本發(fā)明涉及植物生物技術領域，具體涉及一種海南龍血樹查爾酮異構酶dcchil1及其編碼基因和應用。

背景技術：

類黃酮化合物是一類小分子次生代謝物，廣泛參與在植物花色形成、紫外線保護、植物育性、生長素運輸、抵抗?jié)B透脅迫、細胞周期調(diào)控等生物學過程。此外，類黃酮化合物還是一種生物活性很強的抗氧化劑，具有調(diào)節(jié)機體免疫力、抗氧化、抗衰老以及抵抗病毒等醫(yī)療價值。查爾酮異構酶(chalconeisomerase,chi)是類黃酮生物合成途徑中的關鍵限速酶,催化查爾酮異構化為黃烷酮，黃烷酮繼而轉(zhuǎn)化為各種類型的類黃酮。chi超家族包含四種類型蛋白：ⅰ型普遍存在于維管植物中，負責類黃酮的合成；ⅱ型主要存在豆科植物中，參與異黃酮合成；ⅲ型是廣泛存在于陸生植物中的脂肪酸結(jié)合蛋白；已發(fā)現(xiàn)的ⅳ型蛋白不具有查爾酮異構酶活性，但可作為增強子，促進類黃酮合成。

血竭是一種的傳統(tǒng)名貴中藥，是一種紅色樹脂，有“活血之圣藥”的美譽?，F(xiàn)代藥理學研究表明，血竭具有促進血液循環(huán)、止血功效、降血糖、血脂、增強免疫力、抗菌、促進皮膚修復、抗痙攣、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗糖尿病、抗腫瘤等多種藥理作用。海南龍血樹是國產(chǎn)血竭的主要基源植物，其血竭主要化學成分為類黃酮化合物。目前對血竭的研究集中在化學成分和藥理活性，對血竭的生物合成途徑及誘導產(chǎn)生機制了解不多。

目前已經(jīng)從多種植物中克隆到chi基因，如擬南芥、大豆、蘋果、葡萄等。利用基因工程技術將chi基因?qū)胫参镏?，能夠促進類黃酮的生物合成，具有開發(fā)應用前景。如將矮牽牛chi基因?qū)敕阎?，轉(zhuǎn)基因番茄果皮中黃酮類含量提高78倍，果肉中黃酮醇增加了21倍；將水母雪蓮chi基因?qū)胄陆┥徍螅D(zhuǎn)基因雪蓮發(fā)根中總黃酮量可提高4倍。但對于海南龍血樹chi基因的克隆、表達模式、蛋白表達及在類黃酮生物合成中的作用尚不清楚。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種海南龍血樹查爾酮異構酶dcchil1基因以及海南龍血樹查爾酮異構酶dcchil1，用以解決現(xiàn)有技術無法提高海南龍血樹中類黃酮含量的不足。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明方法以通過以下技術方案予以實現(xiàn)：

本發(fā)明首先提供一種海南龍血樹查爾酮異構酶基因dcchil1，該基因的核苷酸序列包括：

(a)seqidno:1所示的核苷酸序列；或

(b)seqidno:1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個且表達相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或

(c)與(a)或(b)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表達相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列。

本發(fā)明還提供一種海南龍血樹查爾酮異構酶dcchil1，其氨基酸序列如seqidno:2所示；或為seqidno:2經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成具有同等功能的氨基酸序列。

海南龍血樹是國產(chǎn)血竭的主要基源植物，其血竭主要化學成分是類黃酮。本發(fā)明針對海南龍血樹類黃酮合成和調(diào)控基礎研究的薄弱現(xiàn)狀，首次克隆得到海南龍血樹查爾酮異構酶dcchil1基因以及查爾酮異構酶dcchil1，利用生物技術將該基因轉(zhuǎn)入海南龍血樹中可以提高海南龍血樹類黃酮積累和血竭的產(chǎn)量，具有廣闊的應用前景和極大的經(jīng)濟價值。

所述的海南龍血樹查爾酮異構酶基因dcchil1的克隆方法，包含如下步驟：

(1)設計特異引物p1正向引物和p2反向引物；

(2)以海南龍血樹莖干第一鏈cdna為模板對dcchil1基因的cds序列進行pcr擴增；

(3)將擴增獲得的pcr產(chǎn)物連接pmd18-t載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆并測序。

優(yōu)選地，步驟(1)中所述的p1正向引物的序列如seqidno:3所示，所述p2反向引物的序列如seqidno:4所示。

優(yōu)選地，步驟(2)中所述的pcr擴展條件為：94℃預變性5min；94℃變性30sec，55℃退火30sec，70℃延伸1min，共35個循環(huán)；70℃延伸8min。

