本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，主要涉及一種大豆蛋白及其編碼基因的應(yīng)用及引物、表達(dá)載體和制備方法。

背景技術(shù)：

鹽堿、干旱等非生物脅迫是限制植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要環(huán)境因子。這些環(huán)境因子導(dǎo)致植物體內(nèi)發(fā)生一系列的生理代謝反應(yīng)，表現(xiàn)為代謝和生長(zhǎng)的可逆性抑制，嚴(yán)重時(shí)甚至引起不可逆?zhèn)Γ瑢?dǎo)致整個(gè)植株死亡。因此，如何提高植物的抗逆功能，一直是人們研究的課題。

因此，現(xiàn)有技術(shù)還有待于改進(jìn)和發(fā)展。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種大豆蛋白及其編碼基因的應(yīng)用及引物、表達(dá)載體和制備方法，該大豆蛋白的基因編碼為glyma06g25310.1，本發(fā)明中旨在提供一種該大豆蛋白在提高植物耐鹽性中應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種大豆蛋白的應(yīng)用，其中，所述大豆蛋白的基因編碼為glyma06g25310.1，將所述大豆蛋白用于提高植物或大腸桿菌的耐鹽性。

一種大豆蛋白的編碼基因的應(yīng)用，其中，所述大豆蛋白的基因編碼為glyma06g25310.1，將所述大豆蛋白的編碼基因用于提高植物或大腸桿菌的耐鹽性。

一種用于制備大豆蛋白或其編碼基因的引物，其中，所述大豆蛋白的基因編碼為glyma06g25310.1，引物的序列如下所示：

f：3’-atggcgagcgcagtggagaag(ndei)-5’；

r：3’-tcagctctcgtgagtgccattc(xhoi)-5’。

一種用于提高耐鹽性的表達(dá)載體，其中，所述表達(dá)載體為攜帶有seqidno.4所示的大豆蛋白基因，用于表達(dá)基因編碼為glyma06g25310.1的大豆蛋白。

所述的用于提高耐鹽性的表達(dá)載體，其中，所述表達(dá)載體用pet-28a蛋白表達(dá)載體重組得到，該大豆蛋白基因通過酶切位點(diǎn)ndei和xhoi連接在表達(dá)載體上。

一種用于提高耐鹽性的表達(dá)載體的制備方法，其中，其制備方法包括以下步驟：

擴(kuò)增目的基因：以f：3’-atggcgagcgcagtggagaag-5’；r：3’-tcagctctcgtgagtgccattc-5’作為引物，以大豆r0期胚根cdna為模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到目的基因片段，目的基因片段的基因序列如seqidno.4所示；

構(gòu)建重組質(zhì)粒：將目的基因片段與經(jīng)ndei和xhoi雙酶切的蛋白表達(dá)載體pet-28a，通過t4連接酶連接酶切產(chǎn)物，構(gòu)建pet-28a重組質(zhì)粒。

所述的用于提高耐鹽性的表達(dá)載體的制備方法，其中，構(gòu)建重組質(zhì)粒過程中，包括以下步驟：

將目的基因片段和經(jīng)過雙酶切的pet-28a蛋白表達(dá)載體按照摩爾比10:1混合，加入0.5μlt4連接酶，1μl10×buffer，用水補(bǔ)齊至10μl，16℃連接過夜。

有益效果：本發(fā)明中首次發(fā)現(xiàn)該蛋白可以提高大腸桿菌的耐鹽性，對(duì)于其在植物抗逆工程上的應(yīng)用具有指導(dǎo)意義。該大豆蛋白可增強(qiáng)大腸桿菌的耐鹽性，由于很多抗逆基因在大腸桿菌和植物體系具有相似的抗逆功能，因此，該基因在植物抗逆領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中利用pcr擴(kuò)增大豆基因片段的電泳結(jié)果圖(m為dl2000marker)。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中利用菌落pcr驗(yàn)證重組菌的電泳結(jié)果圖(m為dl2000marker)。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例5中17號(hào)蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)的電泳結(jié)果圖。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例6中空載體轉(zhuǎn)化菌在不同濃度的高鹽lb固體培養(yǎng)基和正常固體培養(yǎng)基的生長(zhǎng)結(jié)果圖。

圖5本發(fā)明實(shí)施例6中重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌在不同濃度的高鹽lb固體培養(yǎng)基和正常固體培養(yǎng)基的生長(zhǎng)結(jié)果圖。

