本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及自閉癥生物標志物及其檢測試劑盒、應用。

背景技術(shù)：

自閉癥(asd，autismspectrumdisorders)或稱孤獨癥或者孤獨癥譜系障礙，是廣泛性發(fā)育障礙的一種亞型，以男性多見，起病于嬰幼兒期，主要表現(xiàn)為不同程度的言語發(fā)育障礙、人際交往障礙、興趣狹窄和行為方式刻板，約有3/4的患者伴有明顯的精神發(fā)育遲滯。據(jù)美國疾病監(jiān)控與預防中心(cdc)數(shù)據(jù)，2015年其發(fā)病率1/45(即2.24％)。我國尚缺乏全國性流行病調(diào)查數(shù)據(jù)，若以1/100估算，預估我國asds患者將超過1000萬。

自閉癥(asd)作為一種兒童精神疾病嚴重影響患兒的社會功能，給患兒家庭和社會帶來沉重負擔，但是目前自閉癥通常根據(jù)量表進行評估，沒有血液診斷方法和有效的治療方案，這樣診斷將依靠主觀經(jīng)驗判斷，不僅不能對自閉癥的發(fā)病提供有效預警，而且診斷準確率很低。因此研究自閉癥發(fā)病機理和可以體現(xiàn)其嚴重程度的生物標志物，并及時針對病因進行干預與治療是治療疾病、減輕社會負擔的關(guān)鍵因素。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供了自閉癥生物標志物；本發(fā)明還提供了用于診斷自閉癥的試劑盒；本發(fā)明進一步還提供一種篩選易患自閉癥的生物樣品的系統(tǒng)。

