本發(fā)明屬于生物工程領域，具體地說，是關于一種利用單拷貝核基因檢測食品和飼料中山羊源性成分的實時熒光pcr檢測方法。
背景技術：
：由于山羊肉與綿羊肉的區(qū)分一直存在很大的困難，因此在很多的食品與飼料的檢測當中通常不去區(qū)分山羊和綿羊，只檢測是否含有羊成分，這在無形當中對食品安全埋下了隱患，也使得一些不法分子進行摻假牟利有了可乘之機。2013年初，瑞典、英國等多個歐洲國家卷入“馬肉風波”丑聞中，引起各國對肉及肉制品摻假問題的關注。在我國，“摻假”問題一直是消費者投訴的焦點和社會關注的熱點。一些不法商販和企業(yè)因利益驅使，將豬、鴨等低成本原料摻入牛、羊等高價肉及肉制品中。這些行為不僅侵害消費者利益，還可能因某些宗教食品中含有非清真成分引起糾紛，如果未經檢疫還有可能引起疫病的傳播，不利于維護社會安定和人民身體健康，如果問題產品出口到國外更會損害我國食品企業(yè)的整體形象。為了打擊肉類摻假的違法行為，維護消費者權益和生命安全，保障食品產業(yè)的健康發(fā)展，制定嚴格的法律法規(guī)來約束生產者和經營者的行為是極為重要的，同時也需要制訂準確、靈敏、簡便的檢測方法。常見的肉及肉制品真?zhèn)舞b別技術主要包括：(1)基于蛋白質分子結構的免疫分析技術等；基于蛋白大分子結構的免疫分析方法具有高靈敏度、高通量、操作簡便的特點，可實現(xiàn)對大量樣品的快速檢測。例如，macedo-silva等通過制備抗牛、雞、豬、馬白蛋白的抗血清建立了elisa方法用于鑒別漢堡中可能摻入的廉價肉類成分，靈敏度可達0.6％。但是，基于抗原-抗體特異性結合的免疫分析方法對于親緣關系較近的物種易出現(xiàn)交叉反應。蛋白質三級結構在食物加工過程中可能受到破壞而影響抗體識別也是該方法的重要不足之處。(2)基于核酸的分子生物學技術，如pcr、實時熒光pcr和分子指紋技術等；基于dna序列特異性的分子生物學技術以動物種屬間遺傳信息的差異作為肉種鑒別的檢測靶點而被廣泛使用。相比于蛋白質，dna由于熱穩(wěn)定性高，在加工過程中雖然存在一定程度的降解，但仍能提取出小片段dna用于pcr等分析。同時dna具有特異性高、靈敏度高、不受組織類別限制等諸多優(yōu)勢，對于親緣關系較近的物種具有較高的分辨能力。近年來，基于dna檢測技術的肉及肉制品真實性鑒別方法的研究越來越多。目前主要集中于以pcr為基礎的各類分析方法，其中包括dna測序、多重pcr、實時熒光定量pcr等。特別是實時熒光定量pcr技術在動物源性成分的檢測領域，日漸成為主流檢測技術。pcr技術通過一段特異的寡核苷酸與目標dna序列結合而在體外合成數(shù)以百萬計的dna拷貝。通過物種特異性引物對dna片段進行擴增，通過瓊脂糖電泳分離并觀察特異性條帶是pcr技術鑒別物種成分的最基本方法。線粒體dna在細胞中拷貝數(shù)量大、靈敏度高、進化速度快，具有較高的種間多樣性和較低的種內變異，已被廣泛應用于引物設計和靶序列的擴增。如常用的線粒體基因有細胞色素b基因、12s和16s核糖體rna亞基、d-loop區(qū)。但是，由于線粒體dna序列的拷貝數(shù)高且不恒定，只能應用于動物源性成分的定性檢測，很難應用于定量檢測?！皊peciesidentificationandquantificationinmeatandmeatproductsusingdropletdigitalpcr(ddpcr)analyticalmethods”,c.floren,i.wiedemann,b.brenig,e.schütz,j.beck,foodchemistry173(2015)1054–1058，該文章的結論明確了在定量的時候使用線粒體源的引物和探針會引起結果偏差。目前國內外檢測動物成分的引物和探針一般都是針對線粒體基因設計的，線粒體基因在細胞中的拷貝數(shù)在5000-6000拷貝或更多。但在實際研究工作中發(fā)現(xiàn)：利用多拷貝的線粒體基因設計出一套引物和探針進行檢測時，其ct值可低達為13左右，如此低的ct值，當樣品中動物源性成分在0.00000001％時，ct值仍然在37左右。