本發(fā)明屬于基因檢測
技術領域：
，具體涉及一種檢測異源cfdna的snp分子標記及其探針、芯片、試劑盒、方法、檢測裝置和用途。
背景技術：
：腎移植是臨床治療終末期腎病的優(yōu)選手段，而影響腎移植術后患者生存率的最重要原因為排斥反應的發(fā)生。移植排斥分為超急性、急性、邊緣型急性、亞臨床急性或慢性,急性排斥反應(acuterejection,ar)是目前腎移植術后的主要危險并發(fā)癥，也是導致慢性排斥反應和移植腎失功的最重要的危險因素。早期診斷及時治療ar可以有效減少移植器官的病理損害程度，延長移植器官的存活時間。通常診斷發(fā)生急性排斥反應的指標有：患者臨床表現(xiàn)、各項生化指標(丙氨酸氨基轉移酶、總膽紅素、堿性磷酸酶和γ-谷氨酰轉移酶、肌酐或心肌酶譜)和組織活檢。前兩項檢測的靈敏度和特異性低，且檢測結果依賴于臨床醫(yī)生的臨床經(jīng)驗易產(chǎn)生偏差。穿刺活檢一直是腎移植排異反應檢測的金標準，但組織活檢花費大，屬創(chuàng)傷性檢查常伴隨并發(fā)癥，包括：疼痛、血尿、腎血腫、移植物血栓癥、敗血癥、休克和移植物衰竭等。近年來診斷腎移植急性排斥反應的發(fā)生，一直朝向尋找非侵入性無創(chuàng)檢測的方向努力。血清中肌酐水平的增高通常是診斷腎移植后排斥反應的一個有效指標，但肌酐檢測具有非特異性，除了腎排斥反應，腎移植患者排異藥物中毒引起的急性腎衰竭也會導致肌酐升高，因此，肌酐水平的監(jiān)測不宜單獨作為判斷腎移植排斥反應的依據(jù)。目前，腎移植患者面臨的主要臨床問題之一就是缺少用于早期診斷和連續(xù)監(jiān)控移植物排斥風險的高靈敏度、高特異性且非侵入性的檢測。游離dna(cellfreedna,cfdna)，是指游離于細胞外的部分降解了的機體內(nèi)源dna，主要來自于細胞的凋亡或壞死。異源或自體的體細胞突變dna都可以在本體的血液中檢測到，例如孕婦、腫瘤患者和器官移植患者。由于cfdna的半衰期很短(16min)，cfdna作為生物標志物的潛力巨大。dennislo最早在女性肝、腎移植患者的血漿中檢測到來自男性供體組織的游離dna，被認為是供體器官在患者體內(nèi)凋亡或壞死，細胞裂解釋放出的cfdna，游離dna可以作為器官移植排異的標志物(參見presenceofdonor-specificdnainplasmaofkidneyandliver-transplantrecipients.lancet.1998may2；351(9112):1329-30.)。正常狀態(tài)下受體血液中供體來源的cfdna幾乎沒有或者含量是極低的，通過檢測器官移植受體中供體來源的cfdna的比例，可用于判斷器官移植后是否發(fā)生排斥反應。在中國專利文獻cn106544407a中公開了一種確定受體cfdna樣本中供體來源cfdna的比例的方法，通過獲取器官移植的受體樣本的基因組dna，對基因組dna目標區(qū)域捕獲測序，用于基因分型；同時對移植后受體的血漿cfdna樣本進行目標區(qū)域的捕獲和測序，用以分析供體cfdna占總cfdna的比例。然而上述文獻中的技術方案在應用于檢測腎移植受體中的供體cfdna比例時還存在如下缺陷：一、腎移植急性排斥反應的早期診斷以及免疫抑制劑使用的劑量，直接關系到腎移植患者的存活率和腎功能的恢復，文獻中的snp位點的選擇僅以次等位基因頻率(maf)為篩選條件，缺少對臨床腎移植患者易突變基因，特別是相關藥用基因組學檢測，因此缺少對腎移植排斥反應的針對性檢測，無法為免疫排斥反應的個體提供臨床個體化用藥依據(jù)；二、腎移植排斥反應的病人中，供體來源的cfdna含量低于肺移植和肝移植等器官移植排斥反應病人的外周血中cfdna,使得將異源cfdna信號從測序錯誤和pcr擴增錯誤信號中區(qū)分出來的難度加大，文獻中提供的cfdna建庫方法無法實現(xiàn)對cfdna的單分子特異性標記，在對測序數(shù)據(jù)分析時會引入偏差和錯誤。技術實現(xiàn)要素：因此，本發(fā)明要解決的第一個技術問題在于克服現(xiàn)有技術中缺少對腎移植排斥反應相關基因檢測，無法為器官移植患者提供個體化用藥指導的缺陷，從而提供一種用于針對腎移植急性排斥反應和藥物代謝基因進行高靈敏度和高特異性的早期檢測的snp分子標記以及其探針、芯片、試劑盒。本發(fā)明要解決的第二個技術問題在于克服現(xiàn)有技術中無法特異性提取cfdna信號以區(qū)分偏差和測序錯誤，從而提供一種單分子標記接頭實現(xiàn)對cfdna的單分子標記。本發(fā)明要解決的第三個技術問題在于克服現(xiàn)有技術中缺少對腎移植排斥反應相關基因檢測的方法和裝置，從而提供一種檢測異源cfdna的方法和裝置。