本發(fā)明第一方面提供了自閉癥生物標志物，包括腸道宏基因組特征，具體表現(xiàn)為酸桿菌門的水平。

在一優(yōu)選例中，所述腸道宏基因組特征還表現(xiàn)為放線菌門、衣原體門、螺旋體門、β-變形菌綱、衣原體綱、dehalococcoidetes綱、螺旋體綱、酸硫桿菌目、雙歧桿菌目、衣原體目、著色菌目、dehalococcoidales目、蟲原體目、丹毒絲菌目、鹽厭氧菌目、奈氏球菌目、螺旋體目、synergistales目、thermoanaerobacterales目、氨基酸球菌科、酸硫桿狀菌科、食烷菌科、雙歧桿菌科、短螺旋體科、纖維素單胞菌科、dehalococcoidaceae科、外硫紅螺旋菌科、蟲原體科、赤桿菌科、戈登氏菌科、河氏菌科、鹽厭氧菌科、軍團菌科、甲烷粒菌科、甲烷螺菌科、甲基桿菌科、奈瑟氏菌科、類芽胞桿菌科、粘土桿菌科、消化球菌科、芯卡體科、螺旋體科、葡萄球菌科、互養(yǎng)菌科、互營單胞菌科、醋酸桿菌屬、氨基酸球菌屬、雙歧桿菌屬、短螺菌屬、短芽孢桿菌屬、熱解纖維素菌屬、檸檬酸桿菌屬、克洛諾菌屬、脫亞硫酸菌屬、脫硫芽孢彎曲菌屬、脫硫腸狀菌屬、產(chǎn)氫新菌屬、大芬戈爾德菌屬、鹽厭氧菌屬、纖毛菌屬、沙門氏菌屬、sphaerochaeta屬、互營單胞菌屬、tepidanaerobacter屬、四聯(lián)球菌屬、thermincola屬、密螺旋體屬、acaryochlorismarinambic11017、醋酸桿菌屬woodiidsm1030、氨基酸球菌屬fermentans、氨基酸球菌屬fermentansdsm20731、氨基酸球菌屬intestini、鮑曼不動桿菌屬baumanniiatcc17978、advenellakashmirensiswt001、alcanivoraxborkumensissk2、alicycliphilusdenitrificans、aliivibriounclassified、alkalilimnicolaehrlichiimlhe-1、alkaliphilusoremlandiiohilas、allochromatiumvinosumdsm180、anaeromyxobactersp.fw109-5、archaeoglobusveneficussnp6、節(jié)細菌屬亞種fb24、azoarcussp.bh72、azospirillumunclassified、芽胞桿菌科unclassified、蘇云金桿菌、巴爾通氏體屬tribocorum、雙歧桿菌animalis、雙歧桿菌bifidobacteriumanimalissubsp.lactis、博代氏桿菌屬鳥結(jié)核197n、borreliaburgdorferigroup、brachyspiramurdochiidsm12563、brachyspirapilosicoli95/1000、buchneraaphidicola、burkholderiaphymatumstm815、burkholderiapseudomallei1710b、burkholderiasp.ccge1002、burkholderiasp.ccge1003、burkholderiaxenovoranslb400、caldicellulosiruptor、彎曲桿菌hominisatccbaa-381、彎曲桿菌jejunisubsp.jejuniicdccj07001、candidatusaccumulibacterphosphatiscladeiiastr.uw-1、candidatuschloracidobacteriumthermophilumb、candidatusprotochlamydiaamoebophilauwe25、cellulosilyticumlentocellum、chlamydophilapneumoniaej138、chlamydophilaunclassified、梭菌屬genomosp.bvab3、梭狀芽胞桿菌botulinumba4str.657、梭狀芽胞桿菌cellulolyticum、梭狀芽胞桿菌cellulovorans743b、梭狀芽胞桿菌clariflavumdsm19732、梭狀芽胞桿菌kluyveri、梭狀芽胞桿菌sp.bnl1100、梭狀芽胞桿菌sticklandiidsm519、梭狀芽胞桿菌tetanie88、梭狀芽胞桿菌thermocellum、梭狀芽胞桿菌thermocellumatcc27405、棒狀桿菌屬科unclassified、棒狀桿菌屬efficiensys-314、cupriavidusmetalliduransch34、dechlorosomasuillumps、desulfitobacteriumunclassified、desulfosporosinusacidiphilussj4、desulfosporosinusorientisdsm765、desulfotomaculumacetoxidansdsm771、desulfotomaculumreducensmi-1、eggerthellasp.yy7918、eggerthellaunclassified、erythrobacterlitoralishtcc2594、fibrobactersuccinogenessubsp.succinogeness85、finegoldiamagnaatcc29328、gallionellaceae、gardnerellavaginalisatcc14019、葡糖桿菌屬oxydans621h、gordoniapolyisoprenivorans、hahellachejuensiskctc2396、幽門螺桿菌屬cinaedipagu611、幽門螺桿菌屬felisatcc49179、幽門螺桿菌屬pylorif30、幽門螺桿菌屬pyloripuno120、ignisphaeraaggregansdsm17230、kangiellakoreensisdsm16069、kitasatosporasetaekm-6054、乳酸菌屬johnsoniidpc6026、laribacterhongkongensishlhk9、軍團菌屬longbeachaensw150、marinobacteradhaerenshp15、methanocorpusculumlabreanumz、methanospirillumhungateijf-1、methylobacteriumnodulansors2060、methyloteneramobilis、mobiluncuscurtisiiatcc43063、muricaudaruestringensis、分枝桿菌屬gilvum、分枝桿菌屬smegmatisstr.mc2155、支原體bovis、支原體bovispg45、支原體putrefaciensks1、奈瑟氏菌屬unclassified、奈瑟氏菌科unclassified、neorickettsiasennetsustr.miyayama、亞硝化球菌屬halophilusnc4、nitrosomonadaceaeunclassified、諾卡氏菌科unclassified、oceanobacillusiheyensishte831、peptococcaceaeunclassified、peptostreptococcaceae、浮霉狀菌屬limnophilusdsm3776、polaromonassp.js666、polynucleobacternecessarius、變形桿菌mirabilishi4320、pseudogulbenkianiasp.nh8b、pseudoxanthomonasspadixbd-a59、ralstoniasolanacearumpsi07、紅球菌屬opacusb4、rhodospirillumphotometricumdsm122、rhodothermusmarinussg0.5jp17-172、riemerellaanatipestiferra-gd、saccharopolysporaerythraeanrrl2338、月形單胞菌屬ruminantiumsubsp.lactilytica、shewanelladenitrificansos217、sphaerochaetaglobusstr.buddy、sphingomonaswittichiirw1、螺旋體thermophiladsm6192、金黃色葡萄球菌aureussubsp.aureusnctc8325、stenotrophomonasmaltophilia、鏈球菌科unclassified、鏈球菌屬agalactiaea909、鏈球菌屬suisst3、鏈霉菌屬cattleyanrrl8057＝dsm46488、鏈霉菌屬scabiei87.22、syntrophobacterfumaroxidansmpob、tepidanaerobacteracetatoxydansre1、thermoanaerobacterium、thermoanaerobacteriumsaccharolyticum、thermoanaerobacteriumsaccharolyticumjw/sl-ys485、thermotogalettingaetmo、密螺旋體屬brennaborensedsm12168、密螺旋體屬succinifaciens、密螺旋體屬succinifaciensdsm2489、密螺旋體屬unclassified、弧菌unclassified、創(chuàng)傷弧菌cmcp6和xanthomonasoryzaepv.oryzaemaff311018中的一種或多種的水平。