圖6本發(fā)明實(shí)施例6中空載體轉(zhuǎn)化菌和重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌的存活率柱形圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供一種大豆蛋白及其編碼基因的應(yīng)用及引物、表達(dá)載體和制備方法，為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及效果更加清楚、明確，以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明所提供的一種大豆蛋白及其編碼基因的應(yīng)用，是將所述大豆蛋白或其編碼基因用于提高植物或大腸桿菌的耐鹽性。其中，所述大豆蛋白的基因編碼為glyma06g25310.1。該大豆蛋白可增強(qiáng)大腸桿菌的耐鹽性，由于很多抗逆基因在大腸桿菌和植物體系具有相似的抗逆功能，因此，該大豆蛋白及其編碼基因在植物抗逆領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景。

所述大豆蛋白的基因序列(seqidno.1)如下所示：

atcgaatcgacctgaactgcttcttcaaatttttttctggtgattctacaacctgtcctaactctcaaccctcttcctcttaattaatctattcctctttatcctcctctgaacctcaaacaccaaaacaaagcattacaattctcaatttcacataaacaccagaattgataaaaacacataacaaaaaaaaaaagtgaaaaatggcgagcgcagtggagaaggagggtggcgcgagcgaggaaactttgtctttggagcttcctgctccacctggttggaagaagcagttcattccaaagaaagctggtaccccaaagaaaaacgagattgtgttcactgcaccaacaggagaggagatcaataacaggaagcagctggaaaaatatttgaaagcacaccctggaggcccagctgtatcagaatttgactggggcactggtgagaccccaagaagatctacaagaatcagtgagaaggccaaggcagctcctccaacacagagggagcccccaaagaagcgtactaaaagatcatcagcttcacaaaaggaaatttcccaggaagaaaaagaagaggagaccaaggaagcagagatgcaagaagctgatgacaccactaagggtgataatgatatagagaaggaaaaggttgttgtaaacgaaaatcatgacaagagtgtggaagatacagatgtcaacaaatccactcgttatggagaagaagctaaagctggagaaaacgttgaggtacctattgaagaggaaaaatccaatgctgctgatggagaactacctgcattaaaagataaagctgatgacaaagtaactgagggctctgaagtttttctgagaaaggatgaagaaaagattgagcaaccacaggaagagacaaaagaatatagtggatttggggagccagagaaattggaaacatgcactactgcagacaaaacggttgaagtggaaggagtgaataaagaggatcacgtcaaaagtactcatgaatttgaagttggggaaatagaaggaacaaaagtgaacggtgaagaacatcacaagcttgatgagataaacaaggccgaagcagagttgactgtgaatggcactcacgagagctgaactggtgaggtcaaaagcctggagcagggaatagattaataagctctccgcttccctcctctcattctgacccctttagatctgtttgaaatgactgtagtttttgttaatgttatttctctgattgtttattgaaataacaatatacaattatagagcatagccgtatcatgtaccacccttgggtgtattggacagacgtgtagcttctagttgcttttgtaacattatgttgtaagatgtgatatggacctgtaatcatatatgtaaggaagtgatcctatata。

本發(fā)明中，以r0期和r15期大豆胚根作為實(shí)驗(yàn)材料，采用100℃熱處理10min后離心獲得上清，富集得到的可溶性蛋白即為熱穩(wěn)定蛋白。根據(jù)蛋白組學(xué)和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果，在r0期高表達(dá)蛋白中挑選了1個(gè)蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能分析，該蛋白即本發(fā)明所述大豆蛋白。本發(fā)明中還提供用于擴(kuò)增該大豆蛋白基因序列的引物，根據(jù)pmd19-t載體和基因的序列特點(diǎn)引入相應(yīng)酶切位點(diǎn)的同源序列，在基因的上下游引物的5’端分別引入核酸內(nèi)切酶(ndei)和(xhoi)兩端的同源序列。引物的序列如下所示：

f：3’-atggcgagcgcagtggagaag(ndei)-5’(seqidno.2)；

r：3’-tcagctctcgtgagtgccattc(xhoi)-5’(seqidno.3)。

本發(fā)明中還提供一種用于提高耐鹽性的表達(dá)載體，所述表達(dá)載體用pet-28a蛋白表達(dá)載體重組得到，該大豆蛋白基因通過酶切位點(diǎn)ndei和xhoi連接在表達(dá)載體上。