本發(fā)明要解決的第四個技術問題在于提供所述的檢測異源cfdna的snp分子標記、所述的snp分子標記的探針、所述的異源cfdna的檢測芯片或所述的腎移植排斥反應的檢測試劑盒在制備用于檢測腎移植排斥反應的制劑中的用途。本發(fā)明提供了一種檢測異源cfdna的snp分子標記，所述snp分子標記選自如表1中所示的snp位點。所述的snp分子標記，所述snp位點包括藥物代謝基因的snp位點。所述的snp分子標記，所述藥物代謝基因為cyp3a4、cyp3a5和cyp2d6。優(yōu)選的，所述藥物代謝基因的snp位點如表2中所示的snp位點。本發(fā)明提供了一種檢測所述snp分子標記的探針，所述探針是基于所述snp位點設計而成的。所述的探針，所述探針包括上游探針和下游探針，所述上游探針的序列是以所述snp位點為坐標起點，向5’方向延伸80bp的堿基序列為序列信息設計的；所述下游探針的序列是以所述snp位點為坐標起點，向3’方向延伸80bp堿基序列為序列信息設計的。本發(fā)明提供了一種異源cfdna的檢測芯片，所述檢測芯片上述的探針。本發(fā)明提供了一種單分子標記接頭，所述單分子標記接頭是由正向序列和反向序列部分配對后的y型接頭；所述正向序列由5’端至3’端依次包括5’-接頭和特異性分子標簽a；所述反向序列由3’端至5’端依次包括3’-接頭和特異性分子標簽b。所述的單分子標記接頭，所述5’-接頭序列的堿基序列如seqidno.1或seqidno.2所示，所述3’-接頭的堿基序列如seqidno.3或seqidno.4所示，所述特異性分子標簽a的堿基序列如seqidno.5所示，所述特異性分子標簽b的堿基序列如seqidno.10所示，其中n代表隨機堿基。所述的單分子標記接頭，所述正向序列的3’末端連接有堿基t，所述反向序列的5’末端連接有磷酸基團。所述的單分子標記接頭，所述正向序列如seqidno.6或seqidno.7所示，所述反向序列如seqidno.8或seqidno.9所示。本發(fā)明提供了一種異源cfdna的檢測方法，包括如下步驟：(1)捕獲基因組dna的目標區(qū)域，所述基因組dna的目標區(qū)域包括所述的snp分子標記；(2)將步驟(1)所得的目標區(qū)域進行高通量測序，所得測序結果用于基因組dna的snp分型；(3)篩選步驟(2)中snp分型后基因型為純合子的snp位點，作為有效snp位點；(4)捕獲cfdna的目標區(qū)域，所述cfdna的目標區(qū)域包括所述的snp分子標記；(5)將步驟(4)所得的目標區(qū)域進行高通量測序，保留與步驟(3)中所述的有效snp位點相同坐標位置的snp位點；(6)檢測cfdna在有效snp位點處區(qū)別于步驟(3)中基因型為純合子snp信號，即異源snp信號；(7)計算步驟(6)中異源snp信號占cfdna在有效snp位點處總測序信號的比例，即得到異源cfdna的定量結果。所述的異源cfdna的檢測方法，所述捕獲基因組dna的目標區(qū)域包括如下步驟：(1)提取血細胞中的基因組dna；(2)將步驟(1)中基因組dna打斷為dna片段，所述dna片段末端修復后連接所述的單分子標記接頭，得到基因組dna連接產(chǎn)物；(3)pcr擴增步驟(2)中基因組dna連接產(chǎn)物，得到基因組dna文庫；(4)利用權利要求6所述的檢測芯片捕獲得到步驟(3)中所述基因組dna文庫的目標區(qū)域。所述的異源cfdna的檢測方法，其特征在于，所述捕獲cfdna的目標區(qū)域包括如下步驟：(1)提取血漿中的cfdna；(2)將步驟(1)中cfdna末端修復后連接所述的單分子標記接頭，得到cfdna連接產(chǎn)物；(3)pcr擴增步驟(2)中cfdna連接產(chǎn)物，得到cfdna文庫；(4)利用所述的檢測芯片捕獲得到步驟(3)中cfdna文庫的目標區(qū)域。本發(fā)明提供了一種異源cfdna的檢測裝置，其特征在于，所述裝置包括：(1)樣本獲取單元，用以獲取基因組dna和cfdna；(2)異源cfdna定量單元，利用所述的異源cfdna的方法以獲取異源cfdna定量結果；(3)質(zhì)控單元，對上述樣本獲取單元和異源cfdna定量單元進行監(jiān)測調(diào)控。所述的異源cfdna的檢測裝置，其特征在于，所述裝置為腎移植排斥反應的檢測裝置。本發(fā)明提供了一種腎移植排斥反應的檢測試劑盒，所述試劑盒包括探針、檢測芯片和單分子標記接頭。本發(fā)明提供了一種檢測異源cfdna的snp分子標記、檢測snp分子標記的探針、異源cfdna的檢測芯片或腎移植排斥反應的檢測試劑盒在制備用于檢測腎移植排斥反應的制劑中的用途。