本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)與藥理學(xué)領(lǐng)域，涉及一種為肺癌提供離體個體化藥物測試系統(tǒng)的建立及培養(yǎng)基。

背景技術(shù)：

肺癌是中國和世界范圍內(nèi)最常見也是死亡率最高的惡性腫瘤，是危害人類健康的頭號殺手。肺癌按病理分型可分為非小細(xì)胞肺癌（nsclc）和小細(xì)胞肺癌（sclc），約占所有肺癌的80%和20%。非小細(xì)胞肺癌中，鱗癌約占20%-35%，腺癌約占30%-45%。肺癌確診時多數(shù)患者分期較晚是影響肺癌預(yù)后的重要原因，而早期肺癌可以通過多學(xué)科綜合治療實現(xiàn)較好的預(yù)后，可以得到更好的臨床獲益。nsclc的腫瘤細(xì)胞生長速度及惡性程度均比sclc低，但對放化療不如sclc敏感?；熓峭砥趎sclc綜合治療的重要手段，在肺癌的治療中占有非常重要的地位，但有效率只有20-40％。腫瘤的多藥耐藥現(xiàn)象和臨床上缺乏個體化治療是導(dǎo)致化療失敗的重要原因。準(zhǔn)確的化療藥物體外敏感性檢測是制定個體化治療方案的前提。因此如何針對性的選擇化療藥物，避免無效治療，降低患者痛苦，提高臨床上的療效日益受到越來越多科研人員和醫(yī)學(xué)工作者的關(guān)注與重視。

有文獻(xiàn)報道體外藥敏的檢測結(jié)果與臨床治療療效的總體符合率約為80%，具有較高的敏感度和特異度，表明體外藥敏試驗與臨床治療敏感性有較好的相關(guān)性，且具有操作簡易和經(jīng)濟(jì)可行等優(yōu)勢。然而體外藥敏評價細(xì)胞模型也存在建立成功率低、腫瘤間質(zhì)細(xì)胞混雜、無法長期培養(yǎng)等問題。一直以來受限于原代腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)的技術(shù)，很難建立來源于肺癌患者的原發(fā)腫瘤細(xì)胞模型，因為這樣的模型不僅需要能夠在體外穩(wěn)定培養(yǎng)，而且能反映出患者體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的特性，代表真正原發(fā)位點的腫瘤生物學(xué)特性，才能作為理想的體外藥敏檢測模型。從腫瘤的個體化治療角度而言，只有在體外分離培養(yǎng)原代腫瘤細(xì)胞穩(wěn)定傳代后，才能進(jìn)行更多更廣泛的臨床前藥敏檢測，結(jié)合臨床經(jīng)驗設(shè)計藥物劑量和藥物組合，才能確定最優(yōu)化的化療使用方案安排臨床治療。

此外，抗腫瘤藥尤其是化療藥引起的肺毒性反應(yīng)嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量，甚至危及生命的化療限制性毒性。抗腫瘤藥相關(guān)肺損傷可涉及氣道、胸膜、縱膈、肺血管，最常見的肺毒性是間質(zhì)性肺疾?。╥ld）?？芍路味拘缘拇砟[瘤藥以博來霉素、甲氨蝶呤、絲裂霉素、馬利蘭、洛莫司汀為首。其他可能導(dǎo)致ild的腫瘤藥：阿糖胞苷、紫杉醇類、環(huán)磷酰胺、吉西他濱、伊立替康、奧沙利鉑、長春堿、拓?fù)涮婵怠⒍嗳岜刃?、依托泊苷，靶向藥物如貝伐單抗、利妥昔單抗、曲妥珠單抗、厄洛替尼、吉非替尼。因此，增加對肺正常組織細(xì)胞的毒性評價顯得尤為重要，也是未來的肺癌藥敏試驗個體化治療需要優(yōu)化之處。

