本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及osnpf5.16基因在提高水稻單株產(chǎn)量中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

植物通過吸收土壤中的氨、硝酸根、氨基酸、可溶性肽等來獲得氮素；氮的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)主要依靠銨根運(yùn)輸?shù)鞍祝╝mt）、硝酸根運(yùn)輸?shù)鞍祝╪rt）、氨基酸運(yùn)輸?shù)鞍祝╝at）、肽運(yùn)輸?shù)鞍祝╬tr）等運(yùn)輸?shù)鞍讈硗瓿桑╳illiamsl,millera.transportersresponsiblefortheuptakeandpartitioningofnitrogenoussolutes.annualreviewofplantphysiologyandplantmolecularbiology,2001,52:659-688.）。銨通過植物amt吸收后再通過谷氨酰胺合成酶（gs）和谷氨酸合酶（gogat）合成谷氨酰胺和谷氨酸，后者再進(jìn)一步形成其它氨基酸（sonoday,ikedaa,saikis,etal.feedbackregulationoftheammoniumtransportergenefamilyamt1byglutamineinrice.plantcellphysiology,2003,44:1396-1402.）。植物可通過高親和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（hats）的nrt2和低親和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（lats）的nrt1吸收環(huán)境中的硝酸鹽，由硝酸還原酶（nr）和亞硝酸還原酶（nir）還原形成銨，再進(jìn)一步形成氨基酸（paungfoo-lonhiennec,lonhiennetg,rentschd,etal.plantscanuseproteinasanitrogensourcewithoutassistancefromotherorganisms.proceedingsofthenationalacademyofsciences,2008,105:4524-4529.）。

氮運(yùn)輸npf家族包括nrt1和ptr亞家族，不同成員在植株不同部位運(yùn)輸硝酸根、寡肽或氨基酸等，在植株生長(zhǎng)發(fā)育上起不同的作用（rentschd,schmidts,tegederm.transportersforuptakeandallocationoforganicnitrogencompoundsinplants.febsletters,2007,581:2281-2289.）。osnpf2.2介導(dǎo)了木質(zhì)部硝酸根的卸載，影響水稻植株生長(zhǎng)（liy,ouyangj,wangyy,etal.disruptionofthericenitratetransporterosnpf2.2hindersroot-to-shootnitratetransportandvasculardevelopment.scientificreports,2015,5:9635.）。osnpf7.2對(duì)硝酸根有低親和運(yùn)輸，能夠影響植株生長(zhǎng)（hur,qiud,cheny,etal.knock-downofatonoplastlocalizedlow-affinitynitratetransporterosnpf7.2affectsricegrowthunderhighnitratesupply.frontiersinplantscience,2016,7.）。

雖然已知氮營(yíng)養(yǎng)可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育，但是氮營(yíng)養(yǎng)影響了植株什么類型的生長(zhǎng)發(fā)育目前還沒有系統(tǒng)的了解。另外水稻npf家族有80多個(gè)成員，氮營(yíng)養(yǎng)是通過npf基因家族什么成員進(jìn)行響應(yīng)，在什么部位介導(dǎo)了氮營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸，從而影響了植株什么類型的生長(zhǎng)發(fā)育，目前也幾乎未知。所以，挖掘出npf家族中可能具有氮高效運(yùn)輸基因，特別是能夠控制水稻農(nóng)藝性狀的氮運(yùn)輸關(guān)鍵基因，將有利于水稻高產(chǎn)品種的培育。本發(fā)明通過長(zhǎng)期研究后發(fā)現(xiàn)，npf家族osnpf5.16基因?qū)λ镜膯沃戤a(chǎn)量有重要的調(diào)控作用，該基因通過超表達(dá)后能使水稻增產(chǎn)，可直接應(yīng)用于植物株型改良。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提供水稻npf基因家族成員osnpf5.16基因在提高水稻單株產(chǎn)量中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明以水稻的npf基因家族成員osnpf5.16基因?yàn)閷?duì)象，從水稻中花11中克隆了osnpf5.16的cdna序列。通過構(gòu)建osnpf5.16基因超表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌eha105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將超表達(dá)載體導(dǎo)入正常粳稻品種中花11中，得到osnpf5.16基因超表達(dá)植株，其分蘗數(shù)、穗數(shù)和灌漿粒數(shù)與對(duì)照野生型中花11相比顯著提高。通過rnai技術(shù)構(gòu)建osnpf5.16基因干擾表達(dá)載體，將干擾表達(dá)載體導(dǎo)入中花11中，得到osnpf5.16基因表達(dá)量下降的干擾植株，干擾植株的分蘗數(shù)、穗數(shù)和灌漿粒數(shù)與中花11相比顯著降低。這些結(jié)果表明，通過提高osnpf5.16基因的表達(dá)，可以使正常的水稻分蘗數(shù)、穗數(shù)和灌漿粒數(shù)增加，從而提高水稻單株產(chǎn)量。

