本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體地說涉及一種母乳內(nèi)源性抗菌多肽及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

自1939年第一種抗菌肽(antimicrobialpeptides，amps)從土壤芽孢桿菌中被分離以來，在不同生物中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了2490多種抗菌肽，并且新的抗菌肽還在不斷地開發(fā)和鑒定中?？咕氖且活愑?～100個(gè)氨基酸組成的寡肽，具有廣譜的抗菌活性，作用靶標(biāo)包括革蘭氏陽性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲以及腫瘤細(xì)胞等，使它迅速成為潛在的治療藥物。

抗菌肽的殺菌機(jī)制包括通過破壞細(xì)胞膜的完整性，抑制蛋白、dna和rna的合成，或與胞內(nèi)某些特定的靶標(biāo)相結(jié)合從而殺死細(xì)菌。一般來說，一種抗菌肽僅對(duì)一類微生物有效，但是也有一些例外的抗菌肽針對(duì)不同的微生物具有不同的殺傷機(jī)制，例如抗菌肽indolicidin不僅可以通過滲透細(xì)胞抑制dna的合成殺傷大腸桿菌，而且可以通過損傷真菌細(xì)胞膜殺傷真菌，還可以抑制hiv-整合酶抑制hiv活性。還有一些抗菌肽對(duì)不同類型微生物具有相同的殺傷模式，pmap-23能夠在細(xì)胞膜形成孔隙殺死真菌和寄生蟲?？咕牟粌H可以破壞微生物細(xì)胞膜而且可以抑制功能蛋白的合成產(chǎn)生快速殺傷效應(yīng)的獨(dú)特機(jī)制使其成為理想的抗生素替代品。耐藥菌、生物被膜、滯留菌對(duì)傳統(tǒng)抗生素具有很強(qiáng)的抗性，并且它們?cè)诟腥局邪l(fā)揮著重要作用。利用抗菌肽破壞細(xì)胞膜的效應(yīng)殺死耐藥菌以及對(duì)生物被膜基質(zhì)蛋白酶的作用清除生物被膜，可以有效控制感染的發(fā)生，因此具有潛在的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。

研究報(bào)道母乳強(qiáng)大的抗感染能力主要取決于其成份組成，如：母乳寡糖(oligosaccharides)和乳鐵蛋白可促進(jìn)益生菌的生長，平衡新生兒腸道菌群抵御外界病原體的入侵；乳凝集素可通過抑制toll樣受體信號(hào)通路抵抗病菌感染。近年來，母乳已被鑒定出含有超過300種內(nèi)源性多肽，其中β-防御素2具有廣譜抗菌活性，對(duì)沙門氏菌和大腸埃希菌等具有殺傷作用；胰高血糖素樣肽2可顯著提高壞死性小腸結(jié)腸炎的發(fā)生率，減少腸道中炎癥因子tnf-α、il-6的分泌。多肽作為藥物，不僅具有大分子藥物的精確，而且還具備小分子藥物的高效，更兼具藥物的安全性優(yōu)勢，在抗腫瘤和代謝性疾病等多項(xiàng)領(lǐng)域中均受到越來越多的重視，如利拉魯肽和艾塞那肽可成功治療糖尿病。因此從母乳內(nèi)源性多肽的角度尋找抗菌肽對(duì)臨床抗感染治療具有積極的作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：本發(fā)明的目的是提供一種母乳內(nèi)源性抗菌多肽，本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供編碼前述多肽的核苷酸，本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供含有前述核苷酸序列的表達(dá)載體；本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供前述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞；本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供含有前述多肽的組合物；本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供前述多肽在制備抗小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌藥物上的應(yīng)用。

技術(shù)方案：本發(fā)明所述的一種分離的內(nèi)源性抗菌多肽，其通式為seqidno.1所示的氨基酸序列。

β-casein197(氨基酸序列seqidno.1)：

leu-leu-asn-gln-glu-leu-leu-leu-asn-pro-thr-his-gln-ile-tyr-pro-val。

本發(fā)明所述的母乳內(nèi)源性抗菌多肽來源于人類母乳中的β-酪蛋白，為經(jīng)過篩選可同時(shí)對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌具有優(yōu)秀抑菌效果的天然內(nèi)源性抗菌多肽。

本發(fā)明的多肽對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌同時(shí)具有較好的抑菌效果，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易在體內(nèi)降解。所述多肽的獲得可按照氨基酸序列通過固相合成方法獲得；或者通過宿主微生物或細(xì)胞內(nèi)克隆并表達(dá)攜帶編碼所述多肽之一的核苷酸序列的dna片段，通過現(xiàn)有的重組dna技術(shù)制備獲得。所使用的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞均為重組技術(shù)為公眾所知的。表達(dá)載體例如pet載體、pgex載體；宿主細(xì)胞例如大腸桿菌(e.coli)，放線菌(actinomycetes)，芽孢桿菌(bacillus)，鏈霉菌(streptomyces)，本發(fā)明所述的多肽可用常規(guī)的酶切方法將其從宿主細(xì)胞中分離，也可以通過常規(guī)的液相色譜法進(jìn)行分離和純化，上述的分離純化方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)。