綜上所述，患者來源的癌細(xì)胞和癌旁正常細(xì)胞的培養(yǎng)一直以來是世界性的技術(shù)難題。如果能建立個體的肺原代上皮細(xì)胞和肺原代腫瘤細(xì)胞的體外長期培養(yǎng)體系，并利用該體系進(jìn)行藥敏檢測，體外預(yù)測患者對常用化療藥物的敏感性和評價藥物的安全性，將為肺癌精準(zhǔn)化療敏感藥物的選擇提供參考，盡可能地減輕毒性和副作用負(fù)擔(dān)，最大限度地延長該肺癌患者的生存時間。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供一種用于人或哺乳動物原代正常上皮細(xì)胞和原代腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基及基于該培養(yǎng)基為肺癌提供穩(wěn)定準(zhǔn)確可靠的離體個體化藥物測試的方法。

本發(fā)明的第一方面，提供一種用于培養(yǎng)人或哺乳動物的原代正常上皮細(xì)胞和原代腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基m，所述培養(yǎng)基m成分包括：dmem與ham’sf-12nutrientmix按體積比3:1混合的培養(yǎng)基，同時添加4-6％胎牛血清、1-3nm三碘甲狀腺氨酸（triiodothyronine）,0.4-0.65％胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒鈉（insulin-transferrin-selenium）、5-20umy-27632、9-11ng/ml表皮生長因子、0.3-0.5μg/ml氫化可的松、0.5-1.5nm霍亂毒素、0.4-0.6μg/ml兩性霉素b、35-45μg/ml慶大霉素，激活素a（activina）5-20ng/ml及3ug/ml重組人r-spondin-1。

本發(fā)明的第二方面，提供一種短期內(nèi)快速增殖的肺癌病人肺上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)的方法，包括如下具體步驟：

a、肺癌和癌旁組織樣本的取材及其樣本儲存運輸

a1、樣本標(biāo)準(zhǔn)：肺癌患者手術(shù)樣本（適宜手術(shù)患者，切除的癌組織及癌旁組織樣品至少1×1×1cm³）或活檢、穿刺小樣本（不適宜手術(shù)患者，纖支鏡或ct引導(dǎo)經(jīng)皮穿刺可獲得的小樣本），涵蓋各臨床分期；

a2、樣本儲存運輸：潔凈室條件下，嚴(yán)格按照無菌操作標(biāo)準(zhǔn)，將手術(shù)樣本或小樣本收集保存于試管中，根據(jù)樣本量大小添加樣本收集液，一般為3-5ml，樣本收集液為含2%青/鏈霉素和100ug/ml制霉菌素的pbs，樣本可用于直接分離培養(yǎng)或長期液氮保存；樣本直接分離培養(yǎng)時可先放置于4℃冰箱，但保存不宜超過48小時；樣本儲存于液氮前，需加入覆蓋樣本體積的冰浴后的pbs緩沖液清洗兩次，每次10秒左右，用無菌鑷子將清洗干凈的樣本放入新培養(yǎng)皿中，用眼科剪剪碎至米粒大小，加入1ml樣本凍存液，移液器轉(zhuǎn)移保存于細(xì)胞凍存管，放入程序降溫盒中，-80℃冰箱過夜冷藏，次日可轉(zhuǎn)移至液氮中長期儲存，所述樣本凍存液為胎牛血清（10099-141，gibco）與二甲基亞砜（dmso，(ch3)2so）溶液按體積比為9:1配制；需要運輸?shù)臉颖驹诮?jīng)過-80℃冰箱過夜冷藏后可放入體積合適的泡沫盒，加入足量的運輸干冰，密封冰凍運輸；

b、對來自于肺癌和癌旁組織樣本的肺上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)：

b1、分離培養(yǎng)前的實驗室準(zhǔn)備：使超凈工作臺處于開機狀態(tài)，并打開紫外燈，工作30-60分鐘后，關(guān)閉紫外燈，打開調(diào)風(fēng)機調(diào)節(jié)風(fēng)量大小，保證工作區(qū)內(nèi)的風(fēng)速始終處于理想狀態(tài)后開始實驗；準(zhǔn)備五個60mm或100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿（伽馬射線消毒滅菌，無熱源、無rna酶、無dna酶），標(biāo)記為①②③④⑤，按照順序擺放，在②號培養(yǎng)皿加入10ml無水乙醇（分析純），③、④號培養(yǎng)皿分別加入冰浴的10mlpbs緩沖液；