本發(fā)明第二方面提供了檢測上述的生物標志物的試劑組合在制備用于診斷自閉癥的試劑盒中的用途。

本發(fā)明第三方面提供了一種自閉癥診斷試劑盒，包括適用于檢測所述的生物標志物的試劑組合。

在一優(yōu)選例中，所述適用于檢測權(quán)利要求1所述的生物標志物的試劑組合包括北京康為世紀的型號為cw2092s的stoolgen糞便dna提取試劑盒。

在一優(yōu)選例中，所述適用于檢測權(quán)利要求1所述的生物標志物的試劑組合還包括美國賽默飛世爾公司提供的試劑盒和美國illumina公司生產(chǎn)的truseqdna建庫試劑盒。

在一優(yōu)選例中，還包括分析所述生物標志物在體內(nèi)是否異常的工具。

本發(fā)明第四方面提供了所述的生物標志物或所述的試劑盒在篩選易患自閉癥的生物樣品的系統(tǒng)中的應用。

本發(fā)明第五方面提供了創(chuàng)傷弧菌cmcp6在制備治療或輔助治療自閉癥或其相關(guān)疾病的產(chǎn)品上的用途。

在一優(yōu)選例中，所述的產(chǎn)品為藥物或食品。

本發(fā)明第六方面提供了一種組合物，包括創(chuàng)傷弧菌cmcp6。

在一優(yōu)選例中，所述組合物還包括acaryochlorismarinambic11017、advenellakashmirensiswt001、alcanivoraxborkumensissk2、alicycliphilusdenitrificans、aliivibriounclassified、alkalilimnicolaehrlichiimlhe-1、allochromatiumvinosumdsm180、anaeromyxobactersp.fw109-5、archaeoglobusveneficussnp6、節(jié)細菌屬亞種fb24、azoarcussp.bh72、azospirillumunclassified、巴爾通氏體屬tribocorum、博代氏桿菌屬鳥結(jié)核197n、borreliaburgdorferigroup、buchneraaphidicola、burkholderiaphymatumstm815、burkholderiapseudomallei1710b、burkholderiasp.ccge1002、burkholderiasp.ccge1003、burkholderiaxenovoranslb400、彎曲桿菌jejunisubsp.jejuniicdccj07001、candidatusaccumulibacterphosphatiscladeiiastr.uw-1、candidatuschloracidobacteriumthermophilumb、candidatusprotochlamydiaamoebophilauwe25、chlamydophilapneumoniaej138、chlamydophilaunclassified、棒狀桿菌屬efficiensys-314、cupriavidusmetalliduransch34、dechlorosomasuillumps、erythrobacterlitoralishtcc2594、gallionellaceae、葡糖桿菌屬oxydans621h、gordoniapolyisoprenivorans、hahellachejuensiskctc2396、幽門螺桿菌屬felisatcc49179、幽門螺桿菌屬pylorif30、幽門螺桿菌屬pyloripuno120、ignisphaeraaggregansdsm17230、kangiellakoreensisdsm16069、kitasatosporasetaekm-6054、laribacterhongkongensishlhk9、軍團菌屬longbeachaensw150、marinobacteradhaerenshp15、ethanospirillumhungateijf-1、methylobacteriumnodulansors2060、methyloteneramobilis、分枝桿菌屬gilvum、分枝桿菌屬smegmatisstr.mc2155、奈瑟氏菌屬unclassified、奈瑟氏菌科unclassified、neorickettsiasennetsustr.miyayama、亞硝化球菌屬halophilusnc4、nitrosomonadaceaeunclassified、諾卡氏菌科unclassified、浮霉狀菌屬limnophilusdsm3776、polaromonassp.js666、polynucleobacternecessaries、變形桿菌mirabilishi4320、pseudogulbenkianiasp.nh8b、pseudoxanthomonasspadixbd-a59、ralstoniasolanacearumpsi07、紅球菌屬opacusb4、rhodospirillumphotometricumdsm122、rhodothermusmarinussg0.5jp17-172、saccharopolysporaerythraeanrrl2338、shewanelladenitrificansos217、sphingomonaswittichiirw1、螺旋體thermophiladsm6192、金黃色葡萄球菌aureussubsp.aureusnctc8325、stenotrophomonasmaltophilia、鏈球菌科unclassified、鏈霉菌屬cattleyanrrl8057＝dsm46488、鏈霉菌屬scabiei87.22、syntrophobacterfumaroxidansmpob、thermotogalettingaetmo、弧菌unclassified和xanthomonasoryzaepv.oryzaemaff311018中的一種或多種；

