶向致病性的aβ寡聚體，而不與aβ單體及app蛋白結(jié)合，能夠有效地減少aβ疫苗的自身免疫問(wèn)題，具有較好的治療ad前景。

為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供了一種多肽，所述的多肽的氨基酸序列如seqidno.1所示或具有所述多肽功能的對(duì)seqidno.1所示的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加修飾的變體。

所述seqidno.1所示的氨基酸序列如下：arg-pro-asp-gln-val-met-trp-asp-ser-lys-arg-pro。

本發(fā)明中，所述的變體為具有和seqidno.1所述多肽相同的功能，夠特異性地識(shí)別aβ寡聚體，而不識(shí)別aβ單體和纖維及app蛋白，示例性地，所述突變體可以為所述多肽序列中的賴(lài)氨酸殘基和精氨酸殘基中的一個(gè)或多個(gè)突變?yōu)槠渌麕д姷陌被釟埢@得的變體。

根據(jù)本發(fā)明，所述多肽有多個(gè)拷貝數(shù)的時(shí)候也具有所述單個(gè)拷貝數(shù)的功能，所述多肽的拷貝數(shù)為1-10，例如可以是1、2、3、4、5、6或7，優(yōu)選為1-7。

第二方面，本發(fā)明提供一種dna片段，其包含編碼第一方面所述多肽的核酸序列。

第三方面，本發(fā)明提供一種重組質(zhì)粒，所述重組質(zhì)粒包含至少一個(gè)拷貝的如第二方面所述的dna片段。

根據(jù)本發(fā)明，所述重組質(zhì)粒為pctcon2載體。

第四方面，本發(fā)明提供一種重組酵母細(xì)胞，所述重組酵母細(xì)胞包含第三方面所述的重組載體。

根據(jù)本發(fā)明，所述重組酵母細(xì)胞為eby100釀酒酵母細(xì)胞。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所述多肽只有以釀酒酵母為載體才可以讓所述多肽的功能得以實(shí)現(xiàn)，采用別的大腸桿菌或是別的重組細(xì)胞不能實(shí)現(xiàn)所述多肽的功能，不僅如此，本發(fā)明采用eby100釀酒酵母細(xì)胞作為載體，可以最大程度的發(fā)揮多肽的功能，所述eby100釀酒酵母細(xì)胞與所述多肽能夠協(xié)同增效，進(jìn)一步提高多肽的功效。

第五方面，本發(fā)明提供一種疫苗，所述疫苗包含如第一方面所述的多肽、第二方面所述的dna片段、第三方面所述的重組載體或第四方面所述的重組酵母細(xì)胞中的任意一種或至少兩種的組合。

根據(jù)本發(fā)明，所述疫苗還包括藥學(xué)上接受的輔料。

優(yōu)選地，所述輔料為賦形劑、稀釋劑、載體、調(diào)味劑、粘合劑和填充劑中的任意一種或至少兩種的組合。

根據(jù)本發(fā)明，所述疫苗在制備治療阿爾茨海默病(ad)的藥物中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明所述多肽通過(guò)pctcon2載體表達(dá)在eby100釀酒酵母細(xì)胞后并展示在細(xì)胞表面制備的全酵母疫苗免疫阿爾茨海默病模型小鼠(app/ps1小鼠)，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生抗aβ42寡聚體的抗體，并且這些抗體不與aβ42單體結(jié)合，與aβ42纖維結(jié)合較弱；

(2)本發(fā)明所述多肽明顯降低小鼠腦內(nèi)的老年斑和aβ水平，尤其是aβ42寡聚體水平，降低小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，改善ad小鼠的認(rèn)知功能損傷，并且不誘發(fā)aβ42特異性的t細(xì)胞活化和腦部微出血現(xiàn)象的發(fā)生；

(3)本發(fā)明多肽為aβ42寡聚體的構(gòu)象模擬表位，其免疫產(chǎn)生的抗體能夠特異性的靶向致病性的aβ寡聚體，而不與aβ單體及app蛋白結(jié)合，能夠有效地減少aβ疫苗的自身免疫問(wèn)題，具有較好的治療ad前景。

附圖說(shuō)明

圖1為aoe1表位多肽的表達(dá)與展示，其中，圖1(a)流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)eby100酵母展示表位多肽情況，圖1(b)激光共聚焦顯微鏡分析檢測(cè)eby100酵母展示表位多肽情況；

圖2為aoe1疫苗免疫app/ps1小鼠后抗體水平分析，其中，圖2(a)aoe1免疫app/ps1小鼠血清中抗表位多肽igg滴度動(dòng)力學(xué)，圖2(b)抗aβ42寡聚體igg滴度動(dòng)力學(xué)，圖2(c)aoe1免疫app/ps1血清中抗aβ寡聚體igg亞型分析；