本發(fā)明中還提供一種用于提高耐鹽性的表達(dá)載體的制備方法，其制備方法包括以下步驟：

擴(kuò)增目的基因：根據(jù)pmd19-t載體和基因的序列特點(diǎn)引入相應(yīng)酶切位點(diǎn)的同源序列，在基因的上下游引物的5’端分別引入核酸內(nèi)切酶(ndei)和(xhoi)，以f：3’-atggcgagcgcagtggagaag-5’；r：3’-tcagctctcgtgagtgccattc-5’作為引物，以大豆r0期胚根cdna為模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到目的基因片段；目的基因片段的基因序列(seqidno.4)如下所示：

atggcgagcgcagtggagaaggagggtggcgcgagcgaggaaactttgtctttggagcttcctgctccacctggttggaagaagcagttcattccaaagaaagctggtaccccaaagaaaaacgagattgtgttcactgcaccaacaggagaggagatcaataacaggaagcagctggaaaaatatttgaaagcacaccctggaggcccagctgtatcagaatttgactggggcactggtgagaccccaagaagatctacaagaatcagtgagaaggccaaggcagctcctccaacacagagggagcccccaaagaagcgtactaaaagatcatcagcttcacaaaaggaaatttcccaggaagaaaaagaagaggagaccaaggaagcagagatgcaagaagctgatgacaccactaagggtgataatgatatagagaaggaaaaggttgttgtaaacgaaaatcatgacaagagtgtggaagatacagatgtcaacaaatccactcgttatggagaagaagctaaagctggagaaaacgttgaggtacctattgaagaggaaaaatccaatgctgctgatggagaactacctgcattaaaagataaagctgatgacaaagtaactgagggctctgaagtttttctgagaaaggatgaagaaaagattgagcaaccacaggaagagacaaaagaatatagtggatttggggagccagagaaattggaaacatgcactactgcagacaaaacggttgaagtggaaggagtgaataaagaggatcacgtcaaaagtactcatgaatttgaagttggggaaatagaaggaacaaaagtgaacggtgaagaacatcacaagcttgatgagataaacaaggccgaagcagagttgactgtgaatggcactcacgagagctga。

構(gòu)件重組質(zhì)粒：將目的基因片段與經(jīng)ndei和xhoi雙酶切的蛋白表達(dá)載體pet-28a，通過t4連接酶連接酶切產(chǎn)物，構(gòu)建pet-28a重組質(zhì)粒。pet-28a重組質(zhì)粒的基因序列(seqidno.5)如下所示：

