本發(fā)明涉及dna分子標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種篩選紫背浮萍根生長相關(guān)的分子標(biāo)記的方法。
背景技術(shù)：
富、高度雜合且穩(wěn)定性好、遵循孟德爾分離定律共顯性遺傳、易于pcr擴(kuò)增等特點(diǎn)，已成為近年來廣泛應(yīng)用的dna標(biāo)記，常應(yīng)用于生物資源的家系譜系認(rèn)證、基因連鎖分析、遺傳圖譜構(gòu)建、種質(zhì)鑒定、種群遺傳多樣性等許多研究領(lǐng)域。
在自然環(huán)境中，紫背浮萍基本以無性生殖進(jìn)行繁殖，當(dāng)環(huán)境條件適宜時2天即可克隆出一代，種群遺傳多樣性水平較低。
現(xiàn)有技術(shù)提供多種衛(wèi)星標(biāo)記的檢測方法，例如，中國發(fā)明授權(quán)專利文獻(xiàn)一種銹斑蟳微衛(wèi)星標(biāo)記的快速檢測方法授權(quán)公告號cn103305611b該發(fā)明涉及一種銹斑蟳微衛(wèi)星標(biāo)記的快速檢測方法，包括：（1）銹斑蟳基因組dna的提取；（2）根據(jù)genebank數(shù)據(jù)庫中銹斑蟳的功能基因序列，獲得含有微衛(wèi)星重復(fù)的基因序列；（3）微衛(wèi)星標(biāo)記引物的設(shè)計(jì)；（4）銹斑蟳不同個體的基因組dna的pcr擴(kuò)增；（5）pcr產(chǎn)物的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。該發(fā)明的檢測方法具有快速、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，能夠直觀地檢測出銹斑蟳不同個體的基因型，從而快速獲得銹斑蟳在功能基因微衛(wèi)星位點(diǎn)遺傳變異的多態(tài)性圖譜，該微衛(wèi)星標(biāo)記可應(yīng)用于銹斑蟳遺傳變異與種群遺傳多樣性分析等領(lǐng)域，但微衛(wèi)星標(biāo)記檢測速度還有提升空間。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種快速篩選與紫背浮萍根生長相關(guān)的分子標(biāo)記方法，清晰紫背浮萍的根數(shù)/片、總根長/片和平均根長/片與相關(guān)dna位點(diǎn)的關(guān)系。
本發(fā)明針對背景技術(shù)中提到的問題，采取的技術(shù)方案為：篩選紫背浮萍根生長相關(guān)的分子標(biāo)記的方法，包括克隆體培養(yǎng)、基因組dna提取、設(shè)計(jì)微衛(wèi)星引物、pcr擴(kuò)增和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。
作為優(yōu)選，植株克隆體培養(yǎng)的營養(yǎng)液成份及其濃度為：氮0.3~0.4g/l、磷酐0.1~0.15g/l、氧化鉀0.16~0.23g/l、氧化鎂0.01~0.015g/l和硫0.012~0.02g/l。上述營養(yǎng)液能全面提供紫背浮萍生長所需的大量元素和微量元素，無性繁殖速度快，基因突變的概率低，可得到大量基因相同的植株，樣本量足。
作為優(yōu)選，植株克隆體在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行室內(nèi)培養(yǎng)50~70d，培養(yǎng)條件為22.5~23.5℃，濕度73~83%，光照強(qiáng)度為1800~2200lux，光暗時間14~16:10~8h。上述培養(yǎng)條件下，紫背浮萍的光合作用強(qiáng)，生長速度快。
作為優(yōu)選，微衛(wèi)星引物為：sp25：f:ggcagagacagaaagatcatc；r:cctagttccctagagcgagag；sp30：f:cgcctataagtaaccccctac；r:atcatatctgctcgaaccatc；sp47：f:tgggcctatggcgattagggg；r:gcggcatccacggagaaaatg；sp53：f:aggacgacgacctctactgcc；r:tacgagttctgcggaccatca。
作為優(yōu)選，pcr擴(kuò)增體系為18~22ul，其中包括3.4~4.2utaqdna聚合酶（sangon）、1.6~2.2ul10×pcrbuffer、0.7~0.9mmdntp、上游、下游引物各0.3mm、50~100ngdna模板，ddh2o補(bǔ)至終體積20ul；在bio-radpcr擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)?2~96℃預(yù)變性4.5~5.6min；93~96℃變性28~33s，52~56℃復(fù)性33~37s，70~75℃延伸36~43s，共33~38個循環(huán)；最終70~75℃延伸2.5~3.4min。上述pcr擴(kuò)增可快速得到大量的經(jīng)微衛(wèi)星引物標(biāo)記的紫背浮萍的dna序列。