本發(fā)明還提供一種重組表達載體或表達盒，所述重組表達載體或表達盒含有權利要求1所述的海南龍血樹查爾酮異構酶基因dcchil1。

本發(fā)明還提供一種轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌，所述轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌含有權利要求1所述的海南龍血樹查爾酮異構酶基因dcchil1。

本發(fā)明還提供一種宿主細胞，所述宿主細胞含有權利要求1所述的海南龍血樹查爾酮異構酶基因dcchil1。

本發(fā)明還提供上述海南龍血樹查爾酮異構酶基因dcchil1的應用，將該基因應用于真核或原核表達。

本發(fā)明還提供海南龍血樹查爾酮異構酶基因dcchil1的應用，將該基因通過轉(zhuǎn)基因技術用于提高海南龍血樹類黃酮積累和血竭的產(chǎn)量。

本發(fā)明方法具有如下優(yōu)點：本發(fā)明提供了一種全新的基因：海南龍血樹查爾酮異構酶基因dcchil1，該基因序列能夠編碼海南龍血樹類黃酮生物合成途徑中關鍵酶查爾酮異構酶dcchil1；將該基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌進行誘導表達，獲得dcchil1蛋白具有查爾酮異構酶活性，能將查爾酮轉(zhuǎn)變?yōu)辄S烷酮。所述的海南龍血樹查爾酮異構酶基因dcchil1可以調(diào)控海南龍血樹類黃酮生物合成，利用生物技術將該基因轉(zhuǎn)入海南龍血樹中可以提高海南龍血樹類黃酮積累和血竭的產(chǎn)量，具有廣闊的應用前景和極大的經(jīng)濟價值。

附圖說明

圖1為海南龍血樹查爾酮異構酶dcchil1的系統(tǒng)進化分析圖。

圖2為海南龍血樹查爾酮異構酶dcchil1的原核表達和活性分析圖。

其中，a為海南龍血樹查爾酮異構酶dcchil1的原核表達和蛋白純化；泳道1-4：iptg誘導0h、1h、3h、5h后海南龍血樹查爾酮異構酶dcchil1蛋白表達；泳道5為純化的海南龍血樹查爾酮異構酶dcchil1；b為海南龍血樹查爾酮異構酶dcchil1的活性分析；a,2',4,4',6'-四羥基查耳酮(nc)標準品；b,4',5,7-三羥基黃酮(na)標準品；c：海南龍血樹查爾酮異構酶dcchil1與柚皮素查爾酮反應的hplc結(jié)果。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

實施例1海南龍血樹查爾酮異構酶基因dcchil1的克隆

通過對前期海南龍血樹莖干轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進行分析，設計特異引物p1正向引物5′-atgggctctgagatagtgatggtg-3′(seqidno:3)和p2反向引物5′-gcagcagataacatagtcccaag-3′(seqidno:4)，以海南龍血樹莖干第一鏈cdna為模板對dcchil1基因的cds序列進行pcr擴增，擴增條件為：94℃預變性5min；94℃變性30sec，55℃退火30sec，70℃延伸1min，共35個循環(huán)；70℃延伸8min。將擴增獲得的pcr產(chǎn)物連接pmd18-t載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆并測序，獲得海南龍血樹查爾酮異構酶基因dcchil1的全長編碼序列642bp。

將上述含有海南龍血樹查爾酮異構酶基因dcchil1的重組載體命名為pmd18-dcchil1。

實施例2海南龍血樹查爾酮異構酶基因dcchil1的序列分析

海南龍血樹查爾酮異構酶基因dcchil1的全長開放閱讀框為642bp，詳細序列見seqidno:1。根據(jù)開放閱讀框序列推導出dcchil1的氨基酸序列，共213個氨基酸殘基(詳細序列見seqidno:2)，分子量為23.8kda，理論等電點為4.97。

分別從擬南芥、玉米等不同植物中，挑取31個不同類別的chi序列(植物物種和chi蛋白序列號詳見圖1)作為模板，來分析dcchil1的系統(tǒng)進化地位。利用mega7軟件對這32個chi序列進行多重序列比對，并構建系統(tǒng)發(fā)育樹(如圖1)。從圖上可以清楚地看出，這些chi可以分為4個分支，dcchil1與植物ⅳ型chi成員聚在一起，屬于ⅳ型chi。

