本發(fā)明涉及干細胞領(lǐng)域，尤其涉及一種培養(yǎng)液。
背景技術(shù)：
：隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，生活水平的而提高以及人口老齡化現(xiàn)象，以軟骨面破壞為主要表現(xiàn)的骨關(guān)節(jié)炎等疾病的發(fā)病率日益增加。因此，如何微創(chuàng)修復損傷的軟骨，緩解病人的痛苦、提高生活質(zhì)量長期以來就是骨科醫(yī)學領(lǐng)域研究的重點方向之一。骨關(guān)節(jié)炎是骨科臨床的常見疾病，由于退行性病變、創(chuàng)傷等造成的關(guān)節(jié)軟骨缺損，已成為導致殘廢、影響生活質(zhì)量的重要原因。關(guān)節(jié)軟骨是一種無血管組織，軟骨細胞主要靠關(guān)節(jié)滑液及細胞周圍的基質(zhì)供給營養(yǎng)以無氧酵解供能，其自身的修復能力很有限。關(guān)節(jié)軟骨一旦損傷，就會引起關(guān)節(jié)疼痛、不穩(wěn)和僵硬，會加速關(guān)節(jié)的骨化，細胞外基質(zhì)降解的速度大于新基質(zhì)的合成，則遺留永久性病變，從而導致關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。傳統(tǒng)的治療方法如軟骨下骨鉆孔術(shù)、軟骨移植、骨膜或軟骨膜移植、軟骨細胞移植等因修復組織以纖維軟骨為主，缺少正常透明軟骨的力學性能及耐用性，故不能取得滿意效果。應用組織工程方法修復關(guān)節(jié)軟骨缺損展示了令人鼓舞的前景。種子細胞是組織工程化軟骨形成的首要條件。間充質(zhì)干細胞(mesenchymalstemcells,mscs)作為一種多潛能干細胞，因其成功避開了胚胎干細胞來源缺乏、異體排斥、倫理道德等諸多問題，近年來已成為干細胞領(lǐng)域的研究熱點。其不僅支持造血系統(tǒng)，還可向中胚層和外胚層來源的組織分化，在一定的實驗條件控制下可分化為肌細胞、成骨細胞、脂肪細胞、神經(jīng)細胞、肝細胞、心肌細胞等。因此，mscs具有廣闊的臨床應用前景，是細胞替代治療和組織工程的首選種子細胞，是移植領(lǐng)域和自身性免疫疾病治療的研究熱點。近年來研究表明，mscs是一類來源于中胚葉的多潛能干細胞，具有自我更新和多向分化的能力，可作為種子細胞促進組織損傷的修復和再生。由于其組織來源廣泛，易于體外擴增、免疫原性低等優(yōu)點，已逐漸成為組織工程和細胞移植最理想的種子細胞。目前，骨髓來源mscs是最常用的種子細胞，但其數(shù)量和分化潛能隨著年齡的增長顯著減少和降低，并且取材時易對供體造成身體傷害。因此，非常有必要尋找新的自體和異體移植的細胞來源。這種新的細胞除了必須具備比骨髓來源mscs有更強的增殖力和多向分化潛能的特點外，還必須取材便利，不易造成病毒污染，且不受倫理道德限制等。自mitchell等首次自臍帶中成功地分離出臍帶間充質(zhì)干細胞(huc-mscs)并證實其多分化潛能后，對臍帶組織來源間充質(zhì)干細胞的研究引起了廣泛關(guān)注，越來越多的研究集中到該領(lǐng)域中。從huc-mscs被發(fā)現(xiàn)至今，中外學者已經(jīng)進行相當多的研究，其具有的低污染、來源充足、增殖旺盛等特點吸引了眾多的研究者。從臍帶中分離提取間充質(zhì)干細胞的重要意義在于，臍帶作為分娩廢棄物，來源廣泛，取材方便，不受任何倫理及法理限制。mscs的分化與其生長的微環(huán)境有密切關(guān)系，因此，體外誘導mscs分化是通過采取不同的方法模擬體內(nèi)相應組織細胞生長的真實環(huán)境和必要條件。傳統(tǒng)的治療方法如軟骨下骨鉆孔術(shù)、軟骨移植、骨膜或軟骨膜移植、軟骨細胞移植等因修復組織以纖維軟骨為主，缺少正常透明軟骨的力學性能及耐用性，故不能取得滿意效果?，F(xiàn)有的huc-mscs成軟骨分化誘導液效果不佳，誘導分化的特異性不強。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種培養(yǎng)液，本發(fā)明提供的培養(yǎng)液能明顯提高huc-mscs向軟骨細胞的特異性分化。本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)液，包含人軟骨細胞培養(yǎng)上清液和dmem培養(yǎng)液。優(yōu)選的，所述人軟骨細胞培養(yǎng)上清液與dmem培養(yǎng)液的體積比為：0.5～1.5:1.5～1.5。