本發(fā)明技術方案，具有如下優(yōu)點：1.本發(fā)明所述的檢測異源cfdna的snp分子標記，包括表1所示的5764個snp位點，覆蓋范圍廣，snp位點的次等位基因頻率(maf)接近0.5，基因多態(tài)性高，通過snp分型可以準確區(qū)分人群中不同個體，通過上述的檢測異源cfdna的snp分子標記可以用于檢測進行腎臟移植后的患者中異源cfdna的水平，能夠實現(xiàn)針對腎移植急性排斥反應和藥物代謝基因進行高靈敏度和高特異性的早期診斷，進而可以為器官移植患者提供個體化用藥指導。2.本發(fā)明所述的檢測異源cfdna的snp分子標記，snp位點包括藥物代謝基因的snp位點，如cyp3a4、cyp3a5和cyp2d6；cyp3a4、cyp3a5和cyp2d6的基因多態(tài)性與腎移植患者的急性排斥反應密切相關，同時是造成臨床個體用藥差異的重要因素，能夠為患者免疫抑制劑的選擇和使用劑量提供參考信息。3.本發(fā)明所述的snp分子標記的探針，可以對每個snp位點雙向覆蓋檢測，檢測準確度高。4.本發(fā)明所述的異源cfdna的檢測芯片，包括上述檢測探針，檢測范圍廣，芯片應用于高通量測序能夠實現(xiàn)對腎移植排斥反應的早期檢測，以及個體藥物代謝差異檢測。5.本發(fā)明所述的單分子標記接頭，通過接頭中的特異性分子標簽對dna分子進行特異性標記，在測序分析時通過提取特異性分子標簽，可以用來識別pcr產(chǎn)物和原始模板，避免pcr產(chǎn)物重復計數(shù)，有效去除重復數(shù)據(jù)，以及測序過程和pcr過程中隨機引入的錯誤，降低測序背景噪音，提高了檢測的準確性；特異性分子標簽添加在單分子標記接頭的末端(y型接頭)，連接y型接頭和dna片段；特異性分子標簽是包含6個隨機堿基的互補序列，可以提高y型接頭的解鏈溫度，進而提高了y型接頭的穩(wěn)定性。6.本發(fā)明所述的異源cfdna的檢測方法，包括cfdna文庫的構建方法，在cfdna的兩端添加單分子標記接頭對cfdna進行標記，測序分析時能夠對樣本cfdna準確篩選，相對增加了有效數(shù)據(jù)量，實現(xiàn)對起始量低的cfdna的檢測。7本發(fā)明所述的異源cfdna的檢測裝置和/或檢測試劑盒通過對樣本基因組dna的捕獲測序，得到樣本基因組的snp分型信息；對cfdna的捕獲測序，鑒定出樣本中不同基因型的異源cfdna，以及異源cfdna的定量結果；將其應用于腎移植排斥反應診斷，可實現(xiàn)針對腎移植的高靈敏度和高特異性的無創(chuàng)早期檢測，并可對腎移植患者進行持續(xù)性的監(jiān)測，為分析和判斷腎移植排斥反應提供了可靠信息；由于檢測基因涉及藥物代謝基因，可為患者提供胚系突變檢測信息，從而為腎移植排斥患者的早期治療、個體精準化用藥指導以及預后動態(tài)監(jiān)測等提供了可靠的分析依據(jù)。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明具體實施方式或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對具體實施方式或現(xiàn)有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實施方式，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。圖1為本發(fā)明實施例1所示的中國人群數(shù)據(jù)庫與hapmap數(shù)據(jù)庫頻率信息的比對結果；圖2為本發(fā)明實施例3所示的單分子標記接頭-1；圖3為本發(fā)明實施例3所示的單分子標記接頭-2；圖4為本發(fā)明實施例3所示的特異性分子標簽矯正測序數(shù)據(jù)錯誤率的對比效果，其中橫坐標代表定位于染色體上不同位置的序列，縱坐標代表每一序列測序數(shù)據(jù)的錯誤率；每一位置處的序列從左向右依次顯示序列原始測序數(shù)據(jù)的錯誤率、比對序列位置去重、矯正后的錯誤率，以及使用特異性分子標簽矯正后的錯誤率；圖5為本發(fā)明實施例7中基因分型結果隨測序深度的變化圖；圖6為本發(fā)明實施例9中繪制的標準樣本回歸曲線；圖7為本發(fā)明實施例10中檢測健康人和兩例腎移植排斥患者的結果圖。具體實施方式以下通過具體實施例來說明本發(fā)明的實施方式，除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法均采用本
技術領域：