圖3為aoe1免疫抗體與不同聚集狀態(tài)aβ的結(jié)合特性分析，其中，圖3(a)elisa驗(yàn)證aoe1免疫抗體與不同聚集狀態(tài)aβ的結(jié)合，圖3(b)dot-blot檢測(cè)aoe1免疫抗體與不同聚集狀態(tài)的aβ結(jié)合，圖3(c)western-blot檢測(cè)aoe1免疫抗體與aβ的結(jié)合，圖3(d)免疫組織化學(xué)檢測(cè)aoe1；

圖4為新物體識(shí)別及y迷宮系統(tǒng)檢測(cè)aoe1免疫治療ad小鼠后的認(rèn)知改善情況，ad小鼠免疫治療結(jié)束2周后，利用新物體識(shí)別系統(tǒng)和y迷宮系統(tǒng)評(píng)價(jià)小鼠的認(rèn)知與記憶能力，其中，圖4(a)新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)中小鼠對(duì)新舊物體的探索次數(shù)統(tǒng)計(jì)(新物體探索次數(shù)與舊物體探索次數(shù)相比，*p<0.05)，圖4(b)小鼠對(duì)新物體的偏好指數(shù)統(tǒng)計(jì)分析(與ad對(duì)照組相比，*p<0.05)，圖4(c)y-迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試期小鼠在新臂的停留時(shí)間，圖4(d)新臂選擇次數(shù)(與ad對(duì)照組相比，*p<0.05)；

圖5為aoe1免疫治療對(duì)ad小鼠腦內(nèi)aβ老年斑的影響，其中，圖5(a)a，c、ths染色檢測(cè)ad小鼠腦中的老年斑，圖5(c)4g8免疫組化檢測(cè)ad小鼠腦中的老年斑，圖5(b)對(duì)ths染色結(jié)果的量化統(tǒng)計(jì)分析，圖5(d)4g8免疫組化結(jié)果的量化統(tǒng)計(jì)分析(與ad對(duì)照組相比，*p<0.05)；

圖6為aoe1免疫治療對(duì)ad小鼠的腦組織中aβ水平的影響，其中，圖6(a)-圖6(d)動(dòng)物行為學(xué)結(jié)束后，小鼠麻醉灌流后取腦，利用ripa裂解液及鹽酸胍研磨腦組織分別獲得可溶性及不可溶性腦組織提取液，利用aβelisa檢測(cè)試劑盒測(cè)定aβ水平，圖6(a)可溶性aβ40水平，圖6(b)不可溶性aβ40水平，圖6(c)可溶性aβ42水平，圖6(d)不可溶性aβ42水平(與ad對(duì)照組相比，*p<0.05)，圖6(e)ripa可溶性腦組織提取液經(jīng)12％sds-page、轉(zhuǎn)膜印跡后，利用aβ單克隆抗體4g8檢測(cè)aβ蛋白水平，β-actin作為上樣內(nèi)參，圖6(f)wb結(jié)果量化統(tǒng)計(jì)分析(與ad對(duì)照組相比，*p<0.05)；

圖7為aoe1免疫治療對(duì)于ad小鼠腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響，其中，圖7(a)利用gfap單克隆抗體通過(guò)免疫組化染色檢測(cè)小鼠腦組織切片中皮層區(qū)及海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化情況，圖7(b)星形膠質(zhì)細(xì)胞免疫組化結(jié)果量化分析,圖7(c)利用cd11b單克隆抗體通過(guò)免疫組化染色檢測(cè)小鼠腦組織切片中皮層區(qū)及海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況，圖7(d)小膠質(zhì)細(xì)胞免疫組化結(jié)果量化分析(與ad對(duì)照組相比，*p<0.05)；

圖8為aoe1免疫ad小鼠后t細(xì)胞活化和腦部微出血情況檢測(cè)，其中，圖8(a)aoe1免疫ad小鼠結(jié)束后后，取小鼠脾臟細(xì)胞，分別以不同物質(zhì)再次刺激，應(yīng)用elispot檢測(cè)γ干擾素的分泌，圖8(b)aoe1免疫ad小鼠結(jié)束后后，取小鼠脾臟細(xì)胞，分別以不同物質(zhì)再次刺激，應(yīng)用elispot檢測(cè)白介素4的分泌，圖8(c)利用普魯士藍(lán)染色檢測(cè)小鼠腦組織切片中微出血情況。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施方式來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明了，所述實(shí)施例僅僅是幫助理解本發(fā)明，不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明的具體限制。

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中的pbs緩沖液ph值為7.4的緩沖液，配方為：9gnacl，5.73gna2hpo4·12h2o，0.62gnah2po4·2h2o，用水配成1升，調(diào)ph為7.4。