優(yōu)選的，所述人軟骨細胞培養(yǎng)上清液通過以下方法獲得：a)收集關(guān)節(jié)軟骨，依次經(jīng)過清洗、剪碎、離心、過濾，得到細胞懸液；b)將細胞懸液接種后進行培養(yǎng)，細胞融合至覆蓋培養(yǎng)皿底80％以上時，進行消化、傳代，得到上清液粗品；c)將上清液粗品進行離心，取上清進行過濾、鏡檢，得到所述人軟骨細胞培養(yǎng)上清液。優(yōu)選的，步驟a)所述過濾的篩網(wǎng)為180～220目。優(yōu)選的，步驟b)所述接種的細胞密度為0.5～1.5×109/l。優(yōu)選的，步驟c)所述過濾的濾器粒徑為0.2～0.24μm。優(yōu)選的，所述dmem培養(yǎng)液包含轉(zhuǎn)化生長因子、地塞米松、l-抗壞血酸、itspremix和fbs。優(yōu)選的，所述轉(zhuǎn)化生長因子為β1或者β2中的任意一種。優(yōu)選的，所述dmem培養(yǎng)液為高糖型。優(yōu)選的，上述培養(yǎng)液在體外誘導干細胞分化方面的應用。從以上技術(shù)方案可以看出，本發(fā)明實施例具有以下優(yōu)點：本發(fā)明提供的一種培養(yǎng)液，本發(fā)明提供的培養(yǎng)液包含人軟骨細胞培養(yǎng)上清液和dmem培養(yǎng)液，其中人軟骨細胞培養(yǎng)上清液含有多種促huc-mscs向軟骨細胞特異性分化的細胞因子和有效成分。本發(fā)明提供的培養(yǎng)液能夠有效促進huc-mscs向軟骨細胞的特異性分化。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖。圖1示細胞形態(tài)圖(光鏡下的huc-mscs(100×))圖2示huc-mscs表面標志物流式檢測結(jié)果示意圖圖3示番紅o-快綠染色和ii型膠原免疫組化結(jié)果示意圖圖4示ⅱ型膠原(col-2)表達水平比較示意圖圖5示葡萄糖胺聚糖(gag)表達水平比較示意圖圖6示sox-9表達水平比較示意圖具體實施方式為使得本發(fā)明的發(fā)明目的、特征、優(yōu)點能夠更加的明顯和易懂，下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，下面所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而非全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)液，包含人軟骨細胞培養(yǎng)上清液和dmem培養(yǎng)液。本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)液，包含人軟骨細胞培養(yǎng)上清液和dmem培養(yǎng)液。其中，所述人軟骨細胞培養(yǎng)上清液在本發(fā)明中的主要作用是促進huc-mscs向軟骨細胞的特異性分化。優(yōu)選的，所述人軟骨細胞培養(yǎng)上清液與dmem培養(yǎng)液的體積比為：0.5～1.5:1.5～1.5，更優(yōu)選的體積比為1:1。本發(fā)明提供的培養(yǎng)液，其中人軟骨細胞培養(yǎng)上清液優(yōu)選通過以下方法獲得：首先，收集關(guān)節(jié)軟骨組織。所述關(guān)節(jié)軟骨組織來自多指切除手術(shù)的指關(guān)節(jié)。將關(guān)節(jié)軟骨組織收集于磷酸鹽緩沖液中，反復清洗剪碎。所述剪碎的組織塊的規(guī)格優(yōu)選為lmm×1mm×1mm左右。將組織塊轉(zhuǎn)移至50ml無菌離心管中進行消化。所述消化的過程為加入消化液進行消化30min，所述消化液優(yōu)選為0.05％ⅱ型膠原酶。消化后反復洗滌、離心。然后加入消化液依次進行水浴和過濾。所述水浴優(yōu)選條件為37℃水浴中輕微振蕩消化3–4h。所述過濾的篩網(wǎng)優(yōu)選為200目細胞篩網(wǎng)。過濾后將細胞懸液收集到50ml無菌離心管內(nèi)。未消化完全的軟骨組織繼續(xù)進行消化。所述消化過程為加入消化液后置于37℃水浴中輕微振蕩消化1～2h，直至軟骨組織塊基本消失、溶液變渾濁為止。所述消化液優(yōu)選為0.25％胰蛋白酶溶液。其次，收集消化后的細胞，進行計數(shù)。所述計數(shù)的數(shù)量優(yōu)選為1×109/l。計數(shù)后將細胞接種于10cm培養(yǎng)中，每2天換液1次。當原代細胞融合并覆蓋皿底80％以上時，進行消化和傳代。