在目標檢測物如此低的檢測濃度，出現(xiàn)這樣的ct值，使檢測人員很難判斷實際樣品是真正含有目標成分，還是樣品受到非常輕微的污染。所以利用線粒體基因設計引物和探針進行檢測，容易出現(xiàn)假陽性結果或很難判斷低目標含量下的檢測結果。如果根據(jù)這么低的ct值來出具陽性檢測報告，會引出很大的貿易糾紛。因此，有必要建立一套特異性好、靈敏度高、可以避免出現(xiàn)假陽性結果等的食品和飼料中山羊源性成分的實時熒光定量pcr檢測方法。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明通過研究發(fā)現(xiàn)：檢測某一個動物純肉樣品中的動物源性成分，利用單拷貝的核基因設計的引物和探針進行檢測，其ct值為22-24時，當樣品中動物源性成分在0.001％時，ct值在37左右。為此本發(fā)明利用單拷貝的核基因進行物種鑒別檢測，結果發(fā)現(xiàn)利用單拷貝基因檢測可避免出現(xiàn)假陽性結果或很難判斷結果的情況發(fā)生，并且利用單拷貝的核基因進行檢測，還能進行定量檢測，所以尋找單拷貝的核基因進行檢測并據(jù)此建立標準方法顯得非常必要。本發(fā)明首要目的在于提供一種食品和飼料中山羊源性成分的實時熒光pcr檢測方法，以克服現(xiàn)有技術所存在的難于定量檢測、容易出現(xiàn)假陽性結果等的不足。本發(fā)明的第二個目的在于提供一種檢測試劑盒以及檢測試劑盒的應用。本發(fā)明的第三個目的在于提供一種食品和飼料中山羊源性成分的實時熒光pcr檢測方法的引物對和探針。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案：作為本發(fā)明的第一個方面，一種利用單拷貝核基因檢測食品和飼料中山羊源性成分的實時熒光pcr檢測方法，該方法包括以下步驟：第一步，以待測樣品的dna為模板，進行熒光定量pcr擴增，獲得pcr擴增產物；第二步，檢測擴增產物的熒光信號；第三步，以檢測結果的ct值判定樣品中是否含有山羊源性成分以及定量檢測樣品中的山羊源性成分的含量；其中，用于pcr擴增的反應體系中含有擴增山羊源性成分的特異性引物對和山羊源性成分的特異性探針，所述擴增山羊源性成分的特異性引物對的序列如seqidno.1和seqidno.2所示，所述山羊源性成分的特異性探針的序列如seqidno.3所示。根據(jù)本發(fā)明，所述pcr擴增的條件如下：反應體系為25μl：實時熒光pcr試劑(2×)12.5μl，引物各10μm，探針5μm，dna模板5μl；pcr反應條件：95℃10min；95℃15s；60℃1min；共45個循環(huán)。作為本發(fā)明的第二個方面，一種山羊源性成分的檢測試劑盒，該檢測試劑盒含有以下試劑：(a)擴增山羊源性成分的特異性引物對；(b)山羊源性成分的特異性探針；其中，所述擴增山羊源性成分的特異性引物對的序列如seqidno.1和seqidno.2所示，所述山羊源性成分的特異性探針的序列如seqidno.3所示。進一步的，所述檢測試劑盒還包括：(c)標準參照物，用于定量檢測樣品中的山羊源性成分的含量。作為本發(fā)明的第三個方面，一種所述的檢測試劑盒的應用，所述檢測試劑盒用于定性或定量檢測食品或飼料中的山羊源性成分。作為本發(fā)明的第四個方面，一種山羊源性成分的特異性引物對和探針，所述特異性引物對的序列如seqidno.1和seqidno.2所示，所述特異性探針的序列如seqidno.3所示。本發(fā)明的有益效果是：1、提供了一種來源于核基因的可特異性鑒定山羊源性成分的引物對和探針，其特異性良好，對于山羊源性成分能夠實現(xiàn)特異性擴增，而對于山羊以外的其它成分則不能特異性擴增；而且，所述引物對和探針具有良好的再現(xiàn)性、結果穩(wěn)定可靠。2、利用所述的引物對和探針可快速、大批量地檢測食品或飼料中是否存在山羊源性成分以及定量檢測食品或飼料中的山羊源性成分的含量，并且所需樣品量少，操作簡單，靈敏度高。3、本發(fā)明的山羊源性成分的實時熒光pcr檢測方法，其適用范圍廣，特別適用于各類食品或飼料中的山羊源性成分的檢測，因此可以推廣應用，對保障產品的質量，保護消費者知情權和選擇權，維護正常的經濟秩序等提供了技術支持，為食品的市場監(jiān)督部門和檢驗檢疫部門提供了技術支持。