在一優(yōu)選例中，該組合物還包括食品上可接受的載體或藥學上可接受的載體。

本發(fā)明第七方面提供了上述的組合物在制備治療或輔助治療自閉癥或其相關(guān)疾病的產(chǎn)品上的用途。

在一優(yōu)選例中，所述的產(chǎn)品為藥物或食品。

本發(fā)明第八方面提供了一種篩選易患自閉癥的生物樣品的系統(tǒng)，包括：

核酸提取裝置，所述核酸提取裝置用于從所述生物樣品和對照樣品中提取核酸樣本；

核酸序列確定裝置，所述核酸序列確定裝置與所述核酸提取裝置相連，用于對所述核酸樣本進行分析，以便確定所述核酸樣本的序列；以及

判斷裝置，所述判斷裝置與所述測序裝置相連，基于所述核酸樣本的序列對生物樣品和對照樣品中腸道菌群所含的權(quán)利要求1的自閉癥生物標志物進行分析，根據(jù)分析結(jié)果判斷所述生物樣品是否易患自閉癥。

在一優(yōu)選例中，所述核酸序列確定裝置進一步包括：

文庫構(gòu)建單元，所述文庫構(gòu)建單元用于基于所述核酸樣本，構(gòu)建所述核酸的文庫；以及

測序單元，所述測序單元與所述文庫構(gòu)建單元相連，對所述文庫進行測序，以便確定所述核酸樣本的序列，

在一優(yōu)選例中，所述文庫構(gòu)建單元進一步包括：

pcr擴增模塊，所述pcr擴增模塊中設(shè)置特異性引物，以便利用所述特異性引物，對所述核酸樣本進行擴增。

在本文中，術(shù)語“生物標志物”應做廣義理解，其包括任何能夠反映異常狀態(tài)的任何可檢測生物指標，可以包含基因標志物，物種標志物(種標志物/屬標志物)以及功能標志物(ko/og標志物)，其具有非常廣泛的用途，可用于疾病診斷、判斷疾病分期或者用來評價新藥或新療法在目標人群中的安全性及有效性。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)自閉癥的致病與酸桿菌門等有關(guān)，因此將腸道中的酸桿菌門等作為自閉癥的檢測標志物，這樣自閉癥的診斷將不依靠主觀經(jīng)驗判斷，不僅可以對自閉癥的發(fā)病提供有效預警，而且可對其進行確診，克服了自閉癥的診斷較大程度的依賴于主觀經(jīng)驗判斷的缺陷，極大提高了診斷準確率。

具體實施方式

除非特殊說明，本發(fā)明所用術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的一般含義。

下面參考具體實施例，對本發(fā)明進行說明，需要說明的是，這些實施例僅僅是說明性的，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實施例中未注明具體技術(shù)或條件的，均按照常規(guī)實驗條件，如sambrook等分子克隆實驗手冊(sambrookj&russelldw，molecularcloning：alaboratorymanual，2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實施例1

本實施例運用鳥槍法宏基因組測序來檢測分析健康人群和自閉癥患者的糞便樣本，繼而進行統(tǒng)計檢驗比對，以確定與自閉癥患者群相關(guān)的生物標志物。具體步驟如下：

1.樣品來源

自閉癥組：來自深圳市兒童醫(yī)院心理科及言語治療科門診自閉癥患兒，收集時間為2015年7～12月。納入標準：①根據(jù)國際最新診斷標準，即《美國精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊第5版》(diagnosticandstatisticalmanualofmentaldisorders，5thedition，dsm-5)，診斷為asd”需要非常多支持”的患兒；②年齡＜14歲；③性別不限。排除標準：①患有其他精神疾病(如精神分裂癥等)；②患有其他神經(jīng)發(fā)育障礙疾?。虎刍加羞z傳代謝性疾?。虎芑加袊乐厣窠?jīng)疾病以及顱腦損傷史等重大軀體疾病史。

對照組：來自深圳市兒童醫(yī)院兒?？企w檢兒童。納入標準：①無精神疾病，身體健康；②與患者組年齡及性別匹配。排除標準同患者組。所有入組兒童家長對本研究知情并簽署知情同意書。