本發(fā)明還提供編碼前述多肽的核苷酸，其為seqidno.2所示的核苷酸序列。

本發(fā)明還提供含有前述多肽的組合物。

所述多肽或所述多肽組合物可制備成藥學(xué)上可接受的載體，包括但不限于膠囊、片劑、錠劑、丸劑、滴丸、栓劑、噴霧、乳膏、貼劑等形式。

本發(fā)明所述多肽對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有顯著抑菌效果，通過電鏡掃描發(fā)現(xiàn)其主要通過破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性從而抑制細(xì)菌?？捎糜谥苽淇剐∧c結(jié)腸炎耶爾森菌、抗大腸桿菌、抗金黃色葡萄球菌的藥物。

附圖說明

圖1為試驗(yàn)例1中β-casein197的抑菌效果圖；

圖2為試驗(yàn)例2中β-casein197熒光顯微鏡下觀察的染色結(jié)果；

圖3為試驗(yàn)例3的試驗(yàn)菌在β-casein197處理下的掃描電鏡圖；

圖4為試驗(yàn)例3的試驗(yàn)菌在β-casein197處理下的透射電鏡圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1

委托上海科肽生物科技有限公司通過固相法合成如下seqidno.1所示序列：

leu-leu-asn-gln-glu-leu-leu-leu-asn-pro-thr-his-gln-ile-tyr-pro-val

這是十七個(gè)氨基酸組成的多肽，通過在線工具獲取前述多肽序列的主要生物學(xué)參數(shù)如下：

等電點(diǎn)(pi)為5.24，分子質(zhì)量(mw)2005.34da，較低的相對(duì)分子質(zhì)量表明該抗菌多肽不易被蛋白酶水解。不穩(wěn)定系數(shù)為33.2，表明該抗菌多肽較為穩(wěn)定，不易被胃酸所降解破壞。脂溶指數(shù)和親水性分別為154.71和0.106，表現(xiàn)為弱的疏水性。

上述序列為來源于人類母乳中β-酪蛋白的天然序列，除了通過化學(xué)固相合成法獲得，還可以通過對(duì)長鏈多肽通過生物酶切技術(shù)獲得，亦可通過宿主微生物或細(xì)胞內(nèi)克隆并表達(dá)攜帶編碼所述多肽之一的核苷酸序列的dna片段，通過現(xiàn)有的重組dna技術(shù)制備獲得。

所使用的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞均為重組技術(shù)為公眾所知的。表達(dá)載體例如pet載體、pgex載體；宿主細(xì)胞例如大腸桿菌(e.coli)，放線菌(actinomycetes)，芽孢桿菌(bacillus)，鏈霉菌(streptomyces)，本發(fā)明所述的多肽可用常規(guī)的酶切方法將其從宿主細(xì)胞中分離，也可以通過常規(guī)的液相色譜法進(jìn)行分離和純化，上述的分離純化方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)。

編碼上述多肽的核苷酸序列對(duì)應(yīng)如下：

ctgctcaaccaagaacttctacttaaccccacccaccagatctaccctgtg

實(shí)施例2

實(shí)施例1所述的多肽可以單獨(dú)應(yīng)用，除此之外，這些多肽還可以多肽組合物聯(lián)合使用。多肽組合物中包含序列為seqidno.1的多肽。

實(shí)施例3

本實(shí)施例提供前述實(shí)施例1所述的一種多肽，或者實(shí)施例2所述的多肽組合物可制備成藥學(xué)上可接受的載體，例如：膠囊、片劑、錠劑、丸劑、滴丸、栓劑、噴霧、乳膏、貼劑等形式。

試驗(yàn)例1抑菌試驗(yàn)

抗菌多肽的合成與稀釋

本試驗(yàn)實(shí)施例1中固相合成獲得的抗菌多肽β-casein197多肽分別為例。取1mg多肽，用無菌雙蒸水稀釋成1mg/ml-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

菌株及培養(yǎng)

大腸桿菌(e.coli，atcc25922)、金黃色葡萄球菌(s.aureus，atcc25923)和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(y.enterocolitica，actt23715)來源于美國菌種保藏中心(americantypeculturecollection，atcc)。每3ml無菌lb培養(yǎng)基中(胰蛋白胨10g/l，酵母膏提取物5g/l，nacl10g/l)接種30ul菌種，于37℃恒溫?fù)u動(dòng)培養(yǎng)至生長對(duì)數(shù)期。通過手持式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(milliporescepter2.0)檢測細(xì)菌濃度至1,000-5,000cfu/ml。