實施例3pet28a-dcchil1重組表達載體的構建

利用premier5軟件分析海南龍血樹查爾酮異構酶基因dcchil1編碼區(qū)的限制性內(nèi)切酶酶切位點，確定用于構建載體用的兩個限制性內(nèi)切酶為ecori和sali。設計海南龍血樹查爾酮異構酶基因dcchil1編碼區(qū)引物pe1：5′-gcgaattcatgggctctgagatagtgatggtg-3′(正向引物，劃線為ecori酶切位點)和pe2：5′-gcgtcgacagcagcagataacatagtccc-3′(反向引物，劃線為sali酶切位點)，以pmd18-dcchil1(實施例1制備得到)為模板進行pcr擴增，擴增條件為：94℃預變性5min；94℃變性30sec，58℃退火30sec，70℃延伸1min，共35個循環(huán)；70℃延伸8min。將擴增獲得的pcr產(chǎn)物連接pmd18-t載體，獲得pmd18-edcchil1重組質(zhì)粒，經(jīng)測序確定目的序列的正確性。37℃水浴中ecori和sali雙切pmd18-edcchil1重組質(zhì)粒，回收650bp左右的目的片段。將該片段插入pet28a質(zhì)粒的ecori和sali酶切位點之間，獲得重組載體，經(jīng)酶切和測序鑒定，確認插入的序列是正確的。把構建含有海南龍血樹查爾酮異構酶基因dcchil1編碼區(qū)序列的表達載體命名為pet28a-dcchil1。

實施例4dcchil1的誘導表達和蛋白純化

將表達載體質(zhì)粒pet28a-dcchil1(實施例3制備得到)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌bl21(de3)中，篩選并鑒定重組子。將重組子接種到含卡那霉素(終濃度50μg/ml)的lb培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)過夜后，按1：100(v/v)比例轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至od600＝0.6-0.8時，加入iptg至終濃度為1mm，培養(yǎng)1h、3h和5h后離心收集菌體，以未加iptg培養(yǎng)基為對照，提取細胞總蛋白進行12％sds-paged電泳檢測。結(jié)果表明dcchil1在大腸桿菌中得到高效異源表達，且表達蛋白(海南龍血樹查爾酮異構酶dcchil1)的表觀分子量與理論分子量相近，約28kda。融合蛋白以包涵體的形式出現(xiàn)，蛋白的分離參照merck公司的proteinrefoldingkit說明書進行，蛋白產(chǎn)物(海南龍血樹查爾酮異構酶dcchil1)經(jīng)鎳柱純化后(具體方法參照mn公司的protinoni-ntacolumns產(chǎn)品說明書)為一清晰單一條帶，與預期大小相符，可用于體外酶活分析。

實施例5重組蛋白的活性分析

利用hplc法測定重組蛋白(即實施例4制備得到的蛋白產(chǎn)物海南龍血樹查爾酮異構酶dcchil1)的活性。酶活反應體系為200μl，包含重組蛋白10μl，底物2',4,4',6'-四羥基查耳酮(5mm)2μl,tris-hcl(100mm,ph7.5)補足200μl。反應條件：30℃水浴5min，加入200μl的乙酸乙酯來終止反應。加入乙酸乙酯后混勻，10000rmp離心10min，溶液呈分層狀態(tài)，取上部乙酸乙酯部分，重復萃取兩次，用真空泵揮干乙酸乙酯，并加入100μl的色譜甲醇，混勻。利用hplc(highperformanceliquidchromatography)進行體外酶活測定。吸取上述反應物上樣，上樣量系統(tǒng)默認20μl。柱溫40℃，流速0.8ml/min，檢測波長270nm。結(jié)果顯示重組蛋白(海南龍血樹查爾酮異構酶dcchil1)表現(xiàn)出能將所有的底物2',4,4',6'-四羥基查耳酮完全轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物4',5,7-三羥基黃酮的能力(如圖2所示)，這說明重組蛋白(海南龍血樹查爾酮異構酶dcchil1)具有查爾酮異構酶的活性。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施例對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。

sequencelisting

<110>中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術研究所

<120>一種海南龍血樹查爾酮異構酶dcchil1及其編碼基因和應用

<130>

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>642

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

atgggctctgagatagtgatggtggatgaatttcctttcccgactgagatcactacaaca60

gaggctttgcctctcttgggttctggcatcacggatattgaaatccatttccttcaaatc120

aagcacagcgcaatcggtatttatatggaacgaagaattgttgagcatctcaggaactgg180

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gctcaattcggcctgcagatcgaaactgcagtgagagataggttggtggcttgcgataag360

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<210>2

<211>213

<212>prt

<213>人工序列

<400>2

metglysergluilevalmetvalaspgluphepropheprothrglu

151015

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195200205

metleuseralaala

210

<210>3

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

atgggctctgagatagtgatggtg24

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<212>dna

<213>人工序列

<400>4

gcagcagataacatagtcccaag23