atccggatatagttcctcctttcagcaaaaaacccctcaagacccgtttagaggccccaaggggttatgctagttattgctcagcggtggcagcagccaactcagcttcctttcgggctttgttagcagccggatctcagtggtggtggtggtggtgctcgaggcttcggccttgtttatctcatcaagcttgtgatgttcttcaccgttcacttttgttccttctatttccccaacttcaaattcatgagtacttttgacgtgatcctctttattcactccttccacttcaaccgttttgtctgcagtagtgcatgtttccaatttctctggctccccaaatccactatattcttttgtctcttcctgtggttgctcaatcttttcttcatcctttctcagaaaaacttcagagccctcagttactttgtcatcagctttatcttttaatgcaggtagttctccatcagcagcattggatttttcctcttcaataggtacctcaacgttttctccagctttagcttcttctccataacgagtggatttgttgacatctgtatcttccacactcttgtcatgattttcgtttacaacaaccttttccttctctatatcattatcacccttagtggtgtcatcagcttcttgcatctctgcttccttggtctcctcttctttttcttcctgggaaatttccttttgtgaagctgatgatcttttagtacgcttctttgggggctccctctgtgttggaggagctgccttggccttctcactgattcttgtagatcttcttggggtctcaccagtgccccagtcaaattctgatacagctgggcctccagggtgtgctttcaaatatttttccagctgcttcctgttattgatctcctctcctgttggtgcagtgaacacaatctcgtttttctttggggtaccagctttctttggaatgaactgcttcttccaaccaggtggagcaggaagctccaaagacaaagtttcctcgctcgcgccaccctccttctccactgcgctcgccatatggctgccgcgcggcaccaggccgctgctgtgatgatgatgatgatggctgctgcccatggtatatctccttcttaaagttaaacaaaattatttctagaggggaattgttatccgctcacaattcccctatagtgagtcgtattaatttcgcgggatcgagatctcgatcctctacgccggacgcatcgtggccggcatcaccggcgccacaggtgcggttgctggcgcctatatcgccgacatcaccgatggggaagatcgggctcgccacttcgggctcatgagcgcttgtttcggcgtgggtatggtggcaggccccgtggccgggggactgttgggcgccatctccttgcatgca601ccattccttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctactactgggctg651cttcctaatgcaggagtcgcataagggagagcgtcgagatcccggacaccatcgaatggcgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaagcggcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggccctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgccag1051cgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagtgggatacgacgataccgaagacagctcatgttatatcccgccgttaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtaagttagctcactcattaggcaccgggatctcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctctgggtcattttcggcgaggaccgctttcgctggagcgcgacgatgatcggcctgtcgcttgcggtattcggaatcttgcacgccctcgctcaagccttcgtcactggtcccgccaccaaacgtttcggcgagaagcaggccattatcgccggcatggcggccccacgggtgcgcatgatcgtgctcctgtcgttgaggacccggctaggctggcggggttgccttactggttagcagaatgaatcaccgatacgcgagcgaacgtgaagcgactgctgctgcaaaacgtctgcgacctgagcaacaacatgaatggtcttcggtttccgtgtttcgtaaagtctggaaacgcggaagtcagcgccctgcaccattatgttccggatctgcatcgcaggatgctgctggctaccctgtggaacacctacatctgtattaacgaagcgctggcattgaccctgagtgatttttctctggtcccgccgcatccataccgccagttgtttaccctcacaacgttccagtaaccgggcatgttcatcatcagtaacccgtatcgtgagcatcctctctcgtttcatcggtatcattacccccatgaacagaaatcccccttacacggaggcatcagtgaccaaacaggaaaaaaccgcccttaacatggcccgctttatcagaagccagacattaacgcttctggagaaactcaacgagctggacgcggatgaacaggcagacatctgtgaatcgcttcacgaccacgctgatgagctttaccgcagctgcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtatactggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgaacaataaaactgtctgcttacataaacagtaatacaaggggtgttatgagccatattcaacgggaaacgtcttgctctaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattgtatgggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaa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構(gòu)件重組質(zhì)粒過程中，可以包括以下步驟：

將目的基因片段和經(jīng)過雙酶切的pet-28a蛋白表達(dá)載體按照摩爾比10:1混合，加入0.5μlt4連接酶，1μl10×buffer，用水補(bǔ)齊至10μl，16℃連接過夜。

以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1：基因的克隆

根據(jù)pmd19-t載體和基因的序列特點(diǎn)引入相應(yīng)酶切位點(diǎn)的同源序列，在基因的上下游引物的5’端分別引入核酸內(nèi)切酶(ndei)和(xhoi)兩端的同源序列。

引物：f：3’-atggcgagcgcagtggagaag(ndei)-5’；

r：3’-tcagctctcgtgagtgccattc(xhoi)-5’。

以基因的f和r作為引物，以大豆r0期胚根cdna為模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增。反應(yīng)體系為5×phusionhfbuffer4μl，2.5mmdntp1.6μl，上下游引物各10mm，cdna模板1μl，dmso0.6μl，用水補(bǔ)齊至20μl。在pcr儀上98℃預(yù)反應(yīng)30s，98℃反應(yīng)5s，退火溫度依據(jù)引物tm值而定，72℃延伸反應(yīng)時(shí)間依據(jù)基因長(zhǎng)度而定，72℃10min，將反應(yīng)產(chǎn)物在1％的瓊脂糖凝膠電泳上分離pcr產(chǎn)物，用紫外燈檢測(cè)，并按照核酸回收試劑盒的說明書操作收集特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。將擴(kuò)增回收產(chǎn)物與takara的pmd19-tsimple載體按照摩爾比10:1的比例混合，加入等體積的solutionⅰ反應(yīng)緩沖液，混勻后，輕微離心，置于16℃下水浴連接過夜。