附圖說明圖1為實施例1的第一組引物對和探針的實時熒光pcr靈敏度試驗擴增曲線圖。其中，擴增曲線從左到右分別是40ng/μl，20ng/μl，10ng/μl，1ng/μl，0.1ng/μl，0.01ng/μl山羊dna樣品。圖2為實施例1的第二組引物對和探針的實時熒光pcr靈敏度試驗擴增曲線圖。其中，擴增曲線從左到右分別是40ng/μl，20ng/μl，10ng/μl，1ng/μl，0.1ng/μl，0.01ng/μl山羊dna樣品。圖3為實施例1的第一組引物對和探針的實時熒光pcr引物特異性試驗的擴增曲線圖。其中，擴增曲線為山羊標準品。圖4為山羊源性成分的定量標準曲線。具體實施方式以下結合具體實施例，對本發(fā)明作進一步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克?。簩嶒炇沂謨浴?newyork：coldspringharborlaboratorypress，1989)中所述的條件或廠商提供的條件進行。本發(fā)明的實驗材料如下：(1)山羊(caprahircus)、綿羊(ovisaries)、家牛(bostaurus)、驢(equusasinus)、馬(equuscaballus)、雞(gallusgallus)、鴨(anasplatyrhynchos)、鵝(anseranser)、火雞(meleagrisgallopavo)、豬(susscrofa)、鵪鶉(coturnixcoturnix)、駱駝(camelusdromedarius)、家貓(feliscatus)的dna標準品購自于美國zyagenlaboratories公司。(2)山羊肉、牛肉、鳊魚肉、鯧魚肉、黃魚肉、大馬哈魚肉等動物成分為市售產品。(3)大鼠肉、小鼠肉購買于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。(4)大米、玉米、黃豆、小米、綠豆、紅薯、馬鈴薯、白云豆、蘋果、芹菜等植物成分為市售產品。(5)用于實際驗證的雞肉火腿臘腸(進口)、豬肉火腿臘腸(進口)、牛肉火腿臘腸(進口)、山羊肉香腸、山羊排、牛肉午餐肉、豬肉午餐肉、紅燒牛肉罐頭、牛肉干、豬肉脯、牛肉丸、咖喱牛肉醬、羊肉味狗糧、雞肉味狗糧(進口)、牛肉味狗糧(進口)、吞拿魚貓罐頭(進口)為市售產品。(6)澳大利亞寵物級雞肉骨粉由上海海關口岸提供。實施例1引物對和探針的設計(1)第一組引物對和探針的設計根據(jù)ncbi中已發(fā)表的山羊(caprahircusbreedyunnanblackgoat)染色體9的dna序列(登錄號：nc_022301)，選取合適的序列片段進行引物探針設計。針對山羊源性成分的目的片段長度為87bp。熒光pcr引物對和探針的序列如下：goat-87bp-f：5’-ggaaggaaagagaatggggatatgg-3’(seqidno：1)goat-87bp-r：5’-tctccacacacagccaaaacc-3’(seqidno：2)goat-87bp-p：fam-atccatctctccctccactccctgcctaa-tamra(seqidno：3)其中，fam表示熒光報告基團，tamra表示淬滅基團。本發(fā)明采用熒光探針法，其檢測原理是利用熒光標記特異性探針來識別模板。與現(xiàn)有技術中sybr染料法相比，本發(fā)明熒光標記特異性探針的特異性更強，背景干擾更低。(2)第二組引物對和探針的設計根據(jù)ncbi中已發(fā)表的山羊(caprahircusbreedyunnanblackgoat)染色體9的dna序列(登錄號：nc_022301)，選取當中合適的片段設計引物對和探針，引物對和探針如下：goat-105bp-f：5’-atgagtgtctgtgtctctgtgtaag-3’(seqidno：4)goat-105bp-r：5’-acaaatttcttcacatgcacaataagc-3’(seqidno：5)goat-105bp-p:fam-acccacagcccagtctctacaaacacaca-tamra(seqidno：6)goat-105bp-p:fam-acccacagcccagtctctacaaacacaca-tamra(seqidno：6)其中，fam表示熒光報告基團，tamra表示淬滅基團。