b2、配制消化液：所述消化液為含0.2mg/ml膠原酶/透明質(zhì)酸酶混合液的培養(yǎng)基m；

b3、樣本直接分離培養(yǎng)：

b3.1、將樣本放置①號培養(yǎng)皿，依次在②號培養(yǎng)皿無水乙醇和③、④號培養(yǎng)皿pbs緩沖液清洗，然后分別將肺癌和癌旁組織樣本放入⑤號無菌培養(yǎng)皿中，用無菌的眼科剪將組織盡可能剪碎，大小1-2mm³體積為宜，剪碎過程中滴加適量pbs緩沖液維持樣本組織活性；

b3.2、在⑤號無菌培養(yǎng)皿中加入含步驟2.2所配制消化液，分別消化剪碎后的肺癌和癌旁組織樣本；

b3.3、分別將步驟2.3.2處理后的肺癌和癌旁組織樣本低速離心去除上清，速度為1000prm，時長為8分鐘；

b3.4、分別將步驟2.3.3處理后的肺癌和癌旁組織樣本沉淀室溫條件下重懸于2-5ml，濃度為0.25％胰酶/edta中消化；

b3.5、加入于胰酶/edta2倍體積的含10%fbs的dmem培養(yǎng)基終止消化，分別用無菌的一次性塑料槍頭反復(fù)吹打肺癌和癌旁組織樣本，時長為1分鐘；

b3.6、分別用70μm細(xì)胞篩過濾細(xì)胞懸液，收集過濾后的細(xì)胞懸液，1000prm低速離心，時長為10分鐘去除上清；

b3.7、分別重懸步驟2.3.6中的正常細(xì)胞沉淀和腫瘤細(xì)胞沉淀于pbs緩沖液中清洗，收集清洗后的細(xì)胞懸液，1000prm低速離心，時長為5分鐘去除上清；

b3.8、分別重懸步驟b3.7中的正常細(xì)胞沉淀和腫瘤細(xì)胞沉淀于培養(yǎng)基m中，接種于培養(yǎng)瓶培養(yǎng),靜置培養(yǎng)36-48小時后顯微鏡觀察拍照記錄細(xì)胞克隆生長情況；

或者，

b3’、當(dāng)樣本為運輸樣本和液氮儲存樣本時的分離培養(yǎng)

b3’.1、復(fù)蘇時需要在40℃醫(yī)用恒溫水箱中快速溶解，經(jīng)75%醫(yī)用消毒酒精擦拭后生物傳遞窗傳送至細(xì)胞培養(yǎng)室；

b3’.2、取15ml離心管加入適量pbs緩沖溶液，移液器移取溶解后的含樣本的凍存液至離心管中，1000rpm低速離心5分鐘，小心移去含凍存液的上清，并嚴(yán)格執(zhí)行收到新鮮組織樣本的所有實驗操作b3.1-b3.8；

c、建立大量擴增肺癌病人肺原代上皮細(xì)胞和肺原代腫瘤細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：

c1、試劑配制：配備dmem培養(yǎng)基、hbss緩沖溶液、0.25%胰蛋白酶/edta、0.02%edta等，用hbss緩沖溶液與0.25%胰蛋白酶/edta配制成0.05%胰蛋白酶/edta（對細(xì)胞傷害更低的細(xì)胞解離試劑），pbs緩沖溶液與胎牛血清以9:1的體積比配制成10%的消化終止液；

c2、當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的人肺原代上皮細(xì)胞和肺原代腫瘤細(xì)胞增殖至70-90%豐度時，用1xpbs緩沖液洗滌細(xì)胞兩次，再用0.05%胰酶/edta消化單層細(xì)胞2-5分鐘；