本實(shí)施例中，是根據(jù)ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)中的核酸序列設(shè)計(jì)引物，以大豆胚根總cdna為模板，利用pcr方法擴(kuò)增挑選出來的基因的序列，pcr產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示，擬擴(kuò)增基因得到有效擴(kuò)增，基因的分子量大小與預(yù)期分子量大小相近(如圖1所示)，連接t載后進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序成功的克隆載體與蛋白表達(dá)載體pet-28a經(jīng)雙酶切后，通過t4連接酶連接酶切產(chǎn)物，構(gòu)建pet-28a/重組質(zhì)粒，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21star，利用菌落pcr法對(duì)重組菌進(jìn)行驗(yàn)證(如圖2所示)。結(jié)果顯示構(gòu)建成功的重組菌能擴(kuò)增到目的片段，表明成功構(gòu)建含目的基因的原核表達(dá)載體。

實(shí)施例2：超級(jí)感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化

按照上海生工提供的超級(jí)感受態(tài)試劑盒提供的方法制備大腸桿菌top10和bl21star感受態(tài)，在超凈工作臺(tái)中挑取劃線培養(yǎng)的大腸桿菌單克隆菌株于5ml的lb液體培養(yǎng)基中，在37℃，180rmp恒溫?fù)u床中培養(yǎng)12h后，按照1:50比例接種到50ml新鮮配制的lb培養(yǎng)基中，至od600值約為0.6。將用50ml離心管收集菌體，8,000g離心3min。棄上清后將菌體冰上放置10min，4℃，5,000rmp離心5min，用試劑盒提供的buffera將菌體重懸后于冰上放置30min，4℃，5,000rmp離心5min，棄上清液，用試劑盒提供的bufferb(用前-20℃預(yù)冷)重懸菌體，用滅菌的1.5mlep管分裝，每管100μl。在-80℃冰箱中備用。

將10μl連接產(chǎn)物加入到含有100μl大腸桿菌感受態(tài)中，輕微混勻。將大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞放置于冰上30min，42℃熱激90s，冰上5min，加入900μl新鮮配制的lb液體培養(yǎng)基。在37℃，180rmp恒溫?fù)u床中培養(yǎng)1h，取300μl菌液涂布于含有相應(yīng)抗生素的lb固體培養(yǎng)基中，37℃下倒置培養(yǎng)15h。

實(shí)施例3：質(zhì)粒提取

利用omega公司提供的質(zhì)粒提取試劑盒操作，取1ml菌液于1.5ml的ep管中，8,000rmp，離心1min，重復(fù)3次，棄上清。向裝有菌體的ep管中加入bufferi200μl，用移液器充分吹打混勻后加入200μlbufferii，輕微顛倒混勻2次，室溫靜置1min，加入bufferiii300μl，顛倒混勻3次，整個(gè)過程不要超過5min。室溫，12,000rmp離心15min，吸取上清500μl，加入平衡好的核酸收集柱中，室溫，12,000rmp離心1min，棄廢液后向核酸收集柱中加入500μlhbbuffer，室溫12,000rmp離心1min，棄廢液，加入試劑盒中的600μlwbbuffer(預(yù)先加入800ml無水乙醇)，室溫12,000rmp離心1min重復(fù)2次，將核酸收集柱空轉(zhuǎn)，15,000rmp離心2min除去殘留的wbbuffer。向核酸收集柱內(nèi)加入30μl無菌水，用一個(gè)新ep管收集質(zhì)粒，室溫12,000rmp離心2min。

實(shí)施例4：蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建

將含目的基因的pmd19-t載體按照基因引物設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)做雙酶切反應(yīng)，反應(yīng)體系為限制性內(nèi)切酶各1μl，質(zhì)粒1μg，反應(yīng)buffer2μl，用水補(bǔ)齊至10μl，反應(yīng)5h，將反應(yīng)產(chǎn)物在1％的瓊脂糖凝膠電泳上分離酶切產(chǎn)物，在紫外燈下檢測(cè)?；厥漳康幕蚱?，將目的基因片段和經(jīng)過雙酶切的pet-28a蛋白表達(dá)載體按照摩爾比10:1混合，加入0.5μlt4連接酶，1μl10×buffer，用水補(bǔ)齊至10μl，16℃連接過夜。

實(shí)施例5：重組子的菌落pcr驗(yàn)證

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21star感受態(tài)細(xì)胞，挑取少量長(zhǎng)有轉(zhuǎn)化子的菌斑為模板，以引物來驗(yàn)證重組子，pcr反應(yīng)體系與過程同基因克隆。