下述實(shí)施例中aoe1的表位多肽由吉爾生化(上海)有限公司合成制備。用于實(shí)驗(yàn)的aoe1表位多肽純度為大于或等于95％，表位多肽保存于-20℃，避免反復(fù)凍融。

下述實(shí)施例中的所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析采用graphpadprism軟件或/和student’st-test進(jìn)行，以p<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

下述實(shí)施例中的所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都是通過(guò)3次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)獲得的，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析是應(yīng)用one-wayanova軟件進(jìn)行，對(duì)于多組重復(fù)記憶力測(cè)定數(shù)據(jù)的比較分析則應(yīng)用重復(fù)數(shù)據(jù)的two-wayanova。

實(shí)施例1多肽的制備

(1)將aoe1表位多肽插入aga2蛋白的c末端，進(jìn)行全基因合成，其中，aβ1-15片段的基因作為陽(yáng)性對(duì)照，pctcon2空載體作為陰性對(duì)照；

所述aoe1表位多肽的核酸序列如seqidno.2所示，所述seqidno.2所示的核酸序列如下：

seqidno.2：

cgtccggatcaggtgatgtgggatagcaaacgtccg

再用ndeⅰ和xhoi雙酶切pctcon2質(zhì)粒，將酶切后的載體pctcon2與aoe1表位多肽進(jìn)行融合表達(dá)，得到重組載體。

實(shí)施例2多肽的制備

相比于實(shí)施例1，除了增加了aoe1表位多肽的拷貝數(shù)，所述aoe1表位多肽的拷貝數(shù)為7之外，其他條件與實(shí)施例1相同。

制備得到的多肽的效果與實(shí)施例1類(lèi)似，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)采用實(shí)施例1制備的多肽進(jìn)行。

實(shí)施例3疫苗的制備

(1)酵母感受態(tài)細(xì)胞制備

將釀酒酵母eby100按1：100接種于50mlypd液體培養(yǎng)基中，于30℃、260rpm振蕩培養(yǎng)4-6h至對(duì)數(shù)前期；室溫6000rpm離心10min；棄上清后用25ml重懸緩沖液重懸，轉(zhuǎn)移至250ml搖瓶中，于30℃振蕩培養(yǎng)10min；室溫6000rpm離心10min，棄上清；用25ml無(wú)菌水重懸，于室溫6000rpm離心10min，棄上清；用1ml無(wú)菌水重懸，即為感受態(tài)細(xì)胞；

(2)酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化與鑒定

取1μl構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒加入100μl酵母感受態(tài)細(xì)胞中，冰上孵育5min后，進(jìn)行電轉(zhuǎn)。電轉(zhuǎn)結(jié)束立即加入1mlypd培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至1.5mlep中，于30℃、260rpm振蕩培養(yǎng)1h。培養(yǎng)結(jié)束后，將所有酵母細(xì)胞涂布于sd-trp選擇性培養(yǎng)基平板上，倒置放于濕盒中,于30℃靜置培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束后，挑選單克隆并劃線(xiàn)至ypd培養(yǎng)基平板中，倒置于濕盒中，30℃靜置培養(yǎng)24h，再次獲得單克隆。挑選單克隆涂布于ypd培養(yǎng)基平板中，30℃靜置培養(yǎng)24h，以富集酵母。隨后進(jìn)行酵母印跡實(shí)驗(yàn)，將整板印跡轉(zhuǎn)移至sd-trp選擇性培養(yǎng)基平板中，于30℃靜置培養(yǎng)24h；

(3)酵母細(xì)胞展示表位多肽的誘導(dǎo)表達(dá)

挑單克隆至sdcaa液體培養(yǎng)基中，于30℃培養(yǎng)過(guò)夜；將過(guò)夜菌按照1：100接種至sdcaa培養(yǎng)基中，30℃、260rpm振蕩培養(yǎng)8h至對(duì)數(shù)期；于室溫6000rpm離心10min，棄上清；用與sdcaa同樣體積的sgcaa培養(yǎng)基重懸酵母細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至搖瓶中，于30℃、260rpm振蕩培養(yǎng)72h；室溫6000rpm離心10min收集酵母沉淀；無(wú)菌pbs清洗2遍；再用pbs重懸。此即為展示表位多肽的酵母細(xì)胞；

(4)酵母細(xì)胞滅活

將上步獲得的酵母細(xì)胞于56℃滅活1h后，室溫6000rpm離心10min；棄上清，無(wú)菌pbs清洗2遍；此即為滅活的酵母細(xì)胞。加入等體積30％甘油，凍存于-80℃冰箱中備用。同時(shí)，取部分酵母細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)表位多肽的檢測(cè)；

(5)酵母細(xì)胞表達(dá)表位多肽檢測(cè)