c3、含10%fbs的dmem培養(yǎng)基中和消化反應(yīng)，1000prm低速離心3-4分鐘去除上清；

c4、以1:2，1:3，1:4或1:5比例分別重懸正常細(xì)胞沉淀和腫瘤細(xì)胞沉淀于培養(yǎng)基m中接種培養(yǎng)，比例的選擇只要維持細(xì)胞貼壁和正常生長即可。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了上述建立的肺癌病人肺原代上皮細(xì)胞和原代腫瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系在藥物或其聯(lián)用組敏感性篩選的方法，包括如下具體步驟：

s1、當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的人肺原代上皮細(xì)胞和原代腫瘤細(xì)胞處于對數(shù)生長期時，用0.05%胰蛋白酶/edta消化3-5分鐘，消化終止液終止消化，1000rpm低速離心3-5分鐘，分別用培養(yǎng)基m制備成單細(xì)胞懸液，通過臺盼藍(lán)與細(xì)胞懸液1:1混勻細(xì)胞計數(shù)儀檢測細(xì)胞數(shù)量與活力，每孔100μl細(xì)胞懸液接種于96孔板，細(xì)胞數(shù)為6000-8000個/孔，放入37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)；

s2、次日吸去孔內(nèi)溶液加藥（根據(jù)2016年版中國臨床腫瘤學(xué)會(csco)原發(fā)性肺癌診療指南，選擇其中常用的化療藥物或小分子靶向藥物等進(jìn)行處理），每孔加入200μl含不同濃度藥物的培養(yǎng)基；藥物濃度梯度可按照實驗需求設(shè)置，每種藥物的每個梯度設(shè)置5-6個復(fù)孔，同時設(shè)置細(xì)胞對照組（同體積細(xì)胞培養(yǎng)基替代）及空白對照組（同體積pbs緩沖液替代）每組設(shè)置6個復(fù)孔；

s3、根據(jù)實驗需求進(jìn)行一定時間的藥物處理，移去板內(nèi)溶液，每孔加入含有10μlckk-8檢測試劑的無血清dmem培養(yǎng)基100μl，包含各實驗組、對照組和空白組；

s4、在37℃二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育1-1.5小時，孵育時間跟細(xì)胞量的多少相關(guān)，具體時間可根據(jù)液體顏色變化確定，吸光度最大范圍控制在1.0-1.5；

s5、用酶標(biāo)儀在450nm處測定的吸光度；

s6、所有數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計軟件graphpadprism6和calcusyn2進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析和作圖，計算單藥和其聯(lián)用組的半數(shù)抑制濃度、量效關(guān)系方程、回歸系數(shù)、不同抑制率時的劑量濃度，輸出并保存圖形和數(shù)據(jù)。

本發(fā)明的第三方面，提供了上述建立的肺癌病人肺原代上皮細(xì)胞和原代腫瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)的細(xì)胞在藥物或其聯(lián)用組敏感性篩選中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：

1、本發(fā)明建立了基于培養(yǎng)基m的個體的肺原代上皮細(xì)胞和肺原代腫瘤細(xì)胞的體外長期培養(yǎng)體系，并利用該體系進(jìn)行藥敏檢測，獲得了一套完整的技術(shù)流程，實現(xiàn)體外同時預(yù)測患者對常用化療藥物的敏感性和評價藥物的安全性，為肺癌精準(zhǔn)化療敏感藥物的選擇提供參考，最大程度地減輕毒性和副作用負(fù)擔(dān)，最大限度地延長該肺癌患者的生存時間。

2、本發(fā)明建立了個體的肺原代上皮細(xì)胞和肺原代腫瘤細(xì)胞的體外長期培養(yǎng)體系，可以在細(xì)胞水平上再評價已上市藥物的藥效或探索其新的臨床獲益率；