常規(guī)技術，下文中所稱的供體和受體，是相對的兩個個體，是基于移植，例如基于器官或組織移植時的供給一方和接受一方來說的。實施例1snp位點篩選選擇dbsnp(databasesnp,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)數(shù)據(jù)庫和中國人群數(shù)據(jù)庫(保存于蘇州人人基因科技有限公司)，中國人群數(shù)據(jù)庫是基于3000例中國人的全基因組樣本信息構建的遺傳多態(tài)性位點目錄，如圖1所示，中國人群數(shù)據(jù)庫與hapmap數(shù)據(jù)庫(http://www.hapmap.org)存在部分差異性頻率信息，代表了中國人群中的差異性遺傳位點，使中國人群數(shù)據(jù)庫能夠更精準的呈現(xiàn)中國人群的遺傳多態(tài)性位點信息。從上述兩種數(shù)據(jù)庫中篩選次等位基因頻率(maf)接近于0.5的位點，得到表1所示的5754個目標snp位點。所述藥物代謝基因的snp位點，如cyp3a4、cyp3a5和cyp2d6基因，cyp3a4、cyp3a5和cyp2d6基因的snp位點如表2所示，上述基因單核苷酸多態(tài)性影響腎移植急性排斥反應和多種免疫抑制劑(如他克莫司或環(huán)孢素)血藥濃度/劑量比(c/d)；通過檢測表2中所示的位點，可以針對性檢測腎移植后的急性排斥反應，為腎移植的早期治療、個體化精準用藥指導以及預后動態(tài)監(jiān)測等提供了關鍵的突變位點信息，輔助醫(yī)生選擇合適的藥物和藥物劑量，提高腎移植后的存活率和腎功能的恢復程度。表1目標snp位點表2藥物代謝基因snp位點rs55951658rs55901263rs4646438rs28371759rs4986913rs776746rs56411402rs3892097rs5030655rs1065852實施例2探針設計和芯片合成1.探針設計根據(jù)表1以及表2所示的snp位點在基因組上的坐標位置，以snp位點為坐標起點，向5’端延伸80bp堿基的堿基序列為序列信息設計得到上游探針，上游探針不包括snp位點序列；以snp位點為坐標起點，向3’端延伸80bp堿基的堿基序列為序列信息設計得到下游探針，下游探針不包括snp位點序列；以rs1036431位點示例，截取snp上下游各80bp序列分別得到上游探針(ggcttttgagcgcagttaacttttgggctgaaggaaaatggacatgcaagcaggagggagaatcctagttagactcctcg)和下游探針(ttttcacaagtcattgtcgatgtcactgtcagtgtagtgggccttcaagctatagggagccactcctaatgagcaacatg)。通過所述上游探針和下游探針實現(xiàn)對每個snp位點的雙向覆蓋檢測，探針檢測準確度高。2.芯片合成步驟1中針對表1以及表2所示的共5764個snp位點共設計合成11528條探針，探針合成后(由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)等摩爾體積混合，得到用于檢測表1以及表2所示snp位點的檢測芯片。實施例3單分子標記接頭的制備單分子標記接頭(由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)包括接頭和特異性分子標簽，其中接頭包括正向序列中的5’-接頭和反向序列中的3’-接頭；如圖2和圖3所示，5’-接頭選自選自seqidno.1所示的5’-接頭-1或seqidno.2所示的5’-接頭-2，3’-接頭序列選自seqidno.3所示的3’-接頭-1或seqidno.4所示的3’-接頭-2；5’-接頭-2是5’-接頭-1的3’末端的部分序列，3’-接頭-2是3’-接頭-1的5’末端的部分序列；如圖2所示，由5’-接頭-1、3’-接頭-1和特異性分子標簽組成y型的單分子標記接頭-1，如圖3所示，5’-接頭-2、3’-接頭-2和特異性分子標簽組成y型的單分子標記接頭-2；特異性分子標簽是由正向序列中的特異性分子標簽a和反向序列中的特異性分子標簽b互補配對形成的雙鏈dna分子，其中特異性分子標簽a的堿基序列如seqidno.5所示，特異性分子標簽b的堿基序列如seqidno.10所示；單分子標記接頭的正向序列3’末端連接有堿基t，反向序列的5’末端有磷酸基團，在文庫構建過程中，單分子標記接頭通過3’末端的堿基t與游離dna片段相連，單分子標記接頭5’末端的磷酸基團保護堿基t不被核酸外切酶剪切，保障單分子標記接頭與dna片段的連接效率。