所述消化過程使用的的消化液優(yōu)選為0.25％胰蛋白酶，所述傳代的比例優(yōu)選為1:2。最后，每隔48h收集細胞培養(yǎng)上清至50ml離心管進行離心。所述離心的條件優(yōu)選為2000rpm/min離心10min。離心后在無菌條件下取上清液進行過濾。所述過濾的濾器粒徑優(yōu)選為0.2～0.24μm，更優(yōu)選為0.22μm。過濾后的上清液經(jīng)鏡檢不含軟骨細胞，制得所述人軟骨細胞培養(yǎng)上清液，在-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｔ诒景l(fā)明中，所述dmem培養(yǎng)液的作用為細胞提供有效營養(yǎng)成分。優(yōu)選的，所述dmem培養(yǎng)液包含轉(zhuǎn)化生長因子、地塞米松、l-抗壞血酸、its+premix和fbs。更為優(yōu)選的，所述轉(zhuǎn)化生長因子為β1或者β2中的任意一種。優(yōu)選的，所述dmem培養(yǎng)液為高糖型。本發(fā)明還提供了上述培養(yǎng)液在體外誘導干細胞分化方面的應用。本發(fā)明提供的一種培養(yǎng)液，本發(fā)明提供的培養(yǎng)液包含人軟骨細胞培養(yǎng)上清液和dmem培養(yǎng)液，其中人軟骨細胞培養(yǎng)上清液含有多種促huc-mscs向軟骨細胞特異性分化的細胞因子和有效成分。本發(fā)明提供的培養(yǎng)液能夠有效增加ii型膠原合成量，促進huc-mscs向軟骨細胞的特異性分化。為了更清楚起見，下面通過以下實施例進行詳細說明。實施例1臍帶間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)(1)臍帶間充質(zhì)干細胞的分離①臍帶取自健康產(chǎn)婦(乙肝、丙肝、hiv、支原體、梅毒等血清學檢查均為陰性)，將臍帶置于含有100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素的pbs中漂洗2次，加入預冷的75％酒精，浸泡1-2min，期間不停翻動臍帶；②加入pbs漂洗2次洗去酒精。用組織剪將臍帶剪成2mm左右的小段，每段用眼科剪縱向開，用血管鉗去除臍帶內(nèi)三根血管(兩條動脈，一條靜脈)，同時去除臍帶外膜；將分離好的臍帶用眼科剪剪成約1mm3大小的組織塊，取適量放入直徑為10cm的無菌培養(yǎng)皿中，覆蓋70％培養(yǎng)皿的底面積。③加入lonza人干細胞無血清培養(yǎng)液(lonzaultraculturetm)，5％co2、37℃、飽和濕度為95％的co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第5～7天半量換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12～14天左右全量換液去掉組織塊，同時收集細胞傳代培養(yǎng)。(2)細胞形態(tài)觀察在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，如圖1所示。從圖1中可以看出huc-mscs生長旺盛，邊界光滑，呈現(xiàn)巢狀生長，集落大多呈多角形或梭形，集落內(nèi)細胞排列緊密，胞漿較豐富，細胞核大，核仁大。(3)細胞表面抗原檢測取第3代對數(shù)生長期細胞，細胞分離液消化，流式細胞術(shù)檢測表面抗原cd105、cd73、cd90、cd34、cd45、cd11b、cd19、hla-dr表達情況，cell-quest軟件分析結(jié)果。每個樣本分析6000～8000個細胞。表1huc-mscs細胞表面標志物表達率細胞表型cd105cd90cd73hla-drcd34cd45cd11bcd19陽性表達率(％)99.7099.8099.800.300.200.100.000.00如表1，圖2所示，經(jīng)流式細胞術(shù)檢測，第3代huc-mscs高表達cd105、cd73和cd90，低表達或不表達hla-dr、cd19、cd11b、cd45和cd34等標記物。結(jié)果表明huc-mscs與其他來源的mscs基本相同。實施例2(1)取實施例1中培養(yǎng)得到的第3代huc-mscs，按5×105cell/管接種于15ml離心管內(nèi)，1000rpm離心5min，使細胞成團聚集在離心管底部，管蓋擰松一半，放入37℃，5％co2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。