作為優(yōu)選，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析為對浮萍克隆的根數(shù)/片、總根長/片和平均根長/片進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，應(yīng)用單因素方差分析和最小顯著差數(shù)法或dunnettt3非參數(shù)多重比較兩兩基因型生長性狀特征之間的差異性；應(yīng)用一般線性模型過程對根數(shù)/片、總根長/片和平均根長/片性狀與微衛(wèi)星位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行最小二乘分析,并對同一位點(diǎn)的各基因型進(jìn)行多重比較。紫背浮萍的根數(shù)/片、總根長/片及平均根長/片與sp25、sp30、sp47和sp53位點(diǎn)顯著相關(guān)（p均小于0.01）。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明可快速得到大量的經(jīng)微衛(wèi)星引物標(biāo)記的紫背浮萍的dna序列，微衛(wèi)星標(biāo)記檢測速度快，可快速獲得紫背浮萍sp25、sp30、sp47和sp53遺傳標(biāo)記基因座呈現(xiàn)高度遺傳變異的多態(tài)性圖譜。紫背浮萍的根數(shù)/片、總根長/片及平均根長/片與sp25、sp30、sp47和sp53位點(diǎn)顯著相關(guān)（p均小于0.01）。了解基因型差異對紫萍生長以及污染物凈化能力的影響，提高廢水的生物治理效率。
具體實(shí)施例
下面通過實(shí)施例對本發(fā)明方案作進(jìn)一步說明：
實(shí)施例1：
篩選紫背浮萍根生長相關(guān)的分子標(biāo)記的方法，包括克隆體培養(yǎng)、基因組dna提取、設(shè)計(jì)微衛(wèi)星引物、pcr擴(kuò)增和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。
植株克隆體培養(yǎng)的營養(yǎng)液成份及其濃度為：氮0.3~0.4g/l、磷酐0.1~0.15g/l、氧化鉀0.16~0.23g/l、氧化鎂0.01~0.015g/l和硫0.012~0.02g/l。上述營養(yǎng)液能全面提供紫背浮萍生長所需的大量元素和微量元素，無性繁殖速度快，基因突變的概率低，可得到大量基因相同的植株，樣本量足。
植株克隆體在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行室內(nèi)培養(yǎng)50~70d，培養(yǎng)條件為22.5~23.5℃，濕度73~83%，光照強(qiáng)度為1800~2200lux，光暗時間14~16:10~8h。上述培養(yǎng)條件下，紫背浮萍的光合作用強(qiáng)，生長速度快。
微衛(wèi)星引物為：sp25：f:ggcagagacagaaagatcatc；r:cctagttccctagagcgagag；sp30：f:cgcctataagtaaccccctac；r:atcatatctgctcgaaccatc；sp47：f:tgggcctatggcgattagggg；r:gcggcatccacggagaaaatg；sp53：f:aggacgacgacctctactgcc；r:tacgagttctgcggaccatca。
pcr擴(kuò)增體系為18~22ul，其中包括3.4~4.2utaqdna聚合酶（sangon）、1.6~2.2ul10×pcrbuffer、0.7~0.9mmdntp、上游、下游引物各0.3mm、50~100ngdna模板，ddh2o補(bǔ)至終體積20ul；在bio-radpcr擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)?2~96℃預(yù)變性4.5~5.6min；93~96℃變性28~33s，52~56℃復(fù)性33~37s，70~75℃延伸36~43s，共33~38個循環(huán)；最終70~75℃延伸2.5~3.4min。上述pcr擴(kuò)增可快速得到大量的經(jīng)微衛(wèi)星引物標(biāo)記的紫背浮萍的dna序列。