3、作為藥物研發(fā)與測試新系統(tǒng)，通過該系統(tǒng)的開發(fā)和應(yīng)用有可能提高藥物進(jìn)入臨床的有效率。

附圖說明

圖1是建立肺癌個體化治療-藥敏試驗檢測系統(tǒng)的方法流程圖；

圖2是原代分離培養(yǎng)的肺癌病人肺上皮細(xì)胞和肺腫瘤細(xì)胞形態(tài)圖，

a為人肺原代上皮細(xì)胞生長到第3天的形態(tài)圖，b為人肺原代腫瘤細(xì)胞生長到第3天的形態(tài)圖；

圖3是兩周內(nèi)快速擴增的肺癌病人肺原代上皮細(xì)胞和原代腫瘤細(xì)胞形態(tài)圖；

a為人肺原代上皮細(xì)胞生長到第9天的形態(tài)圖，b為人肺原代腫瘤細(xì)胞生長到第12天的形態(tài)圖；

圖4是肺癌病人肺原代上皮細(xì)胞和肺原代腫瘤細(xì)胞的傳代培養(yǎng)的周期及獲得的細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計圖；

圖5是肺癌病人肺原代上皮細(xì)胞和肺原代腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)體系的藥敏檢測結(jié)果。

具體實施方式

通過以下詳細(xì)說明結(jié)合附圖可以進(jìn)一步理解本發(fā)明的特點和優(yōu)點。所提供的實施例僅是對本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。

【實施例1】用于分離培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)人或哺乳動物原代上皮細(xì)胞和原代腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基m

其組成成分包括：dmem與ham’sf-12nutrientmix按體積比3:1混合的培養(yǎng)基，同時添加5％胎牛血清、2nmtriiodothyronine,0.5％insulin-transferrin-selenium試劑、10umy-27632、10ng/ml表皮生長因子、0.4μg/ml氫化可的松、1.0nm霍亂毒素、0.5μg/ml兩性霉素b、40μg/ml慶大霉素，activina10ng/ml及3μg/ml重組人r-spondin-1。

【實施例2】建立肺癌和癌旁組織樣本的取材及其樣本儲存運輸?shù)牟僮鞣椒?/p>

1）在病人和病人監(jiān)護(hù)人知情同意的情況下，本實驗所用的肺癌和癌旁組織樣本均約為1cm³(立方厘米)，取自醫(yī)院手術(shù)切除樣本，該患者的臨床分期為低分化肺腺癌，無其它治療。

2）潔凈室條件下，嚴(yán)格按照無菌操作標(biāo)準(zhǔn)，將手術(shù)樣本收集保存于試管中，根據(jù)樣本量大小添加樣本收集液，一般為3-5ml，樣本收集液為含2%青/鏈霉素和100ug/ml制霉菌素的pbs，由于樣本量尚可，一分為二同時嘗試直接分離培養(yǎng)和長期液氮保存。

3）胎牛血清（10099-141，gibco）與二甲基亞砜（dmso，(ch3)2so）溶液體積比為9:1配制樣本凍存液，保證最優(yōu)凍存和復(fù)蘇的效果。

4）準(zhǔn)備5個60mm無菌細(xì)胞培養(yǎng)皿分別標(biāo)記①②③④⑤，按照順序擺放，①培養(yǎng)皿放入8ml無水乙醇，②、③培養(yǎng)皿各自放入8mlpbs緩沖液。用無菌鑷子取出組織樣本放入①培養(yǎng)皿快速清洗，2秒左右。②、③培養(yǎng)皿快速清洗，每次10秒左右，將清洗干凈的樣本放入④培養(yǎng)皿中，配合眼科剪分成兩小份，一份放入⑤培養(yǎng)皿，另一份直接在④培養(yǎng)皿中，剪碎至米粒大小，加入1ml樣本凍存液，移液器轉(zhuǎn)移保存于細(xì)胞凍存管，放入程序降溫盒中，-80℃冰箱過夜冷藏，次日轉(zhuǎn)移至液氮中長期儲存（如圖1）。

【實施例3】建立短期內(nèi)快速增殖的肺癌病人肺上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)的方法，包括如下具體步驟：

1）進(jìn)行樣本直接分離培養(yǎng)前，使超凈工作臺處于開機狀態(tài)，并打開紫外燈，工作30分鐘后，關(guān)閉紫外燈，打開調(diào)風(fēng)機調(diào)節(jié)風(fēng)量大小，保證工作區(qū)內(nèi)的風(fēng)速始終處于理想狀態(tài)后開始實驗；