在本實(shí)施例中，將構(gòu)建成功的pet-28a/蛋白重組菌擴(kuò)大培養(yǎng)，加入0.1mmiptg在16℃下誘導(dǎo)12小時(shí)，離心收集菌并用balancebuffer重懸菌體，通過超聲破碎重組菌的細(xì)胞膜離心取上清液即為重組菌的總可溶性蛋白，以pet-28a空載體誘導(dǎo)前后為對(duì)照，如圖3所示，其中，1-4分別為bl21誘導(dǎo)前，bl21誘導(dǎo)后，17號(hào)蛋白誘導(dǎo)前，17號(hào)蛋白誘導(dǎo)后(理論分子量為12.3kda)。從結(jié)果可以看出經(jīng)過sds-page電泳檢測(cè)重組菌得到表達(dá)。

實(shí)施例6：500mm鹽脅迫下重組菌的存活率的測(cè)定

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌和空載體轉(zhuǎn)化菌接入含1‰卡鈉(10mg/ml)的5mllb液體培養(yǎng)基中，在200rpm/min37℃的搖床中過夜培養(yǎng)；第二天轉(zhuǎn)接至含1‰卡鈉(10mg/ml)的5mllb液體培養(yǎng)基中，在200r/min37℃的搖床中擴(kuò)培；將菌液濃度擴(kuò)培至od600＝0.6—0.8之間后(重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌和空載體轉(zhuǎn)化菌的od600需調(diào)至一致)，以1‰的比例加入濃度為4.8mg/mliptg，在200r/min30℃的搖床中誘導(dǎo)4h，再測(cè)其od600(將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌和空載體轉(zhuǎn)化菌的od600需調(diào)至一致)并記錄。

將誘導(dǎo)后的菌液稀釋10、100、1000倍后，分別取100ul涂布在有500mmnacl的高鹽lb固體培養(yǎng)基(含1‰的卡納(10μg/ml，1‰的比例)，含iptg(4.8mg/ml，1‰的比例))和正常lb固體培養(yǎng)基(含1‰的卡納(10μg/ml)和iptg(4.8mg/ml))；正常lb固體培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15h后，記錄能夠進(jìn)行計(jì)數(shù)的平板上的菌斑數(shù)目(平板菌落數(shù)在30-300個(gè)之間為有效數(shù)據(jù))，高鹽培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后記錄菌斑數(shù)目(平板菌落數(shù)在30-300個(gè)之間為有效數(shù)據(jù))，最后計(jì)算存活率，繪制存活率柱形圖。

圖4和圖5分別為空載體轉(zhuǎn)化菌和重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌在不同濃度的高鹽lb固體培養(yǎng)基和正常固體培養(yǎng)基的生長(zhǎng)結(jié)果圖，其中，10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4分別表示稀釋倍數(shù)1、10、100、1000。圖6為空載體轉(zhuǎn)化菌和重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌的存活率柱形圖，其中，p值為為0.0261、glyma06g25310.1蛋白的標(biāo)準(zhǔn)差為0.1961、空載的標(biāo)準(zhǔn)差為0.0143。

本實(shí)施例中將重組菌誘導(dǎo)后稀釋分別涂布在正常和高鹽的平板上，對(duì)菌斑數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)(平板菌落數(shù)在30-300個(gè)之間為有效數(shù)據(jù))；以空載重組菌作為對(duì)照，計(jì)算重組菌的存活率。結(jié)果顯示，與空載重組菌的存活率對(duì)比，可證明重組菌中的對(duì)應(yīng)蛋白是否具有耐鹽性。表達(dá)glyma06g25310.1蛋白的重組菌的存活率明顯高于空載重組菌(如圖6)，另外還進(jìn)行了點(diǎn)板，更直觀的顯示了glyma06g25310.1蛋白的重組菌的存活率比空載重組菌的存活率更高(如圖4和5)，證明該蛋白是具有一定的耐鹽性。

應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明的應(yīng)用不限于上述的舉例，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進(jìn)或變換，所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。

sequencelisting

<110>深圳大學(xué)