利用流式細(xì)胞儀對(duì)獲得的酵母菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)后取1×10⁶個(gè)酵母細(xì)胞重懸于100μl3％bsa中；按照1:100加入鼠源抗c-myc抗體(9e10)，4℃靜置作用30分鐘；pbs洗三遍；按照1:100加入fitc標(biāo)記的羊抗鼠二抗，4℃靜置作用30分鐘；pbs洗三遍；流式細(xì)胞儀檢測(cè)。同時(shí)，取10μl標(biāo)記好的酵母菌體滴于載玻片上，加上蓋玻片后，封片進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡觀察。

結(jié)果如圖1所示，圖1(a)結(jié)果表明，表達(dá)展示aoe1表位多肽和aβ15的酵母細(xì)胞可利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)到明顯的熒光信號(hào)，eby100轉(zhuǎn)化空白pet載體則無(wú)任何熒光信號(hào)產(chǎn)生；圖1(b)結(jié)果表明，利用激光共聚焦顯微鏡可明顯觀察到aoe1表位多肽和aβ15很好地展示于酵母細(xì)胞表面，eby100轉(zhuǎn)化空白pet載體則無(wú)任何熒光信號(hào)產(chǎn)生。

實(shí)施例4aoe1誘導(dǎo)app/ps1小鼠產(chǎn)生抗aβ42寡聚體抗體

實(shí)驗(yàn)方法：

(1)動(dòng)物及免疫：將6月齡大的雄性app/ps1小鼠(華阜康生物公司，中國(guó))隨機(jī)分為對(duì)照組-即注射轉(zhuǎn)化空白pet質(zhì)粒eby100(control)，aoe1疫苗組(aoe1)和陽(yáng)性對(duì)照組-即展示aβ1-15片段的eby100酵母細(xì)胞(aβ15)，每組8只。同時(shí)以8只年齡相同的雄性c57bl/6j小鼠作為野生對(duì)照組(wt)，野生對(duì)照組以注射pbs作為對(duì)照(華阜康生物公司，中國(guó))。

將上述四組小鼠進(jìn)行如下處理：

以?xún)芍芤淮蔚拈g隔分別在第0、14、28、42、56、70、84、98天對(duì)小鼠進(jìn)行皮下注射。疫苗組每只小鼠每次注射6×10⁷個(gè)酵母細(xì)胞。野生對(duì)照組注射等體積的酵母注射液。

(2)抗體滴度測(cè)定：分別在免疫前、第二次及后續(xù)每次免疫后第十天尾靜脈取血，將取出的血液于37℃靜置2小時(shí)后，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，取上層血清，分裝待用。

(3)將100μl表位多肽或者aβ42寡聚體包被96孔酶聯(lián)免疫微孔板(aβ42寡聚體每孔包被0.5μg，多肽每孔包被1μg)，bsa為陰性對(duì)照，置4℃包被過(guò)夜，以pbs洗板3次；以3％bsa37℃封閉2小時(shí)，350μl/孔。以pbs洗板2次，加入以3％bsa梯度稀釋的小鼠血清100μl，室溫孵育1小時(shí)后用含有0.05％tween-20的pbs洗滌8次。每孔加入hrp標(biāo)記的山羊抗小鼠igg(1:3000)，室溫孵育1小時(shí)后，用含有0.05％tween-20的pbs洗滌6次。每孔加入底物溶液tmb100μl，放置37℃20分鐘，然后每孔加入100μl1mm硫酸終止反應(yīng)，于酶標(biāo)儀上測(cè)定od值(波長(zhǎng)450nm)，在相同的條件下重復(fù)三次。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，抗表位多肽的抗體滴度如圖2(a)所示，對(duì)照組在免疫前和數(shù)次免疫后的抗體滴度都為0；aoe1疫苗在免疫前抗表位多肽的抗體滴度為0，在免疫六次后抗體滴度達(dá)到平臺(tái)期，約為1：24000；

抗aβ42寡聚體的抗體滴度如圖2(b)所示，對(duì)照組在免疫前的抗體滴度為0；在免疫第五次后產(chǎn)生抗體，滴度約1：50，并且達(dá)到平臺(tái)期；aoe1疫苗在免疫前抗aβ42寡聚體的抗體滴度為0，在免疫三次后開(kāi)始出現(xiàn)抗體，滴度約1：50；免疫七次后抗體滴度達(dá)到平臺(tái)期，約:1：800；aβ15組免疫前抗體滴度為0，在免疫五次后抗體水平達(dá)到平臺(tái)期，約為1：24000。

抗aβ42寡聚體的抗體分型如圖2(c)所示，aoe1疫苗產(chǎn)生的抗aβ42寡聚體的igg亞型:，其產(chǎn)生的抗體主要是th2型的igg1類(lèi)抗體，而igg2a、igg2b、igg3的含量較少。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，aoe1疫苗免疫app/ps1轉(zhuǎn)基因小鼠能夠產(chǎn)生抗aβ42寡聚體的抗體，并且這種抗體主要是th2型的igg1類(lèi)抗體。