2）準(zhǔn)備5個100mm無菌細(xì)胞培養(yǎng)皿分別標(biāo)記為①②③④⑤，按照順序擺放，在②號培養(yǎng)皿加入10ml無水乙醇（分析純，易燃，遠(yuǎn)離火源），③、④號培養(yǎng)皿分別加入冰浴的10mlpbs緩沖液。

3）消化液的配制：含0.2mg/ml膠原酶/透明質(zhì)酸酶（07912，stemcell）(終濃度為1x的混合液)的上述培養(yǎng)基m。根據(jù)組織的大小，加入10倍于樣本體積的消化液的用量。

4）用無菌鑷子將另一份新鮮肺癌組織樣本放入①號培養(yǎng)皿中，再將組織樣本放入②號培養(yǎng)皿中，用無水乙醇快速清洗組織1次，時間為1秒左右。用鑷子將樣本依次分別放入③、④號培養(yǎng)皿中，用pbs緩沖液清洗組織2次，每次10秒左右。

5）將組織樣本放入⑤號培養(yǎng)皿中，用無菌的眼科剪將組織盡可能剪碎，大小1-2mm³體積為宜（剪碎過程中加入適量pbs緩沖液維持樣本組織活性）。

6）移取10ml消化液至⑤號培養(yǎng)皿，輕微晃動培養(yǎng)皿使消化液與剪碎的組織微塊混勻，37℃恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱孵育2小時（孵育過程中取出輕微混勻兩到三次使組織微塊充分得到消化。）

7）將孵育消化后的組織微塊收集至15ml離心管中，1000rpm低速離心8分鐘，小心吸去上清，加入5ml的0.25%胰酶/edta重懸細(xì)胞沉淀，置于二氧化碳培養(yǎng)箱再消化10分鐘。（孵育過程中取出輕微混勻兩到三次使細(xì)胞沉淀充分得到消化。）

8）取出后加入10ml10%fbs的dmem培養(yǎng)基，移液器吹打混勻成細(xì)胞懸液，用70μm細(xì)胞篩過濾細(xì)胞懸液，50ml離心管收集過濾后的細(xì)胞懸液，1000rpm低速離心10分鐘，小心移去上清。

9）加入5ml的pbs緩沖液，移液器吹打混勻，1000rpm低速離心5分鐘，去除上清。

10）細(xì)胞培養(yǎng)瓶先添加適量培養(yǎng)基m，將腫瘤細(xì)胞沉淀重懸于上述原代腫瘤細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基m中，放入37℃恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時后顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況。

11）原代分離培養(yǎng)肺癌旁組織樣本時，重復(fù)以上（2）-（9）操作步驟，細(xì)胞培養(yǎng)瓶先添加適量培養(yǎng)基m，將正常細(xì)胞沉淀重懸于上述原代上皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基m中，放入37℃恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時后顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況并拍照。

12）顯微鏡下觀察到在原代分離培養(yǎng)肺癌和癌旁組織樣本的第3天，可明顯觀察到肺原代上皮細(xì)胞和原代腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞克?。ㄈ鐖D2）。

【實施例4】建立大量擴增肺癌病人肺原代上皮細(xì)胞和肺原代腫瘤細(xì)胞的傳代培養(yǎng)的方法，包括如下具體步驟：

1）配備dmem培養(yǎng)基、hbss緩沖溶液、0.25%胰蛋白酶/edta等，用hbss緩沖溶液與0.25%胰蛋白酶/edta配制成0.05%胰蛋白酶/edta，pbs緩沖溶液與胎牛血清以9:1的體積比配制成10%的消化終止液。

2）顯微鏡下觀察到在肺癌和癌旁組織樣本原代分離培養(yǎng)的第12天和第9天，細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的人肺原代上皮細(xì)胞和肺原代腫瘤細(xì)胞增殖至約90%豐度（如圖3）。