所述正向序列如seqidno.6或seqidno.7所示，所述反向序列如seqidno.8或seqidno.9所示。3’-接頭-1序列中具有barcord序列為atcacg，barcord在高通量測序過程用于區(qū)分來自不同樣本的序列；特異性分子標簽中包括polyn序列，其中n代表隨機堿基，特異性分子標簽中包含6個隨機堿基，形成46種唯一標簽；每個dna端的3’端和5’端分別連接一個單分子標記接頭-1，通過前后12bp的隨機堿基進一步對同一樣本中的不同dna片段進行特異性標記，獲得測序數(shù)據(jù)后，通過讀取特異性標簽序列，有效去除了在測序過程和pcr過程引入的錯誤，使測序背景噪音由1％下降到1‰；另一方面，特異性分子標簽可以用于識別原始dna片段和pcr后的擴增產(chǎn)物，有效區(qū)分pcr重復片段，提高了測序的精確度。如圖4所示，選擇定位于染色體不同位置的共21個dna分子，對每個dna分子的測序數(shù)據(jù)分別使用比對序列位置去重和矯正錯誤率以及特異性分子標簽矯正錯誤率，比較原始測序數(shù)據(jù)錯誤率、比對序列位置去重和矯正后的錯誤率和使用特異性分子標簽矯正后的錯誤率，結果發(fā)現(xiàn)特異性分子標簽矯正可以顯著降低原始數(shù)據(jù)中錯誤率，且效果優(yōu)于傳統(tǒng)比對比對序列位置去重和矯正錯誤率的方法。如圖3所示的單分子標記接頭-2是截斷后的單分子標記接頭-1，在單分子標記接頭-2連接待測dna分子后，利用引物1(5’-aatgatacggcgaccaccga-3’)和引物2(5’-caagcagaagacggcatacga-3’)在對文庫進行富集擴增時將在單分子標記接頭-2的序列延伸為單分子標記接頭-1的序列；單分子標記接頭-2的序列相對單分子標記接頭-1的序列比較短，有效降低了單分子標記接頭的合成成本。實施例4提取基因組dna和cfdna1、樣本采集和血漿分離(1)樣本采集：抽取供體血液8ml左右，用抗凝血管保存運輸；(2)血漿分離：獲得新鮮全血樣本，1600g，4℃離心10min，分離上清液至新的離心管，將上清液繼續(xù)16000g，4℃離心10min，離心后的上清液轉移至新的離心管，得到分離后的血漿，血漿可在-20℃下保存；(3)血細胞分離：全血樣本離心后的下層沉淀即為血細胞。2、使用萊楓基因組dna提取試劑盒(dk603)提取分離后的血細胞，得到基因組dna；用萊楓游離dna提取試劑盒(dk607)抽提分離后血漿，得到cfdna。實施例5文庫構建1、分別取1μlcfdna進行quantifluortm-st(promega)定量，另取1μl使用agilent2100檢測質(zhì)量。2、以基因組dna和cfdna作為樣本，使用kapaltplibrarypreparationkit分別制備基因組dna文庫和cfdna文庫，具體步驟如下所示：(1)末端補平a.向標記好的離心管中加入表3所示的末端補平混合液，用移液器吹打混勻；表3末端補平混合液試劑名稱體積水8μlkapaendrepairbuffer(10x)7μlkapaendrepairenzymemix5μl總體積20μlb.取50μl步驟2中定量后的樣本，加入20μl表3所示的末端補平混合液，得到總體積為70μl的樣本反應液，用移液器吹打混勻；c.在pcr儀上運行如下程序：20℃保持30min，10℃靜置。(2)補平后純化重懸浮agencourtampurexpreagent，磁珠室溫放置30min。a.樣品管中加入120ul磁珠和步驟(1)中末端補平后的樣本反應液，充分吹打混勻，室溫靜置5min；b.將樣品管置于磁力架上，待上清澄清后，吸棄上清；c.保持樣品管在磁力架上，加入200μl新鮮配制的80％乙醇，室溫孵育至少30sec，轉動離心管以清洗磁珠，吸棄上清；d.保持樣品管在磁力架上，加入200μl新鮮配制的80％乙醇，室溫孵育至少30秒，轉動離心管以清洗磁珠，吸棄上清；e.將樣品管瞬時離心，放置于磁力架上去掉殘存的乙醇，室溫晾干至磁珠表面無明亮反光后，從磁力架上取下樣品管，加入42ulnuclease-freewater重懸磁珠。(3)加a尾a.根據(jù)樣本的數(shù)量，計算所需試劑用量，于標記好的離心管中加入表4所示的混合液，用移液器吹打混勻；表4加a尾混合液試劑名稱1個樣本8個樣本48個樣本kapaa-tailingbuffer(10x)5μl40μl240μlkapaa-tailingenzyme3μl24μl144μl總體積8μl64μl384μlb.取42μl步驟(2)中純化后的樣本，加入8μl表4所示的混合液，總體積為70μl，用移液器吹打混勻；c.在pcr儀上運行如下程序：30℃保持30min，10℃靜置。