實(shí)施例5aoe1疫苗免疫產(chǎn)生的抗體能特異性地識(shí)別aβ42寡聚體，而不與aβ42單體結(jié)合

(1)elisa測(cè)定aoe1免疫血清與不同聚集狀態(tài)aβ42的結(jié)合：aβ42按照1mg/ml的濃度加入dmso后，于渦旋震蕩儀上渦旋溶解3min，再用合適的移液器吹打2min，當(dāng)吹打溶解至管壁不再沾液滴時(shí)，用預(yù)冷的pbs稀釋至0.01mg/ml，此液體為單體aβ溶液。aβ42以dmso溶解至2mg/ml，以pbs稀釋至0.4mg/ml，37℃靜置孵育2h，此液體為aβ寡聚體溶液。aβ42以dmso溶解至2mg/ml，以pbs稀釋至0.4mg/ml，37℃靜置孵育7day，于12000rpm離心30min，取沉淀重新溶于適當(dāng)體積的pbs中，此即為aβ纖維。將不同聚集狀態(tài)的aβ包被于96孔板中(0.5μg/孔)，封閉后，將對(duì)照組免疫七次后的血清按照1:100稀釋后用于檢測(cè)；將aoe1免疫七次后的血清按照1:100稀釋后用于檢測(cè)；將aβ15免疫七次后的血清按照1:2000稀釋后用于檢測(cè)；4g8抗體按照1:3000稀釋后用于檢測(cè)。

(2)dot-blot測(cè)定aoe1免疫血清與不同聚集狀態(tài)aβ42的結(jié)合：將不同聚集狀態(tài)的aβ點(diǎn)樣至nc膜上，封閉后，將對(duì)照組免疫七次后的血清按照1:100稀釋后用于檢測(cè)；將aoe1免疫七次后的血清按照1:100稀釋后用于檢測(cè)；將aβ15免疫七次后的血清按照1:2000稀釋后用于檢測(cè)；4g8抗體按照1:3000稀釋后用于檢測(cè)。

(3)western-blot測(cè)定aoe1免疫血清與不同聚集狀態(tài)aβ42的結(jié)合：利用7pa2細(xì)胞裂解液混合aβ42單體制備電泳樣品后進(jìn)行4-12％sds-page，轉(zhuǎn)膜封閉后，將對(duì)照組免疫七次后的血清按照1:100稀釋后用于檢測(cè)；將aoe1免疫七次后的血清按照1:100稀釋后用于檢測(cè)；將aβ15免疫七次后的血清按照1:2000稀釋后用于檢測(cè)；4g8抗體按照1:3000稀釋后用于檢測(cè)。

(4)免疫組織化學(xué)測(cè)定aoe1免疫血清與內(nèi)源性aβ的結(jié)合：利用12月齡app/ps1轉(zhuǎn)基因小鼠的腦組織切片進(jìn)行了免疫組化分析，在同一張腦組織切片中，利用aoe1免疫血清(免疫七次后，1:100稀釋)和ths染色同時(shí)標(biāo)記后，在腦組織切片的同一位置進(jìn)行白光和熒光觀察。同時(shí)，另外一張腦片使用4g8抗體(1:100稀釋)和ths染色同時(shí)標(biāo)記后，在腦組織切片的同一位置進(jìn)行白光和熒光觀察。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，elisa結(jié)果如圖3(a)所示，對(duì)照組免疫血清不能識(shí)別任何形式的aβ42；

aoe1免疫血清與aβ42寡聚體結(jié)合力最高，與aβ42單體沒(méi)有結(jié)合，與aβ42纖維結(jié)合較弱；aβ15免疫血清和4g8抗體相似，與不同聚集形式的aβ42結(jié)合力相當(dāng)。

dot-blot結(jié)果如圖3(b)所示，對(duì)照組免疫血清不能識(shí)別任何形式的aβ42；aoe1免疫血清與aβ42寡聚體結(jié)合力最高，不識(shí)別aβ42單體，與aβ42纖維結(jié)合較弱；

aβ15免疫血清和4g8抗體相似，可識(shí)別不同聚集形式的aβ42。

western-blot結(jié)果如圖3(c)所示，對(duì)照組免疫血清不能識(shí)別任何形式的aβ42；aoe1免疫產(chǎn)生的aβ抗體主要結(jié)合35-130kd大小之間的aβ寡聚體，而不結(jié)合單體及較大聚集體；aβ15免疫產(chǎn)生的抗體與4g8抗體相似，可結(jié)合所有的aβ形式。

免疫組織化學(xué)結(jié)果如圖3(d)所示，aoe1免疫血清中的抗體能夠識(shí)別腦組織中彌散型的淀粉樣沉積，但不識(shí)別ths陽(yáng)性的致密型斑塊；而4g8抗體則可同時(shí)識(shí)別彌散型和致密型的淀粉樣斑塊。