本研究經(jīng)深圳市兒童醫(yī)院倫理委員會批準。

本研究分兩期：發(fā)現(xiàn)階段和驗證階段。

第一期為發(fā)現(xiàn)階段，共收集22例自閉癥患兒，男18例，女4例；年齡2～6歲，平均(2±1)歲。共收集15名對照兒童，男8名，女7名；年齡1～6歲，平均(2±1)歲。兩組性別(fisher精確檢驗，p＞0.05)、年齡(student’sttest，p＞0.05)差異無統(tǒng)計學意義。

第二期為驗證階段，收集22例自閉癥患兒，男18例，女3例；年齡2～6歲，平均(2±1)歲。共收集16名對照兒童，男9名，女7名；年齡1～6歲，平均(2±1)歲。兩組性別(fisher精確檢驗，p＞0.05)、年齡(student’sttest，p＞0.05)差異無統(tǒng)計學意義。

2.糞便采集與前期處理

參與者自行將糞便排在指定的糞便采集盆，然后準備醫(yī)用一次性糞便采樣管，戴手套，采集糞便，采集中斷，避免因疏忽造成的污染，一旦發(fā)現(xiàn)污染，應重新采樣，采集完成后迅速冷凍保存于-80℃冰箱。收集相關(guān)基礎(chǔ)信息，包括：姓名、性別、年齡、身高、體重、患病史、家庭住址、父母聯(lián)系方式等詳實的《健康情況信息表》；《飲食及生活習慣調(diào)查表》需重點收集的資料包括飲食習慣，是否母乳喂養(yǎng)，父母生活習慣、健康狀況及吸煙史，家庭所處氛圍，近期抗生素，酸奶，益生菌使用等。

糞便標本收集完后，采用北京康為世紀的型號為cw2092s的stoolgen糞便dna提取試劑盒按照其說明書進行基因組dna的提取。

3.宏基因組建庫和測序

取2ul已提取的dna樣品進行定量，所用的試劑盒為美國賽默飛世爾公司提供的試劑盒(qubitdsdnabrassaykit)。利用美國illumina公司生產(chǎn)的truseqdna建庫試劑盒進行建庫，文庫插入片段大小為200-500bp，該試劑盒連接在美國貝克曼庫爾特公司生產(chǎn)的自動化spri工作站上。每個文庫構(gòu)建完成后，采用美國安捷倫科技公司生產(chǎn)的agilent2100生物分析儀進行質(zhì)控(qc，qualitycontrol)。通過qc后，即文庫濃度需在3ng/μl以上，該文庫用于后期測序，測序所用的平臺為illuminahiseq2500測序平臺，測序方式為150bp雙端測序。每個樣本測得1g以上的數(shù)據(jù)。

4.生物信息分析和統(tǒng)計

首先，過濾掉一些質(zhì)量差或含有接頭的序列。其次，所有測定的序列均對照人類基因組序列(參考hg19)以剔除人為污染的序列。再次，采用megan軟件(即megan5)(http://ab.inf.uni-tuebingen.de/software/megan5/下載)v5的默認參數(shù)，對鳥槍法宏基因組測序數(shù)據(jù)進行菌群分類(taxonomic)及功能(functional)profile分析，得到的taxonomicprofile結(jié)果為每一個樣本中注釋到界(superkingdom)門(phylum)綱(class)目(order)科(family)屬(genus)種(species)的細菌豐度。

計算不同分類水平細菌相對豐度，然后，考慮到宏基因數(shù)據(jù)符合負二項分析，采用基于負二項分布的統(tǒng)計檢驗模型deseq2(deseq2的使用可參考文獻lovemi，huberw，anderss.moderatedestimationoffoldchangeanddispersionforrna-seqdatawithdeseq2[j].genomebiology，2014，15(12)：550)，來校驗疾病組和對照組中各不同分類水平的細菌是否在疾病和對照組組差異顯著。

本研究分兩期，即發(fā)現(xiàn)階段和驗證階段，篩選差異顯著細菌的標準是在發(fā)現(xiàn)和驗證階段，deseq2校驗的p值均小于0.05，

結(jié)果：

研究發(fā)現(xiàn)共有4個門，4個綱，12個目，26個科，22個屬，143個種的細菌在自閉癥組和對照組有顯著差異，具體如表1所示。

表1自閉癥患者何對照組差異顯著的細菌

注：發(fā)現(xiàn)階段和驗證階段均差異顯著。p值＜0.05，deseq2檢驗。

由表1可知，自閉癥患者與對照組相比腸道菌群的差異較多，這些差異的細菌可以做為自閉癥患者的標志物。