(4)加a尾后純化a.樣品管中加入kapapeg/naclsprisolution90μl和步驟(3)中加a尾后的樣本反應液，充分吹打混勻，室溫靜置5min；b.將樣品管置于磁力架上，待上清澄清后，吸棄上清；c.保持樣品管在磁力架上，加入200μl新鮮配制的80％乙醇，室溫孵育至少30sec，轉動離心管以清洗磁珠，吸棄上清；d.保持樣品管在磁力架上，加入200μl新鮮配制的80％乙醇，室溫孵育至少30sec，轉動離心管以清洗磁珠，吸棄上清；e.將樣品管瞬時離心，放置于磁力架上去掉殘存的乙醇，室溫晾干至磁珠表面無明亮反光后，從磁力架上取下樣品管，加入32ulnuclease-freewater重懸磁珠。(5)加單分子標記接頭a.根據(jù)樣本的數(shù)量，計算所需試劑用量，于標記好的離心管中加入如下表5所示的接頭連接混合液和步驟(4)所得純化后的樣本(beadswithdna)，用移液器吹打混勻：表5接頭連接混合液試劑名稱1個樣本單分子標記接頭5μl5xkapaligationbuffer10μlkapat4dnaligase5μlbeadswithdna30μl總體積18μlc.連接：20℃保持15min。(6)加接頭后磁珠純化(7)文庫擴增a.室溫解凍2xkapahifihotstartreadymix，于標記好的離心管中加入表6所示的文庫擴增體系，用移液器吹打混勻；表6文庫擴增體系b.取23μl步驟(6)中的純化樣本加入27μl表6所示的pcr擴增體系，總體積50μl，用移液器輕輕混勻，瞬時離心2s，在pcr儀上運行如下程序：98℃變性45s，8個循環(huán)(98℃變性45s，65℃退火30s，72℃延伸30s)，72℃延伸1min，4℃冷卻靜置。(8)文庫鑒定取2μl步驟(7)所得pcr產(chǎn)物于2％瓊脂糖凝膠電泳，確定片段分布于250-500bp之間。(9)文庫純化a.加入agencourtampurexpreagent50μl于樣品管中，樣本管中盛裝有步驟(7)中擴增后的文庫樣本，充分吹打混勻，室溫靜置5min。b.瞬時離心樣品管2s，置于磁力架上5min，吸棄上清。c.保持樣品管在磁力架上，加入200μl新鮮配制的80％乙醇，快速轉動樣品管以清洗磁珠，吸棄上清。d.將樣品管瞬時離心，放置于磁力架上去掉殘存的乙醇，室溫晾干至磁珠表面無明亮反光，加入22μlnucleasefreewater，用移液器吹打混勻。室溫靜置2min，再次放置于磁力架上，取20μl上清于新的離心管。e.取1μl樣本使用quantifluortm-st(promega)精確定量，得到樣本文庫，將樣本文庫保存至-20℃或進行下一步的雜交捕獲。實施例6文庫目標區(qū)域雜交捕獲、測序1、根據(jù)實施例5中純化后的文庫樣本濃度吸取總量為500ng的樣本至新的1.5ml離心管，加入表7所示試劑，放入濃縮儀濃縮至完全干燥，如不立即進行下一步實驗，可室溫(15-25℃)放置過夜；表7濃縮體系名稱體積cot-1dna5μlxgenuniversalblockingoligop51μlxgenuniversalblockingoligop7(6nt)1μl2、雜交體系配制與文庫的變性(1)室溫溶解xgen2xhybridizationbuffer，根據(jù)文庫樣本數(shù)量，配制表8所示的雜交混合液，用移液器吹打混勻，通過傳遞窗傳遞至513室；表8雜交混合液試劑名稱1個反應體積xgen2xhybridizationbuffer8.5μlxgenhybridizationbufferenhancer2.7μlnuclease-freewater1.8μl總體積13μl(2)向每管步驟1中濃縮完成后的樣本加入13μl表8所示的雜交混合液，室溫靜置5min；(3)用移液器吹打混勻樣本并轉移至low-bind0.2mlpcr管，將樣本放入pcr儀運行如下程序：95℃保持10min，65℃靜置；(4)當95℃運行結束時，保持樣本在pcr儀上，立即加入4μlxgenlockdownprobepool，用移液器吹打混勻，避免產(chǎn)生氣泡，此時反應總體積為17μl。(5)記錄雜交開始時間，根據(jù)實驗進度，選擇4h或16h雜交時間。3、配制washbuffer(1)根據(jù)表9將xgen2xbeadwashbuffer、xgen10xwashbufferi、xgen10xwashbufferii、xgen10xwashbufferiii、xgen10xstringentwashbuffer配制成1x工作液，移液器吹打混勻；表9工作液體系(2)準備稀釋好的washbufferi和stringentwashbuffer，按表10條件存放，其它試劑于室溫存放(保證65℃孵育時間不少于2h)；表10存放條件試劑名稱1x工作液體積1x工作液儲存溫度washbufferi100μl65℃washbufferi200μl室溫(15-25℃)stringentwashbuffer400μl65℃(3)準備m-270磁珠從4℃冰箱中取出m-270磁珠，確認磁珠已放置于室溫30min，渦旋混勻使磁珠重懸??