數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析為對浮萍克隆的根數(shù)/片、總根長/片和平均根長/片進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，應(yīng)用單因素方差分析和最小顯著差數(shù)法或dunnettt3非參數(shù)多重比較兩兩基因型生長性狀特征之間的差異性；應(yīng)用一般線性模型過程對根數(shù)/片、總根長/片和平均根長/片性狀與微衛(wèi)星位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行最小二乘分析,并對同一位點(diǎn)的各基因型進(jìn)行多重比較。紫背浮萍的根數(shù)/片、總根長/片及平均根長/片與sp25、sp30、sp47和sp53位點(diǎn)顯著相關(guān)（p均小于0.01）。
實(shí)施例2：
篩選紫背浮萍根生長相關(guān)的分子標(biāo)記的方法，包括克隆體培養(yǎng)、基因組dna提取、設(shè)計(jì)微衛(wèi)星引物、pcr擴(kuò)增和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。
植株克隆體培養(yǎng)的營養(yǎng)液成份及其濃度為：氮0.32g/l、磷酐0.12g/l、氧化鉀0.19g/l、氧化鎂0.012g/l和硫0.016g/l。上述營養(yǎng)液能全面提供紫背浮萍生長所需的大量元素和微量元素，無性繁殖速度快，基因突變的概率低，可得到大量基因相同的植株，樣本量足。
植株克隆體在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行室內(nèi)培養(yǎng)60d，培養(yǎng)條件為23℃，濕度78%，光照強(qiáng)度為2000lux，光暗時間16:8h。上述培養(yǎng)條件下，紫背浮萍的光合作用強(qiáng)，生長速度快。
微衛(wèi)星引物為：sp25：f:ggcagagacagaaagatcatc；r:cctagttccctagagcgagag；sp30：f:cgcctataagtaaccccctac；r:atcatatctgctcgaaccatc；sp47：f:tgggcctatggcgattagggg；r:gcggcatccacggagaaaatg；sp53：f:aggacgacgacctctactgcc；r:tacgagttctgcggaccatca。
pcr擴(kuò)增體系為20ul，其中包括4utaqdna聚合酶（sangon）、2ul10×pcrbuffer、0.8mmdntp、上游、下游引物各0.3mm、50-100ngdna模板，ddh2o補(bǔ)至終體積20ul。在bio-radpcr擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，54℃復(fù)性35s，72℃延伸40s，共35個循環(huán)；最終72℃延伸3min。pcr擴(kuò)增產(chǎn)物在3730xl測序儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測。上述pcr擴(kuò)增可快速得到大量的經(jīng)微衛(wèi)星引物標(biāo)記的紫背浮萍的dna序列。
數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析為對浮萍克隆的根數(shù)/片、總根長/片和平均根長/片進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，應(yīng)用單因素方差分析和最小顯著差數(shù)法或dunnettt3非參數(shù)多重比較兩兩基因型生長性狀特征之間的差異性；應(yīng)用一般線性模型過程對根數(shù)/片、總根長/片和平均根長/片與微衛(wèi)星位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行最小二乘分析,并對同一位點(diǎn)的各基因型進(jìn)行多重比較。紫背浮萍的根數(shù)/片、總根長/片及平均根長/片與sp25、sp30、sp47和sp53位點(diǎn)顯著相關(guān)（p均小于0.01）。
實(shí)施例3：
篩選紫背浮萍根生長相關(guān)的分子標(biāo)記的方法，包括克隆體培養(yǎng)、基因組dna提取、設(shè)計(jì)微衛(wèi)星引物、pcr擴(kuò)增和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。
植株克隆體培養(yǎng)的營養(yǎng)液成份及其濃度為：氮0.32g/l、磷酐0.12g/l、氧化鉀0.2g/l、氧化鎂0.013g/l和硫0.017g/l。上述營養(yǎng)液能全面提供紫背浮萍生長所需的大量元素和微量元素，無性繁殖速度快，基因突變的概率低，可得到大量基因相同的植株，樣本量足。