基于本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的osnpf5.16基因的功能，osnpf5.16基因可用于水稻選育中。所述的水稻選育為提高水稻分蘗數(shù)、穗數(shù)和灌漿粒數(shù)，從而提高水稻單株產(chǎn)量。具體可通過提高osnpf5.16基因的表達(dá)使水稻分蘗數(shù)、每株穗數(shù)、每株灌漿粒數(shù)增加，達(dá)到提高水稻單株產(chǎn)量的目的。

osnpf5.16基因也可用于提高其他植物的產(chǎn)量，如通過轉(zhuǎn)基因使osnpf5.16基因在植物中（超量）表達(dá)，來提高植物的分枝數(shù)量，進(jìn)而使植物的產(chǎn)量得到提高。所述的植物是指單子葉植物或雙子葉植物；如：小麥、番茄、草坪草或苜蓿等。

所述的osnpf5.16基因編碼的osnpf5.16蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示；所述的osnpf5.16基因的cdna序列優(yōu)選如seqidno.2所示。

應(yīng)該理解為，在不影響osnpf5.16蛋白活性的前提下（即不在蛋白的活性中心），本領(lǐng)域技術(shù)人員可對(duì)seqidno.1所示的氨基酸序列進(jìn)行各種取代、添加和/或缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸獲得具有同等功能的氨基酸序列。因此，osnpf5.16蛋白還包括seqidno.1所示氨基酸序列經(jīng)取代、替換和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸獲得的具有同等活性的蛋白質(zhì)。此外，應(yīng)理解，考慮到密碼子的簡(jiǎn)并性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達(dá)的密碼子。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果：

（1）本發(fā)明克隆的osnpf5.16基因超表達(dá)后使水稻分蘗數(shù)、穗數(shù)和灌漿粒數(shù)增加，說明osnpf5.16基因?qū)μ岣咚井a(chǎn)量有明顯影響，因此，通過基因工程技術(shù)提高osnpf5.16基因的表達(dá)能夠提高植物產(chǎn)量。這不僅有助于通過正常施氮條件下培育高產(chǎn)水稻，還可以通過分子育種進(jìn)行植物的品種改良。

（2）osnpf5.16基因的成功克隆，進(jìn)一步證實(shí)了npf家族在氮吸收過程中的重要作用，對(duì)闡明npf家族的生物學(xué)功能有重要的意義，另外對(duì)進(jìn)一步了解植物氮代謝途徑，提高氮吸收效率有極大的推動(dòng)作用。

（3）盡管目前已克隆到了一些提高植物產(chǎn)量的基因，但對(duì)植物增產(chǎn)的分子機(jī)制仍不清楚。而本發(fā)明克隆的osnpf5.16基因能夠提高水稻的產(chǎn)量，對(duì)確定植物增產(chǎn)的關(guān)鍵因素有極大的推動(dòng)作用。

附圖說明

圖1是對(duì)照中花11、osnpf5.16基因超表達(dá)植株2個(gè)株系和osnpf5.16基因干擾植株2個(gè)株系的整株表型圖。

圖2是對(duì)照中花11、osnpf5.16基因超表達(dá)植株2個(gè)株系和osnpf5.16基因干擾植株2個(gè)株系每株分蘗數(shù)的統(tǒng)計(jì)柱狀圖，數(shù)據(jù)采用spss軟件進(jìn)行變量分析（anova），使用duncan’s在0.05水平上進(jìn)行差異顯著性分析，不同組別小寫字母（a、b、c）表示差異顯著。

圖3是對(duì)照中花11、osnpf5.16基因超表達(dá)植株2個(gè)株系和osnpf5.16基因干擾植株2個(gè)株系每株有效穗數(shù)的統(tǒng)計(jì)柱狀圖，數(shù)據(jù)采用spss軟件進(jìn)行變量分析（anova），使用duncan’s在0.05水平上進(jìn)行差異顯著性分析，不同組別小寫字母（a、b、c）表示差異顯著。

圖4是對(duì)照中花11、osnpf5.16基因超表達(dá)植株2個(gè)株系和osnpf5.16基因干擾植株2個(gè)株系的每株灌漿粒數(shù)表型圖。

圖5是對(duì)照中花11、osnpf5.16基因超表達(dá)植株2個(gè)株系和osnpf5.16基因干擾植株2個(gè)株系的每株灌漿粒數(shù)統(tǒng)計(jì)圖，數(shù)據(jù)采用spss軟件進(jìn)行變量分析（anova），使用duncan’s在0.05水平上進(jìn)行差異顯著性分析，不同組別小寫字母（a、b、c）表示差異顯著。

圖6是對(duì)照中花11、osnpf5.16基因超表達(dá)植株2個(gè)株系和osnpf5.16基因干擾植株2個(gè)株系中osnpf5.16基因相對(duì)表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)柱狀圖，數(shù)據(jù)采用spss軟件進(jìn)行變量分析（anova），使用duncan’s在0.05水平上進(jìn)行差異顯著性分析，不同組別小寫字母（a、b、c）表示差異顯著。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。若未特別指明，下述實(shí)施例所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段；所用的實(shí)驗(yàn)方法均為常規(guī)方法，并可按照已描述的重組技術(shù)（參見分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約）完成；所用的材料、試劑等，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1osnpf5.16基因超表達(dá)植株的構(gòu)建