<120>大豆蛋白及其編碼基因的應(yīng)用及引物、表達(dá)載體和制備方法

<130>5

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1408

<212>dna

<213>大豆（glycinemax(linn.)merr.）

<223>基因編碼為glyma06g25310.1的大豆蛋白基因序列

<400>1

atcgaatcgacctgaactgcttcttcaaatttttttctggtgattctacaacctgtccta60

actctcaaccctcttcctcttaattaatctattcctctttatcctcctctgaacctcaaa120

caccaaaacaaagcattacaattctcaatttcacataaacaccagaattgataaaaacac180

ataacaaaaaaaaaaagtgaaaaatggcgagcgcagtggagaaggagggtggcgcgagcg240

aggaaactttgtctttggagcttcctgctccacctggttggaagaagcagttcattccaa300

agaaagctggtaccccaaagaaaaacgagattgtgttcactgcaccaacaggagaggaga360

tcaataacaggaagcagctggaaaaatatttgaaagcacaccctggaggcccagctgtat420

cagaatttgactggggcactggtgagaccccaagaagatctacaagaatcagtgagaagg480

ccaaggcagctcctccaacacagagggagcccccaaagaagcgtactaaaagatcatcag540

cttcacaaaaggaaatttcccaggaagaaaaagaagaggagaccaaggaagcagagatgc600

aagaagctgatgacaccactaagggtgataatgatatagagaaggaaaaggttgttgtaa660

acgaaaatcatgacaagagtgtggaagatacagatgtcaacaaatccactcgttatggag720

aagaagctaaagctggagaaaacgttgaggtacctattgaagaggaaaaatccaatgctg780

ctgatggagaactacctgcattaaaagataaagctgatgacaaagtaactgagggctctg840

aagtttttctgagaaaggatgaagaaaagattgagcaaccacaggaagagacaaaagaat900

atagtggatttggggagccagagaaattggaaacatgcactactgcagacaaaacggttg960

aagtggaaggagtgaataaagaggatcacgtcaaaagtactcatgaatttgaagttgggg1020

aaatagaaggaacaaaagtgaacggtgaagaacatcacaagcttgatgagataaacaagg1080

ccgaagcagagttgactgtgaatggcactcacgagagctgaactggtgaggtcaaaagcc1140

tggagcagggaatagattaataagctctccgcttccctcctctcattctgacccctttag1200

atctgtttgaaatgactgtagtttttgttaatgttatttctctgattgtttattgaaata1260

acaatatacaattatagagcatagccgtatcatgtaccacccttgggtgtattggacaga1320

cgtgtagcttctagttgcttttgtaacattatgttgtaagatgtgatatggacctgtaat1380

catatatgtaaggaagtgatcctatata1408

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<223>引物序列

<400>2

atggcgagcgcagtggagaag21

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<223>引物序列

<400>3

tcagctctcgtgagtgccattc22

<210>4

<211>918

<212>dna

<213>人工序列

<223>目的基因片段的基因序列

<400>4

atggcgagcgcagtggagaaggagggtggcgcgagcgaggaaactttgtctttggagctt60

cctgctccacctggttggaagaagcagttcattccaaagaaagctggtaccccaaagaaa120

aacgagattgtgttcactgcaccaacaggagaggagatcaataacaggaagcagctggaa180

aaatatttgaaagcacaccctggaggcccagctgtatcagaatttgactggggcactggt240

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agggagcccccaaagaagcgtactaaaagatcatcagcttcacaaaaggaaatttcccag360