結(jié)果表明，aoe1免疫產(chǎn)生的aβ抗體主要結(jié)合寡聚體，而不與單體及高度聚集的纖維及斑塊結(jié)合，顯示出良好的特異性。

實(shí)施例6aoe1疫苗免疫改善ad小鼠認(rèn)知損傷

(1)新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)：利用50x50x30cm的空曠的活動(dòng)箱，箱中特定位置上放置有a、b兩個(gè)物體，將小鼠放置箱中讓其自由探索5min。第一天為訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)，a、b兩個(gè)物體完全一樣。將小鼠放置箱中記錄小鼠對(duì)a、b兩個(gè)物體的觸碰次數(shù)(小鼠鼻子或嘴巴觸及物體算作一次有效碰觸)。5min結(jié)束后，將小鼠放回飼養(yǎng)盒中，將活動(dòng)盒擦洗干凈，進(jìn)行第二只小鼠檢測(cè)，步驟同上。第二天為檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，即24小時(shí)后，將場(chǎng)地內(nèi)的a或者b物體換做一個(gè)新的物體c，c物體與a、b物體的形狀和顏色都不同。同樣，將小鼠放置入活動(dòng)箱中分別記錄小鼠對(duì)兩個(gè)物體的探索次數(shù)。5min后，取出第一只小鼠，將活動(dòng)盒擦洗干凈，放置第二只小鼠開(kāi)始試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，統(tǒng)計(jì)分析小鼠對(duì)于新舊物體的探索次數(shù)及鑒別指數(shù)(di，discriminationindex)。di＝(tn-tf)/(tn+tf)，其中tn為新物體的探索時(shí)間，tf為舊物體探索時(shí)間。

(2)y-迷宮實(shí)驗(yàn)：y迷宮由三個(gè)完全相同的臂組成。各個(gè)臂夾角120度，每一臂尺寸為30×8×15cm(長(zhǎng)×寬×高)，在中央處各有一個(gè)可移動(dòng)的隔板，迷宮各臂內(nèi)貼有不同的幾何圖形，作為視覺(jué)標(biāo)記。y迷宮的3個(gè)臂被隨機(jī)設(shè)為：新異臂(novelarm)、起始臂(startarm)和其他臂(otherarm)，迷宮上方1.5m處安置攝像機(jī)，記錄小鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡。y迷宮實(shí)驗(yàn)包含兩個(gè)階段，間隔1h。第一階段為訓(xùn)練期，將新異臂用隔板擋住后，將小鼠由起始臂放入，使其在起始臂和其他臂中自由活動(dòng)10min，訓(xùn)練結(jié)束后，將小鼠放回飼養(yǎng)籠。將迷宮設(shè)備擦洗干凈后，進(jìn)行第二只小鼠訓(xùn)練。1h后進(jìn)行第二階段實(shí)驗(yàn)。第二個(gè)階段為檢測(cè)期，打開(kāi)新異臂隔板，同樣，將小鼠由起始臂放入，使其在3個(gè)臂中自由活動(dòng)5min。記錄5min內(nèi)小鼠在各個(gè)臂的停留時(shí)間和穿梭次數(shù)。檢測(cè)結(jié)束后，擦洗y迷宮設(shè)備去除小鼠殘留氣味，進(jìn)行第二只小鼠檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示：新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4(a)-圖4(b)所示：aoe1免疫的ad小鼠對(duì)新物體的探索次數(shù)則明顯多于舊物體(與舊物體的探索次數(shù)相比，p<0.05)；aoe1治療組小鼠對(duì)新物體的偏好指數(shù)也明顯高于ad對(duì)照組(與ad對(duì)照組相比，p<0.05)。

y-迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4(c)-圖4(d)所示：aoe1免疫的ad小鼠在新臂的停留時(shí)間和對(duì)新臂的探索次數(shù)明顯都明顯提高(與ad對(duì)照組相比，p<0.05)。

結(jié)果表明，aoe1免疫治療能夠改善ad小鼠的認(rèn)知能力，降低記憶損傷。

實(shí)施例7aoe1疫苗免疫治療減少ad小鼠腦部的aβ沉積

(1)動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每只小鼠通過(guò)腹腔注射250μl2％戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉；麻醉后，心臟灌注4℃預(yù)冷的含肝素(10u/ml)的pbs；斷頭取腦，腦組織沿矢狀面一分為二。一半大腦置于4％多聚甲醛溶液中，4℃固定24h，依次用10％、20％、30％蔗糖梯度脫水。脫水結(jié)束后，oct包埋劑包埋，利用冰凍切片機(jī)切片，腦切片厚度為20μm，用于后續(xù)的免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)。