對不同培養(yǎng)系中的每一植株（葉片相連）計(jì)數(shù)根數(shù)/片、總根長/片和平均根長/片。
微衛(wèi)星引物為：sp25：f:ggcagagacagaaagatcatc；r:cctagttccctagagcgagag；sp30：f:cgcctataagtaaccccctac；r:atcatatctgctcgaaccatc；sp47：f:tgggcctatggcgattagggg；r:gcggcatccacggagaaaatg；sp53：f:aggacgacgacctctactgcc；r:tacgagttctgcggaccatca。
采用改良的ctab方法提取紫背浮萍和少根紫萍基因組dna。pcr擴(kuò)增體系為20ul，其中包括4utaqdna聚合酶（sangon）、2ul10×pcrbuffer、0.8mmdntp、上游、下游引物各0.3mm、50-100ngdna模板，ddh2o補(bǔ)至終體積20ul。在bio-radpcr擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，54℃復(fù)性35s，72℃延伸40s，共35個循環(huán)；最終72℃延伸3min。pcr擴(kuò)增產(chǎn)物在3730xl測序儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測。
數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析為采用spss19.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對浮萍克隆的根數(shù)/片、總根長/片和平均根長/片進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，應(yīng)用單因素方差分析（one-wayanova）和最小顯著差數(shù)法（least-significantdifference，lsd）或dunnettt3非參數(shù)多重比較兩兩基因型生長性狀特征之間的差異性；應(yīng)用一般線性模型（generallinearmodels,glm）過程對根數(shù)/片、總根長/片和平均根長/片性狀與微衛(wèi)星位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行最小二乘分析,并對同一位點(diǎn)的各基因型進(jìn)行多重比較。紫背浮萍的根數(shù)/片、總根長/片及平均根長/片與sp25、sp30、sp47和sp53位點(diǎn)顯著相關(guān)（p均小于0.01）。
微衛(wèi)星標(biāo)記掃描：
用毛細(xì)管電泳檢測4個微衛(wèi)星標(biāo)記的紫背浮萍。結(jié)果顯示，3個紫背浮萍克隆為3個不同的mlgs。
表1紫背浮萍3個克隆在2個微衛(wèi)星位點(diǎn)的基因型
表2四個微衛(wèi)星位點(diǎn)不同基因型在紫背浮萍根生長性狀的多重比
紫背浮萍3個克隆在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)分別培養(yǎng)得到155~162個分株，3個mlgs的紫背浮萍的總根長/片為23.93±1.29mm，平均根長為2.73±0.11mm（p均小于0.001）。紫背浮萍最大根長出現(xiàn)在mlgsⅰ，為13.25mm；mlgsⅲ的平均根長/片為3.53±0.17mm，顯著大于其它2個紫背浮萍克?。╬<0.001）。由此可看出紫背浮萍的根數(shù)/片、總根長/片及平均根長/片與sp25、sp30、sp47和sp53位點(diǎn)顯著相關(guān)（p均小于0.01）。
本發(fā)明的操作步驟中的常規(guī)操作為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，在此不進(jìn)行贅述。
以上所述的實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行了詳細(xì)說明，應(yīng)理解的是以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的原則范圍內(nèi)所做的任何修改、補(bǔ)充或類似方式替代等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
sequencelisting
<110>浙江海洋大學(xué)
<120>篩選與紫背浮萍根生長相關(guān)的分子標(biāo)記的方法
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