gaagaaaaagaagaggagaccaaggaagcagagatgcaagaagctgatgacaccactaag420

ggtgataatgatatagagaaggaaaaggttgttgtaaacgaaaatcatgacaagagtgtg480

gaagatacagatgtcaacaaatccactcgttatggagaagaagctaaagctggagaaaac540

gttgaggtacctattgaagaggaaaaatccaatgctgctgatggagaactacctgcatta600

aaagataaagctgatgacaaagtaactgagggctctgaagtttttctgagaaaggatgaa660

gaaaagattgagcaaccacaggaagagacaaaagaatatagtggatttggggagccagag720

aaattggaaacatgcactactgcagacaaaacggttgaagtggaaggagtgaataaagag780

gatcacgtcaaaagtactcatgaatttgaagttggggaaatagaaggaacaaaagtgaac840

ggtgaagaacatcacaagcttgatgagataaacaaggccgaagcagagttgactgtgaat900

ggcactcacgagagctga918

<210>5

<211>6177

<212>dna

<213>人工序列

<223>pet-28a重組質(zhì)?；蛐蛄?/p>

<400>5

atccggatatagttcctcctttcagcaaaaaacccctcaagacccgtttagaggccccaa60

ggggttatgctagttattgctcagcggtggcagcagccaactcagcttcctttcgggctt120

tgttagcagccggatctcagtggtggtggtggtggtgctcgaggcttcggccttgtttat180

ctcatcaagcttgtgatgttcttcaccgttcacttttgttccttctatttccccaacttc240

aaattcatgagtacttttgacgtgatcctctttattcactccttccacttcaaccgtttt300

gtctgcagtagtgcatgtttccaatttctctggctccccaaatccactatattcttttgt360

ctcttcctgtggttgctcaatcttttcttcatcctttctcagaaaaacttcagagccctc420

agttactttgtcatcagctttatcttttaatgcaggtagttctccatcagcagcattgga480

tttttcctcttcaataggtacctcaacgttttctccagctttagcttcttctccataacg540

agtggatttgttgacatctgtatcttccacactcttgtcatgattttcgtttacaacaac600

cttttccttctctatatcattatcacccttagtggtgtcatcagcttcttgcatctctgc660

ttccttggtctcctcttctttttcttcctgggaaatttccttttgtgaagctgatgatct720

tttagtacgcttctttgggggctccctctgtgttggaggagctgccttggccttctcact780

gattcttgtagatcttcttggggtctcaccagtgccccagtcaaattctgatacagctgg840

gcctccagggtgtgctttcaaatatttttccagctgcttcctgttattgatctcctctcc900

tgttggtgcagtgaacacaatctcgtttttctttggggtaccagctttctttggaatgaa960

ctgcttcttccaaccaggtggagcaggaagctccaaagacaaagtttcctcgctcgcgcc1020

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atgatgatgatgatggctgctgcccatggtatatctccttcttaaagttaaacaaaatta1140

tttctagaggggaattgttatccgctcacaattcccctatagtgagtcgtattaatttcg1200

cgggatcgagatctcgatcctctacgccggacgcatcgtggccggcatcaccggcgccac1260

aggtgcggttgctggcgcctatatcgccgacatcaccgatggggaagatcgggctcgcca1320

cttcgggctcatgagcgcttgtttcggcgtgggtatggtggcaggccccgtggccggggg1380

actgttgggcgccatctccttgcatgcaccattccttgcggcggcggtgctcaacggcct1440

caacctactactgggctgcttcctaatgcaggagtcgcataagggagagcgtcgagatcc1500

cggacaccatcgaatggcgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagaga1560

gtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccg1620

gtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaa1680

cgcgggaaaaagtggaagcggcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcac1740

aacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggccctgc1800

acgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgccagcg1860

tggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatc1920

ttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgcca1980

ttgctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccaga2040

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tggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcgg2160

cgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattcagccgatag2220

cggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctga2280

atgagggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaa2340

tgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagtgggatacg2400

acgataccgaagacagctcatgttatatcccgccgttaaccaccatcaaacaggattttc2460

gcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtga2520

agggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaata2580

cgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggttt2640

cccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtaagttagctcactcattag2700

gcaccgggatctcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctccttccggtgg2760

gcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgta2820

ggacaggtgccggcagcgctctgggtcattttcggcgaggaccgctttcgctggagcgcg2880

acgatgatcggcctgtcgcttgcggtattcggaatcttgcacgccctcgctcaagccttc2940

gtcactggtcccgccaccaaacgtttcggcgagaagcaggccattatcgccggcatggcg3000

gccccacgggtgcgcatgatcgtgctcctgtcgttgaggacccggctaggctggcggggt3060

tgccttactggttagcagaatgaatcaccgatacgcgagcgaacgtgaagcgactgctgc3120

tgcaaaacgtctgcgacctgagcaacaacatgaatggtcttcggtttccgtgtttcgtaa3180

agtctggaaacgcggaagtcagcgccctgcaccattatgttccggatctgcatcgcagga3240

tgctgctggctaccctgtggaacacctacatctgtattaacgaagcgctggcattgaccc3300

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tccagtaaccgggcatgttcatcatcagtaacccgtatcgtgagcatcctctctcgtttc3420

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caagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccag3780

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tgagagtgcaccatatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccg3900

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gcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataa4020

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aattgcagtttcatttgatgctcgatgagtttttctaagaattaattcatgagcggatac5640

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gtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcccattcgcca6177