(2)ths染色：將冰凍腦組織切片于室溫下復(fù)溫30min；pbs洗滌3次，每次5min；將ths染色液(1mg/ml,70％乙醇配制)滴在腦片上染色5min；70％乙醇脫色5min；pbs洗滌3次，每次5min；封片后利用熒光顯微鏡觀察。

(3)免疫組化檢測(cè)老年斑：腦組織冰凍切片平鋪放置在組化盒中，室溫復(fù)溫30min；pbs洗滌3次，每次5min；80％甲醇(內(nèi)含0.3％h2o2)浸泡20min，消除內(nèi)源性的過(guò)氧化物酶；pbs洗滌3次，每次5min；用含0.3％triton-x的10％山羊血清封閉液于室溫封閉2h；加4g8(1:100稀釋)，4℃作用過(guò)夜；pbs洗滌3次，每次5min；加hrp標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體(1:100稀釋)，室溫作用1h；pbs洗滌4次，每次5min；dab室溫染色1min；流水終止染色，封片后進(jìn)行觀察。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，ths染色結(jié)果如圖5(a)-圖5(b)所示，aoe1免疫治療后，ad小鼠腦內(nèi)老年斑數(shù)量明顯減少(與ad對(duì)照組相比，*p<0.05)

免疫組化檢測(cè)老年斑結(jié)果如圖5(c)-圖5(d)所示，aoe1免疫治療后，aβ斑塊數(shù)量明顯減少(與ad對(duì)照組相比，*p<0.05)

結(jié)果說(shuō)明aoe1疫苗免疫治療能夠減少ad小鼠腦內(nèi)aβ沉積水平。

實(shí)施例8aoe1疫苗免疫減少ad小鼠腦內(nèi)的aβ水平

(1)腦組織提取液中aβ水平測(cè)定:另一半大腦用1ml含蛋白酶抑制劑的ripa裂解液研磨裂解，于4℃、12000rpm離心30min，收集上清即為可溶性組分。沉淀中加入500μl5m鹽酸胍緩沖液(ph8.0，50mmtris-hcl配制)，研磨裂解后于4℃、12000rpm離心30min，上清即為不可溶性組分。將可溶與不可溶組分分裝后于-80℃保存。應(yīng)用aβ40和aβ42elisa檢測(cè)試劑盒測(cè)定小鼠腦組織提取液中aβ水平。將待測(cè)樣品用稀釋緩沖液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后包被于elisa檢測(cè)試劑盒中，同時(shí)包被aβ40或aβ42標(biāo)準(zhǔn)品，每孔100μl，于4℃包被過(guò)夜；次日棄掉包被液，洗板機(jī)洗滌9次，每次60s。加入標(biāo)簽抗體工作液，每孔100μl，4℃孵育1h后，洗板機(jī)洗滌9次，每次60s。加入tmb底物顯色液，每孔100μl，37℃避光反應(yīng)20min，終止后于450nm測(cè)定吸光度。

(2)western-blot檢測(cè)腦組織提取液中蛋白水平

將可溶性腦組織提取液進(jìn)行電泳；電泳后以恒定電流300ma濕法轉(zhuǎn)膜2h；5％脫脂牛奶室溫封閉1h；加入合適稀釋度的一抗，4℃作用過(guò)夜；0.1％pbst洗膜3次，每次5min；加入二抗室溫孵育1h；0.1％pbst洗膜3次，每次10min。如果使用hrp標(biāo)記的二抗則利用ecl系統(tǒng)進(jìn)行曝光檢測(cè).

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，圖6(a)-圖6(d)表明，注射aoe1疫苗后，ad小鼠腦內(nèi)可溶性及不可溶性aβ40水平與ad對(duì)照組相比顯著下降(*，p<0.05)；可溶性的aβ42水平與ad對(duì)照組相比顯著下降(*，p<0.05)，不可溶性的aβ42水平下降，但無(wú)顯著性差異。

圖6(e)的western-blot結(jié)果表明，aoe1疫苗免疫的ad小鼠腦中40-55kd大小的aβ寡聚體水平明顯下降(*，p<0.05)。說(shuō)明aoe1疫苗免疫能夠減少ad小鼠腦內(nèi)的aβ水平

實(shí)施例9aoe1疫苗免疫減少ad小鼠腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化

(1)星形膠質(zhì)細(xì)胞檢測(cè)：腦組織冰凍切片平鋪放置在組化盒中，室溫復(fù)溫30min；pbs洗滌3次，每次5min；80％甲醇(內(nèi)含0.3％h2o2)浸泡20min，消除內(nèi)源性的過(guò)氧化物酶；pbs洗滌3次，每次5min；用10％山羊血清(含0.3％triton-x)封閉液室溫封閉2h；加gfap抗體工作液(1:100稀釋)，4℃作用過(guò)夜；pbs洗滌3次，每次5min；加熒光標(biāo)記二抗工作液(1:100稀釋)，室溫作用1h；pbs洗滌4次，每次5min；利用抗熒光淬滅封片劑封片后進(jìn)行熒光顯微鏡觀察。