本發(fā)明采用熒光探針法，其檢測原理是利用熒光標記特異性探針來識別模板。與現(xiàn)有技術中sybr染料法相比，本發(fā)明熒光標記特異性探針的特異性更強，背景干擾更低。(3)第一組引物對和探針和第二組引物對和探針的實時熒光pcr的反應體系和反應程序實時熒光pcr反應體系見表1：其中，實時熒光pcr反應程序為：95℃10min；95℃15s,60℃1min；共45個循環(huán)。表1山羊源性成分實時熒光pcr反應體系實施例2測試樣品的準備動物肉類樣品經撕碎、烘干后，使用冷凍研磨機(spex6850)磨成粉末狀。植物樣品和用于實際驗證的樣品直接使用冷凍研磨機(spex6850)磨成粉末狀。實施例3dna的抽提使用動物基因組提取試劑盒(天根生化科技有限公司；目錄號：dp323)提取動物樣品dna，植物基因組提取試劑盒(天根生化科技有限公司；目錄號：dp305)提取植物樣品dna，動物源性植物飼料基因組提取試劑盒(天根生化科技有限公司；目錄號：dp323)提取混合樣品及實際驗證樣品dna，提取方法詳見試劑盒操作說明書。dna溶液置于-20℃保存?zhèn)溆谩嵤├?山羊源性成分的引物對和探針的靈敏度檢測以山羊dna含量40ng/μl，20ng/μl，10ng/μl，1ng/μl，0.1ng/μl，0.01ng/μl，0.001ng/μl和0.0001ng/μl為樣品dna為模板，進行實時熒光pcr檢測，試驗重復6次。結果：(1)第一組引物對和探針：在6次檢測中，40ng/μl，20ng/μl，10ng/μl，1ng/μl，0.1ng/μl，0.01ng/μl的山羊樣品dna中均出現(xiàn)擴增曲線，而0.001ng/μl和0.0001ng/μl山羊樣品dna未出現(xiàn)擴增曲線，如圖1。(2)第二組引物對和探針：在6次檢測中，40ng/μl，20ng/μl，10ng/μl，1ng/μl，0.1ng/μl，0.01ng/μl的山羊樣品dna中均出現(xiàn)擴增曲線，但是擴增曲線與dna濃度不成比例，如圖2。結論：1、第一組引物對和探針在模板使用量為0.01ng/μl時，有明顯s型擴增曲線，檢出靈敏度達到0.01ng/μl，第一組山羊源性成分的引物對和探針具有較好的準確性；2、第二組引物對和探針和第一組引物對和探針存在明顯差異。第二組引物對和探針在靈敏度檢測中的效果不明顯。由于第二組山羊源性成分的引物對和探針在靈敏度檢測中的效果不明顯，因此后續(xù)試驗僅針對第一組山羊源性成分的引物對和探針。實施例5山羊源性成分的引物對和探針的特異性檢測本實施例使用實施例1的山羊源性成分的引物對和探針對實施例3供試的32種動植物材料dna樣品進行檢測，檢測擴增產物的熒光信號。檢測結果的總結見表2和圖3。表2山羊源性成分的特異性檢測結果序號樣品名稱試驗結果序號樣品名稱試驗結果1山羊dna+17牛肉—2綿羊dna—18鳊魚肉—3驢dna—19鯧魚肉—4家牛dna—20黃魚肉—5馬dna—21大馬哈魚肉—6雞dna—22大鼠肉—7鴨dna—23小鼠肉—8鵝dna—24大米—9鵪鶉dna—25玉米—10火雞dna—26黃豆—11豬dna—27小米—12駱駝dna—28綠豆—13家貓dna—29紅薯—14狗dna—30馬鈴薯—15鹿dna—31白云豆—16芹菜—32蘋果—從圖3和表2可以看出，引物對和探針僅對山羊dna肉樣品擴增陽性，有明顯s型擴增曲線，而對其它多個物種dna樣品均擴增陰性，無明顯s型擴增曲線。結論：本發(fā)明的檢測方法具有良好的物種特異性。實施例6山羊源性成分的引物對和探針的實際驗證采用實施例5的檢測方法，對市場上、進出口貿易途徑收集的17份肉質食品和動物飼料等樣品進行檢測。結果見表3。表317份待測樣品的山羊源性成分的檢測結果從表3可以看出，在2份肉質食品(山羊肉香腸、山羊排)中檢出山羊源性成分；其余的食品和飼料中未檢出山羊源性成分。