3）用1xpbs緩沖液洗滌細(xì)胞，再用0.05%胰酶/edta消化單層細(xì)胞，消化時長為3分鐘。倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)約有90%的肺原代腫瘤細(xì)胞脫落，加入消化終止液1ml終止消化，移液器吹打混勻并收集細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15ml的離心管中，依次加入4mlpbs緩沖液清洗培養(yǎng)瓶2次，一并轉(zhuǎn)移至該離心管中，室溫1000rpm低速離心4分鐘。

4）以1:2比例重懸腫瘤細(xì)胞沉淀于培養(yǎng)基m中接種培養(yǎng)，維持細(xì)胞貼壁和正常生長。

5）剩余腫瘤細(xì)胞沉淀還可重懸于的細(xì)胞凍存液中儲存于液氮中備用。

6）擴增培養(yǎng)肺原代上皮細(xì)胞時，重復(fù)以上（3）-（5）操作步驟。

同時繪制傳代培養(yǎng)的周期及獲得的細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計圖：人肺原代上皮細(xì)胞和原代腫瘤細(xì)胞在第0天以相同細(xì)胞密度同時接種傳代培養(yǎng)，細(xì)胞密度為4×10⁵個/ml，在第3、7、11天時消化傳代并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。（如圖4）

【實施例5】建立肺癌病人肺原代上皮細(xì)胞和原代腫瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系在藥物或其組合敏感性篩選的的方法，包括如下具體步驟：

1）當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的人肺原代上皮細(xì)胞和原代腫瘤細(xì)胞處于對數(shù)生長期時，用0.05%胰蛋白酶/edta消化3分鐘，消化終止液終止消化，1000rpm低速離心4分鐘，分別用培養(yǎng)基m制備成單細(xì)胞懸液，取出適量單細(xì)胞懸液，臺盼藍(lán)與細(xì)胞懸液1:1混勻細(xì)胞計數(shù)儀檢測細(xì)胞數(shù)量與活力，每孔100μl細(xì)胞懸液接種于96孔板，細(xì)胞數(shù)為6000-8000個/孔，放入37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)；

2）次日吸去孔內(nèi)溶液加藥，設(shè)置單藥組順鉑、紫杉醇、卡鉑、吉西他濱和聯(lián)用組順鉑+紫杉醇、順鉑+吉西他濱、卡鉑+紫杉醇處理細(xì)胞，每孔加入200μl含不同濃度藥物的培養(yǎng)基m。設(shè)置合理藥物濃度梯度，各個藥物實驗組的各個梯度均設(shè)置6個復(fù)孔，同時設(shè)置細(xì)胞對照組（同體積細(xì)胞培養(yǎng)基m替代）及空白對照組（同體積pbs緩沖液替代）每組設(shè)置6個復(fù)孔。

3）藥物統(tǒng)一處理48小時，移去板內(nèi)溶液，每孔加入含有10μlckk-8檢測試劑（ck04，東仁化學(xué)）的無血清dmem培養(yǎng)基100μl，包含各藥物實驗組、對照組和空白組。

4）在37℃二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育1.5小時，酶標(biāo)儀在450nm處測定的吸光度。

5）所有數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計軟件graphpadprism6和calcusyn2進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析和作圖，輸出并保存圖形和數(shù)據(jù)。

6）結(jié)果分析：由實驗結(jié)果可知，對人肺原代腫瘤細(xì)胞藥效學(xué)為：紫杉醇＞順鉑＞吉西他濱＞卡鉑，但同時對人肺原代上皮細(xì)胞的殺傷作用也較大?？紤]《nccn指南》以鉑為主組合化療的標(biāo)準(zhǔn)方案，嘗試藥物聯(lián)用的藥敏檢測和毒性檢測，順鉑+紫杉醇和順鉑+吉西他濱的組合對對人肺原代上皮細(xì)胞的殺傷作用較大，對該個體而言卡鉑+紫杉醇的組合聯(lián)用效應(yīng)較高，且對人肺原代上皮細(xì)胞傷害較小，可考慮為臨床治療備選方案。（如圖5）