提取水稻中花11的rna，并將其反轉(zhuǎn)錄成cdna，利用引物對(duì)：

f1：5'-ggtaccatggacgcgggggcggagcccctc-3'（kpni），

r1：5'-tctagaatccaattccaatcctttgcaacg-3'（xbai）；

通過pcr擴(kuò)增osnpf5.16基因的cdna后，通過kpni、xbai酶切后連入pcambia-1306載體（pcambia-1306載體購(gòu)自cambia公司），構(gòu)建出osnpf5.16基因的超表達(dá)載體osnpf5.16-p1306。采用農(nóng)桿菌eha105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將超表達(dá)載體導(dǎo)入正常水稻品種中花11中。

將得到的所有轉(zhuǎn)基因小苗移栽于帶泥土的筐中，定期澆水，施肥，待小苗長(zhǎng)高約10cm時(shí)，種于大田中，待苗長(zhǎng)大后，提取基因組dna通過pcr對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)引物對(duì)為：

f2：5'-gatgttggcgacctcgtatt-3'，

r2：5'-tcgttatgtttatcggcacttt-3'。

若擴(kuò)增出517bp的片段，則說明轉(zhuǎn)基因植株為陽(yáng)性植株。陽(yáng)性植株單株收種并種植，直至t2代鑒定出純合的轉(zhuǎn)基因植株，即得到osnpf5.16基因超表達(dá)植株。osnpf5.16基因超表達(dá)植株的分蘗數(shù)、有效穗數(shù)和灌漿粒數(shù)遠(yuǎn)多于對(duì)照中花11植株，差異顯著，如圖1-5所示。

取osnpf5.16基因超表達(dá)植株葉片，提取rna并將其反轉(zhuǎn)錄成cdna，通過實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)osnpf5.16基因的表達(dá)量，結(jié)果顯示（圖6）超表達(dá)植株osnpf5.16基因的表達(dá)量與對(duì)照中花11相比顯著升高。實(shí)時(shí)熒光定量pcr所用引物對(duì)為：

f3：5'-cggcatctccgggaacctga-3'，

r3：5'-gcgcagatgatgatgcggta-3'。

實(shí)施例2osnpf5.16基因干擾植株的構(gòu)建

提取水稻中花11的rna，并將其反轉(zhuǎn)錄成cdna，利用引物對(duì)：

f4：5'-ggtaccggagatctcggagcggttcgcctt-3'（kpni），

r4：5'-ggatcccatgccaagccccaggatgt-3'（bamhi）；

f5：5'-actagtggagatctcggagcggttcgcctt-3'（spei），

r5：5'-gagctccatgccaagccccaggatgt-3'（saci）；

各自pcr擴(kuò)增出osnpf5.16基因的cdna片段后，通過相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切后連入ptck303載體，構(gòu)建出osnpf5.16基因的干擾表達(dá)載體osnpf5.16-ptck303。采用農(nóng)桿菌eha105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將干擾表達(dá)載體導(dǎo)入正常粳稻品種中花11中。

將得到的所有轉(zhuǎn)基因小苗移栽于帶泥土的筐中，定期澆水，施肥，待小苗長(zhǎng)高約10cm時(shí)，種于大田中，待苗長(zhǎng)大后，提取基因組dna通過pcr對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)引物對(duì)為：

f2：5'-gatgttggcgacctcgtatt-3'，

r2：5'-tcgttatgtttatcggcacttt-3'。

若擴(kuò)增出517bp的片段，則說明轉(zhuǎn)基因植株為陽(yáng)性植株。陽(yáng)性植株單株收種并種植，直至t2代鑒定出純合的轉(zhuǎn)基因植株，即得到osnpf5.16基因干擾植株。osnpf5.16基因干擾植株的每株分蘗數(shù)、有效穗數(shù)和灌漿粒數(shù)遠(yuǎn)少于對(duì)照中花11植株，差異顯著，如圖1-5所示。

取osnpf5.16基因干擾植株葉片，提取rna并將其反轉(zhuǎn)錄成cdna，通過實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)osnpf5.16基因的表達(dá)量，結(jié)果顯示（圖6）干擾植株osnpf5.16基因的表達(dá)量與對(duì)照中花11相比顯著降低。實(shí)時(shí)熒光定量pcr所用引物同實(shí)施例1。

上述結(jié)果表明，通過提高osnpf5.16基因的表達(dá)，可以增加水稻的分蘗數(shù)、穗數(shù)，并使得水稻每株灌漿粒數(shù)增加，進(jìn)而提高水稻產(chǎn)量。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>武漢生物工程學(xué)院

<120>osnpf5.16基因在提高水稻單株產(chǎn)量中的應(yīng)用

<130>1

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>361

<212>prt

<213>oryzasativa

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100105110

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