(2)小膠質(zhì)細(xì)胞檢測(cè)：腦組織冰凍切片平鋪放置在組化盒中，室溫復(fù)溫30min；pbs洗滌3次，每次5min；80％甲醇(內(nèi)含0.3％h2o2)浸泡20min，消除內(nèi)源性的過(guò)氧化物酶；pbs洗滌3次，每次5min；用10％山羊血清(含0.3％triton-x)封閉液室溫封閉2h；加cd11b抗體工作液(1:100稀釋)，4℃作用過(guò)夜；pbs洗滌3次，每次5min；加熒光標(biāo)記二抗工作液(1:100稀釋)，室溫作用1h；pbs洗滌4次，每次5min；dab室溫染色1min；流水終止染色；封片后進(jìn)行觀察。

(3)應(yīng)用熒光顯微鏡采集圖像(olympusix73，10倍物鏡)。應(yīng)用軟件imagej(nationalinstitutesofhealth,bethesda,md)進(jìn)行圖像統(tǒng)計(jì)分析。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示：星形膠質(zhì)細(xì)胞活化水平檢測(cè)結(jié)果如圖7(a)-圖7(b)所示，aoe1免疫治療后，ad小鼠海馬區(qū)和皮層區(qū)活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯減少(*p<0.05)。

小膠質(zhì)細(xì)胞活化水平檢測(cè)結(jié)果如圖7(c)-圖7(d)所示，aoe1免疫治療后，ad小鼠皮層區(qū)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯減少(*p<0.05)；海馬區(qū)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少，但無(wú)顯著性差異。

結(jié)果說(shuō)明，aoe1疫苗免疫減少ad小鼠腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化水平。

實(shí)施例10aoe1疫苗免疫不會(huì)活化aβ特異性的t細(xì)胞，并且不誘發(fā)腦出血產(chǎn)生

(1)elispot檢測(cè)：aoe1最后一次免疫結(jié)束后第七天，取三只小鼠，頸椎脫臼處死后，于70％酒精浸泡10min，無(wú)菌條件下剖開(kāi)小鼠腹腔取脾臟；用注射器內(nèi)芯或者研棒于200目篩網(wǎng)上研磨；用2mlhank’s緩沖液沖洗；收集篩網(wǎng)下分離的脾細(xì)胞懸液，于2000rpm離心3min；棄上清后，加入8ml紅細(xì)胞裂解液，顛倒混勻，靜置5min；待紅細(xì)胞完全破碎，；棄上清，用hank’s緩沖液再次清洗2遍，每遍清洗后，于2000rpm離心3min；用含10％血清的rpmi-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×10⁶個(gè)/ml。將elispot的預(yù)包被板活化后，加入調(diào)整好濃度的細(xì)胞懸液至各實(shí)驗(yàn)孔中，每孔100μl(5x105個(gè)細(xì)胞)；同時(shí)，加入對(duì)應(yīng)刺激物，每孔10μl；于co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)；培養(yǎng)結(jié)束后，按照elispot試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

(2)普魯士藍(lán)染色：將冰凍腦組織切片于室溫下復(fù)溫30min；pbs洗滌3次，每次5min；80％甲醇(內(nèi)含0.3％h2o2)浸泡20min，消除內(nèi)源性的過(guò)氧化物酶；pbs漂洗3次，每次5min；滴加普魯士藍(lán)染液37℃反應(yīng)2h；pbs洗滌3次，每次5min；封片后利用顯微鏡觀察。

結(jié)果如圖8所示，elispot結(jié)果如圖8(a)-圖8(b)所示，aβ42多肽刺激aoe1免疫組小鼠脾臟細(xì)胞不引發(fā)ifn-γ和il-4的分泌增加。

普魯士藍(lán)染色結(jié)果如圖8(c)所示，aoe1疫苗免疫組小鼠腦部只能檢測(cè)到極少的腦部微出血現(xiàn)象。

結(jié)果表明，aoe1疫苗具有良好的安全性。

對(duì)比例1

相比于實(shí)施例3，除了重組細(xì)胞為大腸桿菌之外，其他條件與實(shí)施例3相同。

所述多肽在大腸桿菌中不進(jìn)行表達(dá)。

申請(qǐng)人聲明，本發(fā)明通過(guò)上述實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的工藝方法，但本發(fā)明并不局限于上述工藝步驟，即不意味著本發(fā)明必須依賴(lài)上述工藝步驟才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開(kāi)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所

<120>一種多肽及其組成的疫苗和應(yīng)用

<130>2017

<160>2

<170>patentinversion3.3

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