；①在1.7mllow-bind管中為每個樣本準備100μl磁珠；②將low-bind管置于磁力架上，靜置至管內(nèi)液體澄清，吸棄上清；③加入200μl1xbeadwashbuffer，渦旋混勻10sec，靜置于磁力架上至管內(nèi)液體澄清，吸棄上清；④重復步驟③一次；⑤加入100μl1xbeadwashbuffer，移液器吹打混勻。⑥將100μl懸浮磁珠轉移至新的0.2mllow-bind管，置于磁力架上，靜置至管內(nèi)液體澄清，吸棄上清；4、捕獲(1)確認步驟2的雜交反應已滿足4h，保持樣本和磁珠在pcr儀上，將樣品轉至準備好的磁珠管內(nèi)，移液器吹打混勻，避免產(chǎn)生氣泡；(2)65℃孵育45min，期間每隔12min將磁珠混勻(保持樣本在pcr儀上)，避免產(chǎn)生氣泡。5、洗滌注意以下步驟需在65℃條件下快速操作：(1)每個樣本加入100μl1xwashbufferi(65℃預熱)，快速混勻；(2)將樣品轉移至一新的1.7ml管中(65℃預熱)，快速混勻；(3)樣品管置于磁力架上，靜置至管內(nèi)液體澄清，吸棄上清；(4)加入200μl1xstringentwashbuffer(65℃預熱)，輕柔混勻，65℃水浴5min。樣品管置于磁力架上，靜置至管內(nèi)液體澄清，吸棄上清；(5)重復步驟(4)一次；(6)加入200μl常溫1xwashbufferi，渦旋混勻2min。樣品管置于磁力架上，靜置至管內(nèi)液體澄清，吸棄上清；(7)加入100μl常溫1xwashbufferⅱ，渦旋混勻1min。樣品管置于磁力架上，靜置至管內(nèi)液體澄清，吸棄上清；(8)加入200μl常溫1xwashbufferⅲ，渦旋混勻30sec，樣品管置于磁力架上，靜置至管內(nèi)液體澄清，吸棄上清；(9)將樣品管從磁力架上取下，加入20μlnuclease-freewater，移液器吹打混勻，確保所有磁珠處于懸浮狀態(tài)并全部轉至0.2mlpcr管。6、pcr富集(1)室溫解凍2xkapahifihotstartreadymix，配制表9所示的pcr擴增體系，快速混勻：表9pcr擴增體系試劑名稱基因組文庫2xkapahifihotstartreadymix25μl10ump5/p7primer2μl總體積27μl(2)每個樣本(23ul)加入27μlpcrmix，總體積50μl，用移液器輕輕混勻，瞬時離心2s，在pcr儀上運行如下程序：98℃變性45s，12個循環(huán)(98℃變性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s)，72℃延伸1min，4℃冷卻靜置。7、純化重懸浮agencourtampurexpreagent，確認磁珠已放置室溫30min，每個樣本用70μlbeads純化，20μl洗脫。8、文庫定量a.取1μl步驟7中純化后的樣品用qubitfluorometer3.0定量；b.取2μlpcr產(chǎn)物用于2％瓊脂糖凝膠電泳，剩余樣本于-20℃保存。9、送測樣本數(shù)據(jù)量為10mreads，插入片段選擇178(測序平臺為illuminex-ten，或其他高通量測序平臺)。實施例7異源cfdna定量分析1、對基因組dna文庫和cfdna文庫高通量測序后數(shù)據(jù)callsnp(samtool)，提取5764個snp位點信息；2、對基因組dna文庫中的5764個snp位點進行分析，進行基因分型，如圖5所示，測序深度為50x時，即可獲得基因分型；篩選受體患者基因組上為純合型的snp位點作為有效snp位點；3、根據(jù)步驟2中的有效snp位點對cfdna文庫進行分析，檢測cfdna測序結果的有效位點處異源snp信號占cfdna在有效位點處總測序信號的比例；4、計算方式如下所示：假設受體患者基因組上有一個有效snp位點，基因組上純合型的位點基因型為aa，檢測到異源snp信號為a，則可以得到供體在此位點的基因型為aa或aa,基因分型如表6所示，根據(jù)異源snp信號的兩種基因型，統(tǒng)計異源cfdna信號，計算出異源cfdna濃度，如下：表6基因分型當供體基因型為aa，異源信號比例＝a型reads數(shù)/a型reads數(shù)；當供體基因型為aa，異源信號比例＝2*a型reads數(shù)/a型reads數(shù)。