抑菌實(shí)驗(yàn)

lb固態(tài)培養(yǎng)基(lb培養(yǎng)基加入瓊脂粉15g/l)，高溫高壓滅菌后冷卻至50℃左右倒入10cm無菌培養(yǎng)皿中。采用瓊脂糖孔穴擴(kuò)散法即將兩種處于生長對(duì)數(shù)期試驗(yàn)菌分別均勻接種至lb瓊脂平板后，將帶有β-casein197或無菌水(對(duì)照組)的無菌紙片放置于接種試驗(yàn)菌的lb瓊脂平板?？咕嘣诃傊z內(nèi)向四周自由擴(kuò)散，其濃度隨擴(kuò)散距離增大而降低，在藥物一定的擴(kuò)散距離內(nèi)，由于抗菌多的抗菌效應(yīng)，試驗(yàn)菌不能生長，此無菌生長的范圍稱為抑菌圈，抑菌圈的大小與抗菌多的抑菌效應(yīng)成正比。

如圖1所示，圖1是針對(duì)β-casein197的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其中，上排為對(duì)照組，下排為分別接種三種實(shí)驗(yàn)菌的試驗(yàn)組。從圖1中可以看出，加入多肽的紙片周圍出現(xiàn)了明顯的抑菌圈，而對(duì)照組(加滅菌雙蒸水)則沒有明顯抑制區(qū)域，表明序列β-casein197對(duì)三種實(shí)驗(yàn)菌具有明顯的抑制作用。

試驗(yàn)例2免疫熒光試驗(yàn)

采用live/deadbaclightkitl13152檢測試劑盒(thermofisher，usa)。將試劑盒內(nèi)的a液和b液混合于5ml無菌雙蒸水，綠色熒光核酸染料(syto9)終濃度為6um，紅色熒光核酸染料(propidiumiodide，pi)終濃度為30um。細(xì)菌膜完整的顯示綠色，膜破裂的顯示紅色。

準(zhǔn)備25ml菌液，室溫10,000rpm離心10min，去除上清液，保留沉淀。用2ml0.85％nacl溶液重懸沉淀。取1ml重懸液加入含20ml0.85％nacl溶液的50ml離心管中，室溫孵育1h，每15min混合一次。1小時(shí)后室溫10,000rpm離心10min，并用0.85％nacl溶液洗滌2次后用10ml0.85％nacl溶液重懸。每毫升細(xì)菌懸液中加入3ul染色劑混合物徹底混勻，室溫避光孵育15min。取5ul反應(yīng)液滴至載玻片并蓋上18mm蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察。

通過免疫熒光試驗(yàn)，如圖2所示，與對(duì)照組相比，β-casein197處理組中，紅色熒光增多(菌體細(xì)胞膜破裂，pi進(jìn)入細(xì)胞核與核酸結(jié)合，顯示紅色熒光)，綠色熒光減少(菌體細(xì)胞膜完整，染成綠色)，說明該β-casein197對(duì)金黃色葡萄球菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌均具有明顯的殺傷作用。

試驗(yàn)例3電鏡觀察試驗(yàn)

處于對(duì)數(shù)生長期的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌分別于室溫12,000離心3min后，用0.1m的pbs洗滌一次，并用pbs重懸。通過手持式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(milliporescepter2.0)將菌液濃度調(diào)整為1×10⁸cfu/ml，并分別與抗菌多肽于37℃孵育1h，使抗菌多肽終濃度為100ug/ml，細(xì)菌與無菌雙蒸水混合作為對(duì)照。1小時(shí)后，菌液多肽混合物于室溫12,000離心3min，0.1m的pbs洗滌兩次，去除上清液。

2.5％的戊二醛4℃固定4h，30％-50％-70％-90％-100％乙醇梯度脫水，每步驟15min并吹打混勻；將脫水后的菌液滴加之載玻片，通風(fēng)廚干燥后將樣品分別在-20℃、-20℃和-80℃冷凍過夜；樣品送至南京醫(yī)科大學(xué)進(jìn)行掃描電鏡觀察；2.5％的戊二醛4℃固定4h，樣品送至南京醫(yī)科大學(xué)進(jìn)行透射電鏡觀察。

通過掃描電鏡發(fā)現(xiàn)，多肽處理組中，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌均觀察到細(xì)胞膜邊緣粗糙不清晰的紊亂結(jié)構(gòu)(如圖3試驗(yàn)組所示)，而對(duì)照組中均為完整連續(xù)光滑的膜結(jié)構(gòu)，說明β-casein197通過破壞細(xì)菌細(xì)胞膜從而抑制細(xì)菌；進(jìn)一步借助透射電鏡可以清晰的觀察到抗菌多肽對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的破壞。與對(duì)照組相比，β-casein197和β-casein213處理組中，細(xì)菌細(xì)胞膜幾乎被完全破壞，出現(xiàn)大量氣泡樣結(jié)構(gòu)，細(xì)胞內(nèi)容物外泄，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架幾乎無法識(shí)別(如圖4試驗(yàn)組所示)，進(jìn)一步說明了本發(fā)明的抗菌多肽對(duì)細(xì)菌的殺傷是通過破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性，使其失去活力。

<110>南京市婦幼保健院

<120>一種母乳內(nèi)源性抗菌多肽及其應(yīng)用

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