結論：抽取樣品的肉質來源與檢測結果相符，說明該方法可以準確的檢測出食品和飼料中是否含有山羊源性成分。同時也說明采用實施例4的檢測方法可以大批量地檢測食品或飼料中是否存在山羊源性成分。實施例7定量標準曲線的建立(1)山羊源性成分引物對和探針的定量檢測將實施例3抽提獲得的山羊dna稀釋成100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、0.1ng/μl、0.01ng/μl，共五個濃度梯度，使用實施例1的引物對和探針進行檢測，每個濃度6個重復，獲得ct值。陰性對照為水。如表4所示，其中ct值為6個重復試驗的平均值。表4實時熒光pcr定量檢測試驗的ct值模板用量(ng/ul)ct值10022.7361026.471130.2060.134.0990.0137.492陰性對照-結論：可以看出隨著山羊源性成分的濃度降低，擴增ct值呈梯度增大，并呈一定的線性關系(r2＝0.999)。(2)數(shù)據(jù)的處理和計算結果如圖4所示，以dna濃度的對數(shù)值為橫坐標，以樣品的6次重復試驗的ct值的平均值為縱坐標，取點進行曲線擬合，得定量標準直線，線性方程為y＝3.714x+19.05，且r2＝0.999。對于需定量的樣品，每次測得待測樣品的各自的ct值，利用標準曲線公式求得相應的x值。即能得出待測樣品的山羊源性成份的含量。(3)定量標準曲線的驗證按實施例3的方法抽提dna，分別稀釋定量6個獨立的樣本，濃度分別為50ng/μl和0.5ng/μl的，檢測各自的ct值，并通過定量標準曲線計算其中的山羊源性成份的含量，用以驗證該方法的重復性。結果顯示，50ng樣品測得值的平均值為52.3ng，0.5ng樣品測得值的平均值為0.44ng。結論：說明采用本實施例的方法在一定動態(tài)范圍內具有精確定量的能力。從而證明本發(fā)明的方法實際測得值與理論值相符，重復性好。本發(fā)明建立了利用單拷貝核基因檢測食品和飼料中山羊源性成分的實時熒光pcr方法，針對山羊物種的核基因設計引物對和探針，僅需結合實時熒光擴增曲線圖，不超過兩個小時就能準確檢測到樣品中是否存在山羊源性成份，其靈敏度為0.01ng/μl。綜上所述，本發(fā)明設計的山羊源性成份實時熒光pcr擴增的特異性引物對和探針不僅特異性好，而且靈敏度高，為快速準確地區(qū)分是否含有山羊源性成分提供了一種很好的檢測方法，在食品安全領域的檢測把關上，具有良好的應用前景。而且，所述特異性引物對和探針可采用本領域中已知的方法，進一步制成檢測試劑盒，所述檢測試劑盒除了所述特異性引物對和探針外，還可以包括標準參照物，這對于本領域的技術人員來說是顯而易見的。以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等同物界定。序列表<110>上海出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢驗檢疫技術中心<120>利用單拷貝核基因檢測食品和飼料中山羊源性成分的實時熒光pcr方法<130>171009<160>6<170>patentinversion3.3<210>1<211>25<212>dna<213>人工序列1<400>1ggaaggaaagagaatggggatatgg25<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列2<400>2tctccacacacagccaaaacc21<210>3<211>29<212>dna<213>人工序列3<400>3atccatctctccctccactccctgcctaa29<210>4<211>25<212>dna<213>人工序列4<400>4atgagtgtctgtgtctctgtgtaag25<210>5<211>27<212>dna<213>人工序列5<400>5acaaatttcttcacatgcacaataagc27<210>6<211>29<212>dna<213>人工序列6<400>6acccacagcccagtctctacaaacacaca29當前第1頁12