(2)24h后吸棄舊液，更換1ml陰性對照組培養(yǎng)基：含10％fbs的高糖dmem培養(yǎng)液。輕彈離心管使細胞團漂浮，管蓋擰松一半，放入37℃，5％co2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。(3)培養(yǎng)21d后對細胞進行石蠟切片、番紅o-快綠染色及ii型膠原免疫組化等實驗。(4)番紅o-快綠染色實驗結(jié)果如圖3所示，細胞切片無著色。ii型膠原免疫組化實驗結(jié)果顯示無ii型膠原形成。實施例3(1)取實施例1中培養(yǎng)得到的第3代huc-mscs，按5×105cell/管接種于15ml離心管內(nèi)，1000rpm離心5min，使細胞成團聚集在離心管底部，管蓋擰松一半，放入37℃，5％co2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。(2)24h后吸棄舊液，更換1ml陽性對照組成軟骨誘導液：含10μg/l轉(zhuǎn)化生長因子β1、10-7mol/l地塞米松、100μmol/ll-抗壞血酸、1％itspremix，10％fbs的高糖dmem培養(yǎng)液。輕彈離心管使細胞團漂浮，管蓋擰松一半，放入37℃，5％co2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。(3)誘導分化培養(yǎng)21d后對細胞進行石蠟切片、番紅o-快綠染色及ii型膠原免疫組化等實驗。(4)番紅o-快綠染色實驗結(jié)果如圖3所示，細胞切片有著色，但著色區(qū)域較小，ii型膠原免疫組化實驗結(jié)果顯示有ii型膠原形成。實施例4(1)取實施例1中培養(yǎng)得到的第3代huc-mscs，按5×105cell/管接種于15ml離心管內(nèi)，1000rpm離心5min，使細胞成團聚集在離心管底部，管蓋擰松一半，放入37℃，5％co2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。(2)24h后吸棄舊液，更換1ml實驗組成軟骨誘導液：由50％含10μg/l轉(zhuǎn)化生長因子β1、10-7mol/l地塞米松、100μmol/ll-抗壞血酸、1％itspremix，10％fbs的高糖dmem培養(yǎng)液，50％人軟骨細胞培養(yǎng)上清混合而成的誘導分化培養(yǎng)基。輕彈離心管使細胞團漂浮，管蓋擰松一半，放入37℃，5％co2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。(3)誘導分化培養(yǎng)21d后對細胞進行石蠟切片、番紅o-快綠染色及ii型膠原免疫組化等實驗。(4)番紅o-快綠染色實驗結(jié)果如圖3所示，細胞切片有著色，著色區(qū)域明顯大于對比例2，ii型膠原免疫組化實驗結(jié)果顯示有ii型膠原合成，ii型膠原合成量明顯多于對比例2。實施例5培養(yǎng)液誘導效果評價根據(jù)ⅱ型膠原(col-2)、葡萄糖胺聚糖(gag)和sox-9基因的表達結(jié)果進行評定。實驗檢測過程按照實施例2、實施例3和實施例4的操作方法對huc-mscs進行培養(yǎng)或成軟骨分化誘導，連續(xù)誘導培養(yǎng)21d后對細胞進行ⅱ型膠原(col-2)、葡萄糖胺聚糖(gag)和sox-9基因的表達檢測。按照trizol試劑盒說明書進行細胞總rna提??；m-mlv反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cdna。按照sybrgreen定量pcr試劑盒說明書對ⅱ型膠原(col-2)、葡萄糖胺聚糖(gag)和sox-9基因表達水平進行檢測。以gapdh作為內(nèi)參基因。使用的引物如表2所示。以2-△△ct法進行定量分析。表2引物序列表實驗結(jié)果如圖4、5、6所示，細胞誘導培養(yǎng)21d后，實施例3、實施例4與實施例2(陰性對照組)比較，成軟骨分化細胞標志性基因ⅱ型膠原(col-2)、葡萄糖胺聚糖(gag)和sox-9基因表達水平均有極顯著性差異(**，p<0.01)，實施例4與實施例3有顯著性差異(*，p<0.05)。根據(jù)實驗結(jié)果可以說明本發(fā)明提供的培養(yǎng)液能有效促進huc-mscs向軟骨細胞的特異性分化。以上所述，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的精神和范圍。當前第1頁12