實施例9繪制標準樣回歸曲線1、取2個正常人血樣，一個作為供體，另一個作為受體；2、根據(jù)實施例4所述方法提取受體基因組dna、受體cfdna和供體cfdna；3、受體的cfdna中摻入供體cfdna，按1％、2％、4％、6％、8％的供體cfdna濃度混合，同時每個濃度梯度有三個樣品的重復；3、根據(jù)實施例5所述方法構建基因組dna文庫和步驟3中得到的混合cfdna文庫；4、根據(jù)實施例6所述方法構建雜交捕獲基因組dna文庫、混合cfdna文庫的目標區(qū)域后測序；5、根據(jù)實施例7所述方法測定混合cfdna文庫中供體cfdna的比例，繪制得到圖6所示的線性回歸圖，檢測待測樣品中的異源信號比例即異源cfdna檢測值代入上述線性回歸圖中，進而可以計算得到待測樣品中異源cfdna濃度。實施例10腎移植排斥患者檢測選擇兩例活檢后確認有排斥反應的腎移植病人，以健康人作為陰性對照，檢測腎移植病人血漿中的cfdna異源信號，如圖7所示，在健康的對照樣本中，未檢出異源cfdna信號，圖片中僅顯示健康樣本的測序噪音；在兩例腎移植排斥病人中可以檢出明顯的cfdna信號，說明異源cfdna的定量方法檢測靈敏度和準確度高。顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護范圍之中。sequencelisting<110>蘇州人人基因科技有限公司<120>檢測異源cfdna的snp分子標記及檢測方法、用途<130>sha201700229<160>10<170>patentinversion3.3<210>1<211>58<212>dna<213>人工序列<400>1aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct58<210>2<211>33<212>dna<213>人工序列<400>2acactctttccctacacgacgctcttccgatct33<210>3<211>64<212>dna<213>人工序列<400>3agatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacatcacgatctcgtatgccgtcttctg60cttg64<210>4<211>33<212>dna<213>人工序列<400>4agatcggaagagcacacgtctgaactccagtca33<210>5<211>15<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(6)<223>nisa,c,g,ort<400>5nnnnnngtcagtact15<210>6<211>73<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(59)..(64)<223>nisa,c,g,ort<400>6aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatctnn60nnnngtcagtact73<210>7<211>48<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(34)..(39)<223>nisa,c,g,ort<400>7acactctttccctacacgacgctcttccgatctnnnnnngtcagtact48<210>8<211>78<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(9)..(14)<223>nisa,c,g,ort<400>8gtactgacnnnnnnagatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacatcacgatctcg60tatgccgtcttctgcttg78<210>9<211>47<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(9)..(14)<223>nisa,c,g,ort<400>9gtactgacnnnnnnagatcggaagagcacacgtctgaactccagtca47<210>10<211>14<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(9)..(14)<223>nisa,c,g,ort<400>10gtactgacnnnnnn14當前第1頁12